Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Muntlig Biofilm formasjon på ulike materialer for tannimplantater

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å evaluere muntlig biofilm formasjon på Titan og zirconia materialer for dental protese distanser, inkludert analyse av bakterieceller levedyktighet og morfologiske kjennetegn. En i situ modell forbundet med kraftig mikroskopi teknikker brukes for muntlig biofilm analyse.

Abstract

Dental implantater og deres protese komponenter er liggende å bakteriell kolonisering og biofilm formasjon. Bruk av materialer som gir lav mikrobiell vedheft kan redusere utbredelsen og progresjon av peri-implantat sykdommer. I lys av den muntlig miljø kompleksitet og muntlig biofilm heterogeniteten, mikroskopi teknikker er nødvendig som kan aktivere en biofilm analyse av overflater av tenner og fordypning materialer. Denne artikkelen beskriver en rekke protokoller implementert for å sammenligne muntlig biofilm formasjon på Titan og keramiske materialer for protese distanser, i tillegg til metodene involvert i muntlig biofilm analyser på morfologiske og mobilnettet nivå. I situ modellen evaluere muntlig biofilm formasjon på Titan og zirconia materialer for dental protese distanser som beskrevet i denne studien gir en tilfredsstillende bevaring av 48t biofilm, og dermed demonstrere metodologiske tilstrekkelighet. Multiphoton mikroskopi tillater analyse av en området representant for biofilm dannet test materialet. I tillegg tillater bruk av fluorophores og behandling av bildene benytter multiphoton mikroskopi analyse av bakteriell levedyktigheten i en svært heterogen befolkning av mikroorganismer. Utarbeidelse av biologiske prøver for elektronmikroskop fremmer strukturelle bevaring av biofilm, bilder med god oppløsning og noen gjenstander.

Introduction

Bakteriell biofilm er komplekse, funksjonelt og strukturelt organisert mikrobielle samfunn preget av et mangfold av mikrobielle arter som synthesizer en ekstracellulære, biologisk aktive polymer matrise1,2. Bakteriell vedheft biotiske eller abiotiske overflater er foran en formasjon av ervervet pellicle, hovedsakelig bestående av salivary glykoproteiner1,3,4. Svak mekanisk-interaksjoner mellom mikroorganismer og pellicle er først etablert og etterfulgt av sterkere interaksjoner mellom bakteriell adhesins og glykoprotein reseptorer av ervervet pellicle. Mikrobiell mangfold øker gradvis gjennom coaggregation av sekundære kolonistene på reseptorene av allerede vedlagt bakterier, danner en multispecies samfunnet1,3,4, 5.

Homeostase av den muntlige bakterieflora og dens symbiotisk forhold til verten er viktig å opprettholde munnhygiene. Dysbiosis i muntlig biofilm kan øke risikoen for utvikling av karies og periodontal sykdom2,5. Kliniske studier viser en årsak og virkning forholdet mellom akkumulering av biofilm på tenner eller tannimplantater og utvikling av Gingivitt eller peri-implantat mukositt6,7. Utviklingen av inflammatoriske prosessen fører til peri-implantitis og påfølgende tap av implantatet8.

Dental implantater og deres protese komponenter er liggende å bakteriell kolonisering og biofilm formasjon9. Bruk av materialer med kjemiske sammensetning og form som gir lav mikrobiell vedheft kan redusere utbredelsen og progresjon av peri-implantat sykdommer9,10. Titan er den mest brukte materialet for produksjon av protese distanser for implantater; imidlertid keramiske materialer ble nylig introdusert og er stadig mer populært som et alternativ til Titan på grunn av deres estetiske egenskaper og biocompatibility11,12. Også viktigere, har keramiske materialer vært forbundet med en angivelig reduserte potensiell overholder mikroorganismer, hovedsakelig på grunn av deres overflateruhet, wettability og overflate fri energi10,13.

