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Bioengineering

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

Abstract

심장 영향 심장 개발, 특히 trabeculation, 심근에서 분기 outgrowths의 네트워크를 형성 하 여 경험 hemodynamic 세력. 캐스케이드 왼쪽 심 실 비 압축 심근 또는 Hypoplastic 좌 심 혼 증후군 같은 심 실 결함에 관련 된 신호 단계에서 결함을 유전 프로그램. 이 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 확인할 수 있습니다 전단 응력 중심 trabeculation 및 노치 신호 서로 관련. 빛-시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, 개발 zebrafish 심장의 시각화 가능 했다. 이 원고에서 그것은 평가 되었다 hemodynamic 세력 노치 신호를 통해 trabeculation의 개시를 변조 하 고 따라서, 수축 성 기능에 영향을 미칠 여부를 발생 합니다. 정성 및 정량에 대 한 전단 응력 해석, 4 차원 (3-D + 시간) 이미지 zebrafish 심장 morphogenesis 동안 인수 했다 그리고 4 차원 동기화 통합된 빛 시트 형광 현미경 검사 법 심 실 모션 캡처. 혈액 점도 gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) 마이크로-주입 함으로써, 전단 응력을 감소를 통해 다운 조절 노치 신호 및 trabeculation 약하게 감소 되었다. Gata1a 모와 Nrg1 mRNA의 공동 주입 노치 관련 유전자 trabeculation를 복구를 구출. 노치 신호를 구동 하는 전단 응력 영향 trabeculation 것인지 cardiomyocyte 수축 더 tnnt2a을 통해 체포 됐다-모, hemodynamic 세력을 줄이기 위해 비-trabeculated 개발 하 노치 대상 유전자 다운 규제 심근입니다. 마지막으로, 전단 응력 응답 노치 유전자의 표현 패턴의 확증 타악기 흐름에 내 피 세포를 쓰는 하 여 실시 했다. 따라서, 4 차원 빛 시트 현미경 기본 노치 신호 및 trabeculation 비 압축 심근에 임상 관련성 hemodynamic 세력 적발.

Introduction

Biomechanical 세력, hemodynamic 전단 응력, 같은 심장 morphogenesis에서 친밀 하 게 포함 된다. Hemodynamic 전단 세력에 대 한 응답, 심근 능선과 홈 개발 전단 응력의 방향으로 정렬에 파도 같은 배수 네트워크에 걸쳐 것 (AV) 밸브1. Trabeculation 심장 수축 기능 및 심근 질량2증가 필요가 있다. 노치 신호 통로에서 돌연변이 인간과 다른 척추 동물3에서 선 천 성 심장 결함 발생. 예를 들어, gata1a4 , tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) erythropoietin (EPO) mRNA6 및 Isoproterenol (ISO)7 증가 빨간 혈액 적혈구를 줄이기 위해 표시 되었습니다 있다 세포와 심장 박동 각각, 그리고 그러므로 전단 응력 (WSS) 벽. 또한, ErbB2 신호, 하류, 노치의 cardiomyocyte 확산 및 차례 차례로 활성화 노치 신호8,9수축 성 힘을 생성 하는 차별화를 촉진. 노치 신호 심 실 개발에 대 한 제어 trabeculation를 지배 하는 그 전단 응력이 좋습니다. 현재, 추가 선 천 성 심장 결함 (CHD)10,,1112, 선도 유전자 프로그래밍 이벤트를 이해 하려고 많은 연구 하지만 거의 조사 하는 방법 기계적인 힘 영향 형성 심장.

기계적인 힘 조사 연기 endocardium, 발달 기간 동안 가까운 관측에 구현 해야 합니다. 그러나, vivo에서 박동 때문에 전통적인 현미경 검사 법13의 판매세 샘플의 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해 도전 이다. 샘플 내에서 시간이 지남에 개발을 관찰 하기 위해 실제 단면 및 얼룩, 따라서 필요가 발생 하는13,,1415. Confocal 현미경 검사 법은 널리 샘플14,16의 3 차원 구조를 이미지 하는 데 사용 됩니다, 비록 이러한 이미징 시스템이 인수는 여전히 느린 검색 속도 의해 제한 됩니다.

빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)은 긴 작동 거리13동적 이벤트 vivo에서 의 시각화 수 있도록 독특한 이미징 기술입니다. 이 기술은 빛 시트 형광 현미경을 사용 하 여 광학 샘플17섹션. 샘플에 빛의 단지 얇은 시트의 조명으로 인해 사진 표백 및 사진 독성13,18에 감소가입니다. 보기 및 긴 작동 거리의 큰 분야 대형 샘플 이미지13,,1417은 그대로 남아 있습니다. 낮은 확대 긴 동안 이미지를 더 큰 영역에 대 한 허용 작업 거리 신호 대 잡음 비율을 타협 하지 않고 이미지를 두꺼운 샘플에 대 한 수 있습니다. 많은 그룹 이미지 전체 배아17LSFM 사용,14,18, 근육 및 심 혼19 다른 조직 중 몇 군데 수 샘플의 다양 한 종류를 보여주는 두뇌.

이전 연구 zebrafish 심장의 유입 또는 유출 트랙 경색으로 감소 hemodynamic 전단 힘 설명, 정보는 전적으로 질적. 그것은 결과 비정상적인 3 챔버, 저하 심장 루핑, 장애인된 밸브 대형20. 4 차원 LSFM 이미지 hemodynamic 전단 세력에 영향을 미칠 방법으로 심장 조직 개발 새로운 관점 제공 합니다. 이러한 기계적인 힘 힘 민감한 신호 분자를 활성화 하 고 배수 능선의 형성을 유발 수 있습니다. 4 차원 영상의 추가 시간 측면 때문에 하나는 개발 이전 주목 했다 새로운 폭로 이어질 수 있는 실시간으로 변경 내용을 추적할 수 있다. Zebrafish는 과학자만 세포 세포 상호 작용에 대 한 전체 척추 동물을 관찰할 수 있기 때문에 이미지에 대 한 이상적인 모델입니다. 산소 또한 포유류 개발에서와 달리 혈관 시스템에 따라 하지 않고 발생 하는 개발을 수 있는 전체 태아 통해 무마 수 있습니다. Zebrafish 심장 필요 4 연 발 심장, 폐 장기 부족 하더라도 심장 유전자가 zebrafish와 인간21사이 보존의 큰 숫자가입니다.

이 원고에 우리는 다양 한 상황에서 zebrafish 마음에 개발 trabeculae 이미지를 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 주입 gata1a4 또는 tnnt2a5 의 모스 낮은 혈액 점성을 따라서 WSS 사용 되었다. 심장의 형태학 다음 기록 했다. 물고기의 별도 그룹에서 우리 EPO mRNA6 또는 isoproterenol7 을 투여 하 여 WSS를 증가 하 고 결과 관찰 했다. 우리는 또한 다른 타악기 또는 진동 흐름 율을 가진 셀 연구를 실시. 후 각 그룹 이미징, 우리 발견 WSS 노치 통해 endocardium에 의해 감지 신호 시작 trabeculation.

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Protocol

우 타와 UCLA IACUC 프로토콜에 따라 다음 방법은 수행 했다. 이러한 실험적인 그룹 유전자 변형 Tg(cmlc2:gfp)와 함께 사용 되었다 wea (약한 아 트리 움) 나 clo (접속이) 돌연변이: (a) 야생-타입 (WT) 제어, (b) gata1a 미주리, 및 (c) tnnt2a 모 주사 (표 1).

모델 이름 수정 된 유전자 표현 형 참조
제어 야생 타입 없음 N/A
Tg(cmlc2:gfp) 심장 myosin 빛 사슬 심근에서 구체적으로 표현 하는 그린 flourescence 34
감소 벽 전단 응력 약한 아 트리 움 (wea) 돌연변이 아 트리 움 전용 myosin heacy 체인 아 트리 움 계약 수, 심, 두꺼운 심근 벽, 좁은 루멘, dialated 아 트리 움, 소형 37
접속이 (clo) 돌연변이 N/A Endocardium, 작은 심 실, 존재 하지 않는 심장 cushins unaturally 큰 아 트리 움의 완전 한 제거 41
gata1a 모 gata1a  적혈구의 부족으로 빈 혈 4
tnnt2a 모 tnnt2a 39
증가 벽 전단 응력 EPO mRNA 없음 심한 존슨, 혈액 세포, 순환의 증가 점도 증가 6
Isoprotenerol 없음 심장 박동 증가 7

표 1: 제 브라 대 한 설명입니다. 정의 하 고 실험에 사용 된 Zebrafish의 설명입니다.