In vitro studier har bidratt til betydelige fremskritt i forståelsen av mikrobielle vedheft til protese distansen overflater9,14,15,16,17. Dynamisk miljøet i munnhulen, preget av sin varierende temperatur og pH og næringsstoffer tilgjengelighet samt tilstedeværelsen av skjær krefter, er imidlertid ikke reproduserbare i vitro eksperimentelle protokoller18, 19. Du løser dette problemet, er et alternativ bruk av i situ modeller av biofilm formasjon, som bevarer advantageously tredimensjonale strukturen for ex vivo analyse10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

Analyse av komplekse strukturen i biofilm dannet på muntlig underlag krever bruk av mikroskopi teknikker kan vise optisk tett saken25. Multiphoton laserskanning mikroskopi er et moderne alternativ for biofilm strukturelle analysen26. Det er preget av bruk av ikke-lineær optikk med en belysning kilde nær infrarød bølgelengde, pulserende til femtoseconds27. Denne metoden er indisert for bilde oppkjøpet av autofluorescence eller materialer preget av fluorophores, i tillegg til bilder generert av ikke-lineær optisk signaler fra et fenomen kjent som andre harmonisk generasjon. Blant fordelene multiphoton mikroskopi er flott bilde dybden med minimum celle skade forårsaket av intensiteten av eksitasjon lys27.

For en levedyktighet analyse av biofilm på abiotiske overflater av multiphoton mikroskopi, bruk av fluorescerende nukleinsyre fargestoffer med forskjellige spektrale egenskapene og gjennomtrenging kapasitet i bakterielle celler er nødvendig28. Fluorophores SYTO9 (grønn-fluorescerende) og propidium iodide (rød-fluorescerende) kan brukes til å visuelt skille mellom levende og døde bakterier28,29,30. Propidium iodide trenger bare bakterier med skadet membraner, mens SYTO9 inn bakterielle celler med en intakt og kompromittert membran. Når begge fargestoffer finnes inne i en celle, propidium iodide har en større affinitet for nucleic syrer og fortrenger SYTO9, markerer den røde28,30.

I lys av den muntlig miljø kompleksitet og muntlig biofilm heterogeniteten, mikroskopi teknikker er nødvendig som kan aktivere biofilm analyse av overflater av tenner og fordypning materialer. Denne artikkelen beskriver en rekke protokoller implementert for å sammenligne muntlig biofilm formasjon på Titan og keramiske materialer for protese distanser, i tillegg til metodene involvert i muntlig biofilm analyser på morfologiske og mobilnettet nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret i School of Dentistry av Ribeirão Preto og frivillige deltakeren undertegnet skriftlig samtykke (prosess 2011.1.371.583).

1. Biofilm formasjonen i Situ

  1. Utvalg av deltakere
    1. Velg pasienter basert på følgende inklusjonskriterier: en frisk person med en komplett dentition og ingen klinisk underskriver av orale tilstander.
    2. Utelate pasienter basert på kriteriene nedenfor eksklusjon: graviditet, amming, tannråte, periodontal sykdom eller antibiotika behandling i de siste 3 månedene, røyker eller systemisk sykdom som kan påvirke periodontal status.
  2. Utarbeidelse av intraoral enhet
    1. Registrere maxillary buen med alginate inntrykk.
    2. Forberede type IV stein ved å legge til 19 mL vann 100 g stein pulver. Hell steinen i alginate mold å lage en modell av maxillary buen.
    3. Design og dikte en akryl intraoral enhet for å støtte prøvene (Titan og keramiske plater).
      1. Dikte retentive spenner fra NiCr wire (0,7 mm i diameter) bruker ortodontiske tang #139 og plasser dem på modellen. For å plassere klemme mellom de øvre premolarer, bøye du én ende av hver ledning slik at de danner en sløyfe.
        1. Tilpasse loopen i regionen i interdental papilla. I den okklusal, setter du en mild krumning for ikke å forstyrre med poeng av kontakt og okklusjon. Gjøre en 90° brett på slutten av klemmen for en oppbevaring i akryl.
        2. Tilpasses klemmen i den øvre andre molar, tilpasse kurvatur av ledningen i cervical tredje (vestibular) å profilere tannen (distale) og gjøre en 90° brett på slutten av klemmen for en oppbevaring i akryl.
          Merk: For å gi tilstrekkelig oppbevaring/stabilitet til intraoral enheten, retentive hekter ble plassert mellom øvre premolarer og distale aspekt av den andre molar på begge sider av dental buen.
      2. Manipulere selv herding akryl harpiks i henhold til produsentens instruksjoner og trykk akryl harpiks mellom 2 glassplater (med en 3 mm tykk spacer interposed) i plast fasen å gjøre en 3 mm tykt ark.
      3. Lå akryl arket på palatal regionen av modellen, ifølge enhetens design og trim av overskytende akryl harpiks med en carver, før polymerisasjon.
      4. Dikte voks disker med en metallisk matrise [10 mm i diameter, 2 mm tykkelse (areal av 78,5 mm2)] ved å plassere flytende voks i matrisen og venter voksen for å stivne. Manuelt legge inn 4 voks disker i akryl harpiks, 2 av dem mellom premolarer og de andre 2 ved det andre jeksel.
      5. La akryl harpiks danner i en presset pott under 20 psi av trykkluft for 20 min.
      6. Fullfør intraoral enheten med en elektrisk dental lab handpiece og cutter og Polen med slipende gummi.
      7. Justere enheten for en passende plass i munnen ved hjelp av utstyr som beskrevet ovenfor.
  3. Forberedelse av de Titan og zirconia
    Merk: Prøver (n = 14) er 10 mm i diameter og 2 mm tykkelse og har et areal på 78,5 mm2.
    1. Polsk prøver overflater med vannkjølt sandpapers av avtagende sliteegenskaper (600, 1200 og 2000 grus), etter ca 20 min.
      Merk: Polering av de ble utført for å standardisere overflateruhet på 0,2 µm.
    2. Rengjøre og desinfisere prøver og intraoral enhet med flytende såpe og vann, og bruk deretter ultralydbad isopropyl alkohol for 15 min. tørke dem med absorberende papirhåndklær.
    3. Fikse de intraoral muntlig enheten med ca 0,1 mL av giftig hot-smelte limet (figur 1).
    4. Installere enheten som inneholder eksemplarer i munnhulen.
      Merk: Intraoral enheten som inneholder de bør brukes for 48 timer. Enheten ble fjernet og lagret i fosfat bufret saltvann (PBS) mens pasienten spiste og utføre orale rengjøring.

2. vurdering av bakteriell levedyktighet

Merk: Utvalg størrelse n = 10.

  1. Forberede en farging løsning ved å legge til 3 µL av SYTO9 (grønn fluorescerende nukleinsyre fargestoff) og 3 µL av propidium iodide (rød fluorescerende nukleinsyre fargestoff) til 1 mL steril destillert vann.
    Merk: Forberede løsninger beskyttet mot lyset.
  2. Overføre de til en 24-vel plate og vask dem med PBS fjerne ikke-tilhenger celler.
  3. Legge til riktige volumet (1 mL) fluorescerende fargestoff løsning å dekke biofilm inneholder prøven. Legge til fargebad veldig forsiktig for ikke for å oppløse biofilm.
  4. Inkuber prøven i 20-30 min ved romtemperatur, beskyttet mot lyset.
  5. Forsiktig vaske biofilm prøven med sterilt destillert vann for å fjerne alle overflødig fargestoff.
  6. Plasser prøven i et glass bunn rett og utføre multiphoton laserskanning mikroskopi for biofilm analyse.
    Merk: Analyse av levedyktighet bakterieceller ble gjennomført med et multiphoton mikroskopi system. Fluorescens av propidium iodide ble oppdaget ved hjelp av et filter med en eksitasjon/utslipp bølgelengden til 546/680 nm og 477/600 nm for SYTO9. Størrelsen på bilder innhentet var 5.16188 x 5.16188 mm, som tilsvarer 26.64 mm2 av det totale området av hver (78,5 mm2) eller 33.94% av det totale området. Bildene ble gjort fra den mest sentrale delen av prøven, med en oppløsning på 1024 x 1024 piksler. Den røde kanalen og grønne kanalen bilder ble analysert separat ved Fiji programvare31. Hver celle ble valgt med et markeringsverktøy, og intensiteten av fluorescensen ble målt gjennom integrert tettheten av bildepunkter, trekke bildebakgrunnen.

3. analyse av prøver kjemiske sammensetning av energi dispersiv spektroskopi (EDS)

Merk: Utvalg størrelse n = 3.

  1. Velg 3 eksemplarer av hvert biofilm-fri testen materiale, og vurdere den kjemiske sammensetningen i 2 ulike områder av hver bruker en scanning elektron mikroskop koplet til en dispersiv energi-spektrometer, med et elektron strålen spenning 10 kV32.