1. 연구 설치

  1. Trabeculation 구조에 대 한 Nrg1 및 EPO mRNA를 준비 합니다.
    1. 인간의 Nrg1 cDNA를 기증자 플라스 미드에서 증폭.
      참고: 인간의 Nrg1 cDNA는 스탠포드 대학에서 윌리엄 Talbot에서 재능 했다.
      1. 필요한 시 약 및 재료, 즉 PCR mastermix (-20 ° C에 저장), 뇌관 (참조 표 2) (-20 ° C에 저장)는 PCR 플레이트 (실내 온도에 저장), 그리고 20 μ 피 펫 (실내 온도에 저장)을 꺼내. 예를 들어 제품에 대 한 자료의 표 를 참조.
        Table 2
        표 2: 인간 Nrg1 복제를 위한 뇌관.
      2. mastermix triplicate 20 μ 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 각 뇌관을 위한 준비. Triplicates의 1 세트는 mastermix의 37.5 μ, DNA 무료 물 3 μ, 뇌관의 4.5 μ를 사용 하 여. 더 많은 triplicates에 대 한 샘플의 수로 곱하면 단순히.
      3. 샘플 당 잘 당 총 10 μ 있다 그래야 DNA 무료 물 뇌관 지구에서 작업 솔루션 인간 Nrg1 cDNA (20 ng/μ g 농도)을 희석.
        참고: 각 솔루션 단계 1.1.1 고르게 분포 되어 있는지 확인 합니다. 아래로 pipetting으로 각 솔루션을 혼합 하 여 이렇게 합니다. 교차 오염을 방지 하기 위해, 하나의 샘플에 대 한 하나의 피 펫 팁을 사용 합니다.
      4. 약 수 10 μ 다중 채널 피 펫 PCR 접시에 원하는 웰 스와 Nrg1 cDNA.
      5. 우물에서 cDNA를는 mastermix의 14.5 μ를 추가 합니다. 웰 스, 밀봉 하 고 PCR 기계를 PCR 접시에 스티커 덮개를 적용 합니다.
      6. PCR 기계를 시작 하 고 주기 효소와 뇌관 사용에 따라 적절 한 온도 도달 하면 확인 합니다.
    2. 플라스 미드 pCS2에 Nrg1 cDNA를 클론+ 사용 하 여 초과 효소 BamHI 및 EcoRI cDNA 모든 플라스 미드에 출혈 BamHI EcoRI 사이트에서.
      1. 기증자와 플라스 미드 pCS2 Nrg1 cDNA를 믹스+, 상용 마스터 혼합 솔루션 및 뇌관 (표 2).
        참고: 총 반응 볼륨 마스터 믹스, 뇌관의 3 μ와 Nrg1 cDNA와 20 ng/μ 기증자 플라스 미드의 1 μ의 25 μ와 50 μ 이어야 한다.
      2. PCR 기계에 단계 1.1.2.1에서에서 믹스 하 고 다음 사양을 충족 시키기 위해 매개 변수를 설정: 98 ° C 10 s 5 또는 15 s, 55 ° C, 5 s/kb에 대 한 72 ° C.
      3. 제조업체의 지침에 따라 정화 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화. 차입 버퍼의 50 μ로 제품을 elute.
      4. 순화 된 PCR 제품 및 pCS2의 5 μ g 소화+ BamHI와 200 μ 반응 볼륨에서 2 h 동안 37 ° C에서 별도로 EcoRI. 상업적인 장비로 결과 소화를 정화 하 고 각각 20 μ에 Tris HCl (pH 8.5)의 100 μ elute.
      5. Nrg1 cDNA의 4 μ와 소화 pCS2의 2 μ 선+ 25 μ 반응에 1 μ와 16 ° C에 리가 촉매의 하룻밤 플라스 미드.
        참고: 절차 야간 보육에 대 한 여기 중지 될 수 있습니다.
      6. 1.1.2.5 단계에서 결 찰 솔루션 및 변환의 2 μ를 사용 하 여 복제 ( 재료의 표참조)에 대 한 적합 한 대장균 박테리아 세포의 50 μ로.
    3. 확인 변환 Nrg1 cDNA 클론 PCR를 사용 하 여 심사에 의해 일어났다. 클론을 무작위로 선택한 특정 뇌관, 중 합 효소, 및 deoxyribonucleotide 된 (dNTPs)의 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 컨트롤 했다 벡터 (pCS2+)와 삽입 (인간 cDNA) 없이. 선택 하지 너무 큰 식민지의 과도 한 박테리아 PCR을 억제할 수 있는 때문에.