4. morfologisk analyse av den bakterielle Biofilm ved å skanne elektronmikroskop

Merk: Utvalg størrelse n = 1.

  1. Fastsette biofilm ved immersing eksemplarer i 2,5% glutaraldehyde utvannet inne 0.1 M natrium cacodylate buffer, pH 7.0-7.3, 24 h.
  2. Vask prøven i PBS buffer (pH = 7.6).
  3. Postfix biofilm med 1% osmium tetroxide 1t.
  4. Vask prøven i PBS buffer (pH = 7.6).
  5. Tørke biofilm prøvene nøye, holde dem i økende konsentrasjoner av etanol løsninger (50%, 70%, 90%, 95% og 100%).
    Merk: Utføre 3 utveksling av etanol på en 100% konsentrasjon. Det totale dehydrering trinnet tar ca 2 timer.
  6. Overføre de til det kritiske punktet tørketrommel og gjøre flere erstatninger med karbondioksid (CO2) til de er tørre.
  7. Fjern de tørkede prøvene fra apparatet og montere dem på scanning elektron mikroskop innehavere.
  8. Frese-coat en 20 nm lag av gull på prøveoverflaten for 120 s.
  9. Sett inn gull-belagt plater i scanning elektron mikroskop kammeret. Hente bilder fra 5 ulike områder av hver, på 20-30 kV variabel presset og 650 X forstørrelse12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kolonisering tettheten av biofilm etter 48 timer i situ vekst var representert i denne studien av andelen koloniserte området på Titan og zirconia diskene i forhold til totalt skanneområdet på prøven ved hjelp multiphoton mikroskopi ( 26.64 mm2). Figur 2 representerer bakteriell kolonisering tettheten på overflaten av 3 testet materialer. En høyere tetthet av biofilm ble observert på overflater av støpt og maskinert Titan diskene (0.0292 µm2 og 0.0213 µm2, henholdsvis) enn i zirconia diskene (0.0099 µm2; p < 0,05; Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Dunn's test).

Figur 3 viser bakterieceller levedyktighet på overflater av zirconia (figur 3A, 3A', og 3A "), maskinert Titan (figur 3B, 3B', og 3B"), og Titan (Figur 3 c, 3 C' , og 3 C ") disker. I denne protokollen, de nukleinsyre fargestoff propidium iodide trenger bare inn bakterier med en skadet membran og derfor avgir et red-fluorescerende signal som er knyttet til døde celler. SYTO9 trenger bakterieceller med intakt eller utsatt membran og avgir et grønt fluorescerende signal fra levende mikroorganismer. Mobilnettet bakteriell levedyktighet var likt mellom test materialer, med en overvekt av levende mikroorganismer i alle grupper (Figur 4). Live/døde celler proporsjoner var 2.10 for zirconia 1,95 for maskinerte Titan og 1,63 for kastet Titan.

Sprekker, spor eller slitasje defekter produsert på overflaten av alle materialer under av polering og/eller maskinering ble observert, tydeligere i maskinert og kastet Titan disker. Zirconia diskene, ble større områder observert med fravær av mikroorganismer; liten polymorfe mikrobiell aggregater som består hovedsakelig av cocci, bakterier og agar ble også observert (figur 5A og 5A'). Cocci og bakterier var spredt på overflater av maskinerte Titan disker (figur 5B og 5B'). Cast Titan prøver presentert kolonier av mikroorganismer involvert i en matrise med en biofilm utseende på overflaten (figur 5C og 5 C'). Mindre matrix materiale ble observert på overflaten av zirconia diskene sammenlignet maskinert Titan og kastet Titan disker.

EDS analysen avdekket 70.83% av zirconia, 22.84% av oksygen, 4.52% av yttrium og 1.57% av hafnium i zirconia diskene; 95.16% av Titan, 3,99% av oksygen og 0,85% av karbon i støpt Titan diskene; og 89.86% av Titan, 7.53% av oksygen og 2,61% av karbon i maskinert Titan diskene (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Intraoral enheten i i situ studere. Retentive hekter ble laget med utførte wire, og Titan og zirconia test disker (10 mm i diameter, 2 mm tykk) ble tilfeldig plassert i regionene premolarer og jeksel, delvis innebygd i selv-herding akryl harpiks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Fluorescens bilder av bakteriell celle tetthet. Disse er fluorescens bilder av bakteriell celle tetthet på (A) zirconia, (B) maskinert Titan, og (C) kastet Titan disker etter 48 timer i situ. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Cellen levedyktigheten til bakterier overholdt overflater. Disse panelene viser cellen levedyktigheten til bakterier overholdt overflater av (A) døde og leve bakterieceller på zirconia, (B) døde og live bakterieceller maskinert Titan, og (C) døde og leve bakterieceller på støpt Titan diskene avbildet av fluorescens tenkelig. Død bakterielle celler er farget med propidium iodide (A', B', og C': rød-fluorescerende signal). Live bakterier er farget med SYTO9 (A ", B", og C ": grønn fluorescens signal). Paneler A, Bog C viser farge flettede bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Boxplots representerer biofilm celle levedyktighet forskjellige test materialet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Skanning elektronmikroskop. Disse skjermbildene viser skanning elektronmikroskop av (A, A') zirconia, (B, B') maskinert Titan, og (C, C') kastet Titan disker med biofilm, panoramautsikt og nært hold visninger, etter 48 h på stedet . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : En grunnleggende analyse av energi dispersiv spektroskopi (EDS). Disse skjermbildene viser (A) zirconia disker (Zr = zirconia, Y = yttrium, C = karbon, O = oksygen og Hf = hafnium); (B) maskinert Titan, og (C) kastet Titan disker (Ti = Titan, O = oksygen og C = karbon). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet i denne studien ble utviklet for å evaluere biofilm dannelsen på Titan og zirconia materialer i protese distanser, inkludert analyse av bakteriell celle levedyktighet og morfologiske kjennetegn. For å oppnå dette, ble en i situ modell av biofilm formasjon designet, som består av en intraoral enheten i stand til å imøtekomme prøver av testen materiale og holde dem utsatt for dynamisk muntlig miljø for 48 timer. Enheten ble ansett som behagelig og sette inn, fjerne og feilfri av frivillig. Likevel viste liten innvirkning på fonetikk og estetikk, var enkelt og rimelig å dikte og tillatt en enkel gjenoppretting av de uten avbrudd av biofilm. Videre metoden tillatt bevaring av bakterieceller og den ekstracellulære matriks integritet. Kontakt av tungen med de og tap av platen under eksperimentet er begrensninger av den foreslåtte modellen. For å minimere begrensningene for metoden, ble plasseringen av platene i munnhulen enheten tilfeldig fordelt; i tillegg platene ble løst med giftfri hot-smelte limet og uten tap av prøven ble rapportert.

På grunn av den høye heterogeniteten av bakteriell arter bor muntlig miljø, er kraftig mikroskopi teknikker nødvendig for analyse av biofilm kolonisere sine harde flater. Multiphoton mikroskopi gir flere fordeler fremfor konvensjonelle eller AC confocal mikroskopi analyser, som en iboende tredimensjonale oppløsning, en nær-infrarøde eksitasjon for overlegen optisk penetrasjon, en reduksjon av photobleaching og photodamage når imaging lever celler, og en evne til å gi kvantitativ informasjon33,34. Disse fordelene kommer gjennom svært lokaliserte magnetisering av to-fotonet absorpsjon og redusert effekten av lysspredning i de. Derfor kan multiphoton mikroskopi dype vev bildebehandling, minimum celleskader og en innvielse av godt lokaliserte fotokjemi34. Tilfeldig prøvetaking og nummer felt skal velges for nøyaktige analyser35,36. Multiphoton laser skanning mikroskopi tillatt analyse av 5161.88 x 5161.88 µm, tilsvarer 33.94% av den totale prøven. AC confocal mikroskopi ble ikke brukt på grunn av behovet for et stort antall felt for representant analyse og evaluering av de lengre. Videre begrenset ute av fokus bakgrunn signalet bruk av fluorescens mikroskopi. Til tross for fordelene multiphoton mikroskopi er bare noen anvendelser innen mikrobiologisk rapporterte37,38,39. Blant dem er bruken som manipulasjon verktøy; for eksempel for å oppnå lokaliserte ablasjon, cellene apoptose/nekrose, bleking eller photoactivation et veldefinert volum av biofilm26. Et annet program av denne metoden er å evaluere effekten av antibakterielle midler mot flere biofilm komponenter25,40,41.