      1. 변환 및 화면 pCS2에서 8 식민지를 선택+-Nrg1는 표 2에서 PCR 뇌관을 사용 하 여 복제.
      2. 한 복제는 pCS2을 Nrg1 cDNA와 문화+-Nrg1 플라스 미드 DNA. PCS2와 대장균 박테리아의 100 μ와 접종+-파운드 미디어와 문화 (160-225 RPM) 37 ° c.에 떨고 하 여 100 mL로 플라스 미드 Nrg1
    4. Transfect 순화 pCS2+-HEK 293으로 플라스 미드 Nrg1 제조업체의 지침에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 6 잘 플레이트 세포.
    5. transfection, 후 24 h lyse 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 SDS 페이지 젤을 통해 실행, 젤 막에 전송 하 고 안티-Nrg1 항 체22얼룩. Nrg1 단백질 표정을 서쪽 오 점 사용 하 여 확인 합니다.
      참고: 컨트롤은 빈 pCS2+ 플라스 미드. 수 수 일시 중지 여기 젤 막 전송 하룻밤 발생 하는 경우.
    6. 테이블의 재료 에서 비슷한 상용 제품을 사용 하 여 Nrg1 mRNA를 합성 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
      1. 받아 5 μ는 pCS2의+-플라스 미드를 선형화를 37 ° C에서 2 시간 200 μ 반응에서 노트와 고립 된 박테리아 문화 다이제스트에서 Nrg1 DNA.
      2. 상업적인 장비로 선형화 플라스 미드 정화 하 고 Tris HCl (pH 8.5)의 20 μ에 elute.
      3. 제조업체의 지침에 따라 선형화 플라스 미드의 5 μ를 사용 하 여 20 μ 반응에 상업적인 RNA 격리 키트와 함께 녹음 방송 생체 외에서 실시 합니다.
      4. 생체 외에서 베 꼈 다 Nrg1 RNA 세포의 용 해 버퍼의 350 μ를 추가 하 고 RNA 격리 키트 정화. Tris HCl (pH 8.5)의 60 μ에 RNA을 elute.
      5. RNA 농도 측정 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 저장.
    7. 따라 단계 1.1.6.1- EPO cDNA 및 mRNA 준비 하지만 클론 EcoRI와 XhoI pCS2 + 플라스 미드에 cDNA 대신 사이트에 대 한 위의 1.1.6.5.
  2. Zebrafish Morpholino 주입
    1. 23 개월 주사 gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) 및 tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3) ATG 시퀀스에 대 한 온라인 도구 (테이블의 재료)를 사용 하 여 디자인 합니다.
    2. 8 ng/nL와 4 ng/nL의 최종 농도 각각 있도록 nuclease 무료 물에 gata1a 및 tnnt2a 모 별도로 추가 합니다. 20 세/nL의 최종 농도와 EPO mRNA와 반복. 마지막 볼륨 1 mL 인지 확인 합니다.
    3. 1 주사 nL 8 gata1a 모의 nL와 1의 심 실 벽 전단 응력 (WSS)24를 줄이기 위해 4 tnnt2a 모 4 셀 단계 1에서 별도 zebrafish 태아로의 nL의 nL. WSS를 증가 하기 위하여 주사 1 1-4 세포 단계에서 zebrafish 태아에 EPO mRNA6 의 20 세/nL의 nL.
  3. 제 브라 trabeculation를 억제 하기 위해 화학적 치료
    1. 30 5 μ M의 최종 농도에 E3 매체에 1 %DMSO 10 mg/mL AG1478 희석 20 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 관으로 hpf. 컨트롤, 각 물고기 1 %DMSO을 처리 합니다.
    2. 1 %DMSO N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-부 틸 에스테 르 (DAPT) 추가 (100 μ M) 40에서 노치 신호를 억제 하기 위해 15 mL 튜브에 E3 매체 hpf 비슷한 방식. 컨트롤로 1 %DMSO 치료.

2. 이미징 기술

  1. 4 차원 심장 LSFM 이미징 동기화 알고리즘
    1. 여러 심장 박동 주기 (그림 1) 아래 단계를 사용 하 여 전체 물고기 태아의 2 차원 이미지를 인계. 빛-시트 두께 약 5 μ m 인지 확인 합니다. 나이 키스 트 샘플링 원리25에 따르면 무손실 디지털 샘플링에 대 한 1 μ m 500 x-y 프레임 10 양 세트 z 검색의 노출 시간을 가져가 라.
      1. 100 ml agarose의 1 g을 추가 하 고 모든 agarose 해산 때까지 열 하 여 1% (w/v) agarose 젤을 만듭니다. 배아와 agarose 20 μ 피 펫을 사용 하 여 작은 플라스틱 튜브를 로드 하 고는 무대에 그것을 확보.
      2. 이미지 보기 소프트웨어 열고 라이브 샘플의 라이브 뷰를 보려면 클릭 합니다. 목표는 샘플 초점에서 손잡이 사용 하 여 조정 합니다. 마찬가지로, 샘플의 라이브 뷰 태아의 맨 위에 표시 되도록 스테이지를 이동 합니다.
      3. 5에 대 한 500 번 이미지에서 10 배 확대 현미경의 소프트웨어26를 사용 하 여 s.
      4. 새 레이어 (z 축에서 1 μ m)에 모터를 사용 하 여 스테이지를 이동 하 고 이미징 절차를 반복 합니다.
      5. 전체 심장 군데 완전히 될 때까지 위의 2 단계를 반복 합니다.
    2. 첫 번째 및 마지막 심장 주기 이미지를 무시 하 여 데이터 무결성을 확인 합니다. 심장 주기, 하지만 다른 기간에 같은 시간 지점에서 찍은 이미지를 일치 하 여 심장 주기의 기간을 찾아. 기간을 찾기 위해 개발 되었다 다음 식을 사용 하 여:
      Equation 1(1)
      D 기간 가설 피팅 사용 비용 함수는 나m 캡처된 이미지 τ' 이미지가 캡처된 시간 zk 이미지의 z 방향 인덱스, xm 는 픽셀 인덱스의 벡터와 T' 정기 가설입니다.
    3. 다음 방정식을 사용 하 여 유사한 단계에 두 사진 사이의 상대 shift를 찾을.
      Equation 2(2)
      여기서 Qk', k 나타냅니다 상대적 변화, R 에 대 한 비용 함수는 가능한 공간 이웃 L 이미지 캡처의 총 시간, x 는 픽셀 인덱스, zk 및 zk' 첫 번째 및 두 번째 z-방향으로 분할 영역, 이며, t 는 시간, s 는 상대 shift 가설.
    4. 첫 번째 이미지에 대해 절대 변화에 상대 shift를 변환 하 고 앞에서 설명한27이미지의 다음 섹션을 정렬 하려면 절대 관계를 찾으려고 의사 역 접근을 사용 하 여 선형 방정식을 해결.
    5. 마지막 4 차원 이미지 이미지 프로세싱 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 처리 되었습니다.
      1. 3 차원으로 2 차원 이미지를 스태킹
        1. 상업 이미지 프로세싱 소프트웨어를 엽니다.
        2. 오픈 데이터를 클릭 합니다.
        3. 모든 이미지를 3 차원으로 쌓을 수 선택 > 클릭 부하.
        4. 0.65 x 0.65 x 1의 복 크기에 추가 > 확인을 클릭 합니다.
        5. 3 차원 이미지를 시각화에 Multi-Planar 보기 상자를 클릭 합니다.
        6. 블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 > 디스플레이 선택 > Volren를 선택 합니다.
        7. 편집 을 클릭 > 옵션 > 편집 색상표선택.
        8. 빨간색으로 설명 된 상자를 사용 하 여 색상 조정 > 확인을 클릭 합니다.
      2. 4 차원 3 차원 변환
        1. 클릭 "파일 > 시계열 데이터를 엽니다.
        2. 그냥 만들어진 3 차원 tiffs 선택 > 클릭 부하.
        3. 앞으로 동일한 복 크기를 입력 합니다.
        4. 블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 > "디스플레이"를 선택 > Volren를 선택 합니다.
        5. 편집 을 클릭 > 옵션 > 편집 색상표선택. 상자를 사용 하 여 색상 조정 > 확인을 클릭 합니다.
        6. 시간 시리즈 컨트롤 마우스 오른쪽 클릭 > Movie maker 를 클릭 > 영화를 시청 하려면 재생 단추를 누릅니다.
        7. 추가 파일 이름, 프레임 크기, 프레임 속도, 품질 1, 평면 입력 > 클릭 적용
        8. 비디오를 내보냅니다. 적절 한 소프트웨어에서 비디오를 엽니다.

3. qRT-PCR 분석

  1. Zebrafish 노치 ligands, 수용 체, 계량 RNA 격리 마음과 대상 유전자의 식
    1. Tricaine methylate,2829의 과다 복용에 그들을 쓰는 하 여는 제 브라를 희생. 앞에서 설명한 프로토콜30을 사용 하 여, zebrafish 마음 excised 했다 고 RNA 격리에 대 한 준비.
    2. 총 RNA를 분리 하 고 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 cDNA를 합성.
    3. PCR 뇌관 디자인 노치 ligands Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b, 수용 체 및 신호 관련 유전자 Nrg1 및 ErbB2. 우리가 사용 하는 뇌관 표 3을 참조 하십시오.
    4. 단계의 3.1.3 뇌관, 단계의 3.1.2, 고립 된 mRNA와 상업 mastermix PCR 접시에 추가 합니다. 적절 한 온도 시간에 따라 사용 하는 효소에서 qRT-PCR을 실행 합니다. 정상화 zebrafish α-걸을 결과.
      참고: 이 ligands, 수용 체, 그리고 유전자의 각 식 레벨을 계산 합니다.

4. 인간의 대동맥 내 피 세포 (항구적) 실험 체 외에

  1. 동적 전단 응력 모델
    1. 항구적 문화 미디어와 문화 항구적 셀입니다. 일단 완전히 confluent 층 류 및 23 x 10-5 N 24 h에 대 한 1의 속도 타악기 흐름 셀을 표시 합니다.
      1. EC를 따뜻한 미디어/DMEM 10 %FBS 물에 20 분 목욕.
      2. 액체 질소 탱크에서 항구적 셀을 검색 하 고 녹을 때까지 물 목욕으로 유리병을 놓습니다.
      3. 1000 μ 피 펫을 사용 하 여, 해 동된 세포를 제거 하 고 미디어의 3-5 mL 15 mL 튜브에 넣어. 3 분 53 x g에서 셀 솔루션 원심
      4. 오프 솔루션을 발음 하 고 10 ml 전체 볼륨에 대 한 충분 한 미디어를 추가 합니다. 살 균 T75 플라스 크에 셀 솔루션을 추가 하 고 플라스 크, 뚜껑 접시의 바닥에 균등 하 게 세포를 배포.
      5. 이니셜, 날짜, 셀 형식 및 통로 수 플라스 크를 표시 합니다. 세포가 80% 합칠 때까지 37 ° c, 5% CO2, 플라스 크를 품 어. 미디어 2-3 일 마다 변경 하도록 하십시오.
      6. 상업적인 펌프를 사용 하 여 플라스 크에 튜브를 부착 하 고 단계 4.1.131,,3233위에서 언급 한 매개 변수를 설정.
    2. 30 분 동안 5 μ M의 최종 농도에 항구적 매체의 50 mL에 GI254023X를 추가 합니다.
    3. 미리 혼합된 GI254023X 노치 신호, 억제 ADAM10 억제제 같은 층 류 또는 4.1.1에서 타악기 흐름 실험 수행 합니다.
    4. 노치 ligands (Jag1, Jag2, 및 Dll4) 및 노치 대상 유전자 정량 (털이 및 분할 [그]의 증강) qRT-PCR를 사용 하 여 항구적 샘플 (층 류, 층 류 + GI254023X, 타악기 흐름의 4 개 그룹에 대 한 타악기 흐름 + GI254023X) 기술 이전32.

5. 구조 및 오버 표현의 노치 신호

  1. 1 주사 gata1a overexpress 노치 대상 유전자24위해 모와 함께 1-4 세포 단계에서 (단계 1.1.6)에서 5 pg/nL의 농도에 준비 Nrg1 mRNA의 nL.
  2. 1 주사는 비슷한 방법으로24에 wea 돌연변이로 Nrg1 mRNA의 nL.
  3. 두 배 Nrg1 mRNA의 농도 (10 세/nL)24 1 주사와 심 실 형태학 관찰 zebrafish에 nL.
  4. 1 주사 조 심 실 WSS 이전24표시 된 증가 증가 시키기 위해 1-4 세포 단계에서 zebrafish 태아에 EPO mRNA6 의 20 세/nL의 nL.
  5. 1 주사는 50 μ M Isoproterenol7, 수축, zebrafish 하면서 24 h에 대 한 E3 매체의 속도 증가의 nL 이전 표시24교양.
  6. 각 그룹에 대 한 4 D LSFM 이미지를 수행 합니다. 2.1.1-2.1.5.2.8 단계에서에서 지침을 따릅니다.

6. 시간이 지남에 소수 단축 및 볼륨 변경의 정량화

  1. 50, 75, 100에서 각 그룹에 대 한 4 D LSFM 이미징 수행 hpf. 2.1.1-2.1.5.2.8 단계에서에서 지침을 따릅니다. 그래서 각 심장 벽 모션의 복제에 대 한 600 노드는 각 이미지를 나눕니다.
  2. 심장 및 다음 수식을 사용 하 여 systole는 심 실 직경의 변화를 측정:
    Equation 3(3)
    모든 0.1에서 3 차원 심 실 이미지 로드 시각화 소프트웨어와 측정 볼륨 s.
  3. 75에서 각 실험적인 그룹에 대 한 시간이 지남에 볼륨 변경 플롯 hpf와 100 hpf.

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Representative Results

LSFM은 고해상도 2 차원 및 3 차원 사진을 얻기 위해서는이 원고에 사용 되었다. 그림 1A 및 1B에서 보듯이 조명 렌즈 빛 시트 샘플에 지시 합니다. 빛 시트의 두께, 때문에 단일 평면 조명 이다. 감지 렌즈 조명 렌즈에 수직으로 위치 이며 조명된 평면 (그림 1B)에 초점을 맞추고. 조명 렌즈에서 빛 시트 다음 왼쪽에서 오른쪽 (그림 1C) 샘플을 검색합니다. 스캔 덜 사진-표백, 사진-독성, 허용 하 고 더 낮은 신호 대 잡음 비율.

LSFM 빠른 스캐닝 (> 30 s) 복 셀 해상도 0.65 x 0.65 x 1 µ m입니다. 단일 평면 조명 때문에 의해34 전체 심장 구조 시각화 하기 위해 Tg(cmlc2a:gfp) 배아에 적용 된, 배경 잡음은 크게 감소 (그림 1). 75에서 심 실 루멘으로 배수 능선 protruded hpf, 그리고 배수 네트워크 명확 하 게 표시 했다 100 hpf (그림 2A, B). Gata1a 모 마이크로 주입 904,35조 고 점도 감소. 이 줄어든된 점도 감쇠는 지연된 개시 및 75에 배수 네트워크의 밀도 결과 hemodynamic 전단 응력, hpf와 100 hpf 제어 그룹 (그림 2 C, D)에 비해. 또한, 단계에서 (Dll4, Jag1및 Jag2), 수용 체 ligands (Notch1b), 그리고 하류 신호 구성 요소 (Nrg1 및 ErbB2) gata1a 모에 대 한 응답에서 아래로 통제 했다 주입 (p < 0.05, n = 5) (그림 2 K)2,,836. Gata1a 모 Nrg1 mRNA 위로 노치 신호 관련 유전자 발현 및 배수 구조 형성의 5 μ M와 75에서의 공동 주입 hpf와 100 hpf (그림 2E, F, K). 따라서, gata1a 모 Nrg1 mRNA 위로 노치 관련 유전자를 구출 하는 반면 노치 신호, 다운-레 귤 레이 션을 이끌어 hemodynamic 세력을 감소 하 고 trabeculation를 다시 시작.

추가 우리의 가설을 강제로 hemodynamic 변경 및 따라서 노치 신호, wea 돌연변이 소개를 통해 trabeculation를 증명 하기 위하여는 비 수축 성 심37을 개발 한다. 심 실 유입 및 심 방 systole 동안 hemodynamic 세력의 부재, wea 돌연변이 익스프레스 노치 신호 구성 요소 유전자의 낮은 심장 mRNA 수준 및 대상 유전자 컨트롤에 비해 비 trabeculated, 작고 약하게 항구 심 (그림 2G, L) 계약. 그러나, Nrg1 mRNA 마이크로 주입 wea 돌연변이에 최대-규제 비 수축 성 아 트리 움 (에도 불구 하 고 더 발음된 수축 성 심 선도 노치 신호 전달 경로, 배수 능선의 부분 구조와 함께 그림 2 H, L)2. 이러한 맥락에서 wea 돌연변이 노치 신호를 통해 trabeculation의 hemodynamic 변조 강조 비 수축 성 아 트리 움과 비 trabeculated 심 실 사이의 관계를 뒷받침.

Tnnt2a 모는 심장 수축 심장 분 T38,39억제 들러 전달 했다. Tnnt2a 모 주입 물고기 순환 및 중요 한 아래로 노치 신호, 부드러운 심 실 표면 및 얇은 벽에 제어 그룹 (그림 2I, M) 에 비해 선도 인 심 실 WSS 없는 완전히 했다 . WSS는 endocardium에 trabeculation에 대 한 요구 였는 지 여부를 조사 하는 endocardium 및 심장 내 피 막 개발 하지 않습니다40,41 접속이 (clo) 돌연변이 있습니다. Clo 돌연변이 심장 trabeculae 개발 하는 데 실패 하 고 작은 크기의 심 실 및 (그림 2J)를반복 하는 불완전 한 심장 보였다. 따라서, endocardial 안 대기는 감각 hemodynamic 전단 응력을 노치 신호 (그림 2 M)를활성화 하는 데 필요한. 그러나, hemodynamic 전단 응력 조 또는 isoproterenol 수축 증가 증가 의해 증가 했다 때 노치 관련 유전자의 표현 레벨을 증가 하지 않았다 하 고 배수 네트워크 형태를 변경 하지 않은 (그림 3)입니다.

더 설명 하기 위해 전단 응력 및 노치 신호 사이의 관계, HAECs 생체 외에서 테스트를 위해 사용 되었다. 타악기 흐름 시뮬레이션 내 피 세포에 의해 관찰 hemodynamic 전단 응력 confluent 셀에 발휘 했다. 그것은 정적에 비해 문화, 타악기 문화 노치 관련 유전자 (그림 4)의 표현을 증가 표시 됩니다. 또한, ADAM10 억제제 치료는 크게 노치 신호 (그림 4)감소.

다음, 심 실 분수 단축 및 심 실 구멍 변화 볼륨에는 야생-타입, gata1a 모, AG1478에 대 한 시간이 지남에 계산 하 고 그 Nrg1 주입 그룹 50에 의해 구출 hpf, 75 hpf, 및 100 hpf (그림 5A-C) . ErbB 신호 억제 물, AG1478, 치료 크게 지연 및 감소 100 심 실 심장 중 소수 단축 hpf (그림 5A). Gata1a 모 및 AG1478 치료 4 차원 LSFM (그림 5E, F)에 있는 변화에 의해 평가 동안 수축, 심 실 챔버 크기 감소. 두 그룹 모두를 증가 끝 심장 수축-이완 볼륨 야생-타입에 비해 개발. Gata1a 모와 Nrg1 mRNA의 공동 주입 야생 타입의 사람들 방출 분수와 소수 단축, 복원.

Figure 1
그림 1 : 형광 빛 시트 개요. (A) 대표 LSFM 시스템 샘플 조명 렌즈 (IL)에서 빛 시트의 교차와 감지 렌즈 (DL)의 검색 경로에 배치 됩니다. (B) IL 뒤에 원통형 렌즈 미크론 크기의 빛 시트 (퍼플) 샘플, 내 흥분 샘플의 얇은 시트를 만듭니다. 감지 렌즈 방출된 형광 신호를 기록합니다. (C)는 회로도 광학 zebrafish 태아를 왼쪽 오른쪽 이동 단면 얇은 레이저 시트 (퍼플) 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 심 실 형태학의 유전자 조작 Tg(cmlc:gfp) zebrafish 노치 Ligand와 수용 체, 대상 유전자 발현. (A) 배수 네트워크 75에 표시 됩니다 제어 zebrafish의 hpf. (B) 100에 배수 네트워크 제어 zebrafish의 hpf. (C) 1-4 세포 단계에서 gata1a 미주리의 주입 거의 아무 trabeculation에서 보였다 75 hpf. (D) gata1a 모 zebrafish에의 주입 배수 네트워크 형성을 지연 했다. (E) gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 부분적으로 복원 75에서 