I denne studien ble levedyktigheten til overholdt bakterieceller evaluert med fluorescerende nukleinsyre fargestoffer, som penetrere celler som en funksjon av sin membran integritet28. SYTO9 fluorophores og propidium iodide ble brukt visuell differensiering mellom levende og døde bakterier. Noen begrensninger på bruk av SYTO9 og propidium iodide er rapportert i litteraturen, for eksempel problemer med SYTO9 stain gram-negative bakterier med en intakt membran fordi den har å krysse to celle membraner i strukturen30, 42. Dermed kan lever celler være undervurdert av en kombinert flekker. Når SYTO9 ikke er fullstendig erstattet av propidium iodide, kan i tillegg gule fluorescens sees stedet for rødt i bakterieceller30,42. En annen begrensning er nedgangen av SYTO9 over tid. Det anbefales at mikroskopi analyser utføres innen 30 min etter eksponering fargestoffer29,30. Det er nødvendig å vurdere bakgrunn fluorescens beregne signal intensiteten, siden autofluorescence av underlaget og tilstedeværelsen av ubundet fargestoff kan påvirke resultatene30. Likevel, siden disse begrensningene er også rapportert, er det mulig å ha prøvene behandlet innen den angitte tidsrammen, samt nøye velge og trekke bilder bakgrunn med hjelp av Fiji programvaren.

Høy vakuum og electron bestråling under skanning elektronmikroskop representerer ugunstige forhold for prøver som inneholder biologisk materiale. I tillegg til ikke-ledende egenskaper, er biofilm i sin naturlige tilstand hydrert, som forstyrrer den elektron generasjon og oppdagelsen systemet, forming gjenstander43. Derfor må prøver som inneholder biologisk materiale være forberedt for å sikre bevaring av strukturen og gjennomføring av deres elektroner43,44. Protokollen faser som involverer fiksering, dehydrering, ble tørking og belegg av prøver med ledende materiale utviklet med spesiell oppmerksomhet til fortynninger og tid. Fiksering av biologisk materiale ble utført med en aldehyd i en cacodylate buffer og etter fiksering med osmium tetroxide, for å bevare strukturen i overholdt biofilm43,45,46. Dehydrering ble oppnådd med en stigende serie med etanol konsentrasjoner, med vann blir gradvis erstattet av den organiske løsemidler44. Tørke med en minimal forvrengning av biofilm arkitekturen ble gjort gjennom det kritiske punktet med påfølgende erstatninger av flytende CO2 etanol fjerning, etterfulgt av en konvertering av CO2 til gassfase, en fjerning av væske / gass grensesnitt og eliminering av overflatespenning på prøven43,44,45,46. For å sikre ledningsevne elektroner, forhindre eller redusere skade og bilde gjenstander, de ble belagt med et 10-20 nm lag av gull eller gull/palladium. I tillegg kan belegg prøver med et tynt lag av metall redusere elektrisk ladning oppbygging i en prøve, forbedre kontrast og øke bildet oppløsning46.

Noen begrensninger var i situ modellen beskrevet i denne studien tilstrekkelig for vurdering av muntlig biofilm formasjon på Titan og zirconia materialer, bevare 48t biofilm. Bruk av fluorophores tilknyttet bildebehandling ved multiphoton mikroskopi tillatt analyse av levedyktighet bakteriell celle i en svært heterogen befolkning av mikroorganismer kolonisere test materialer. Teknikkene ansatt i utarbeidelsen av biologiske prøver forfremmet til biofilm strukturelle bevaring og oppkjøpet av høy kvalitet bilder for visualisering og morfologiske karakterisering av de koloniserende mikroorganismer .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker José Augusto Maulin fra mikroskopi flerbruker Laboratory (School of Medicine i Ribeirão Preto) for hans hjelp med EDS og SEM analyser og Hermano Teixeira Machado for sin generøse kundestøtte i video-utgaven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

Tags

Medisin problemet 136 mikrobiologi biofilm bakterier mikrobiell levedyktighet mikroskopi multiphoton skanning elektronmikroskop energi dispersiv X-ray spektroskopi klinisk vurdering Odontologisk materiale zirconia Titan
Muntlig Biofilm formasjon på ulike materialer for tannimplantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. S. O., Freitas, A. R.,… More

Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter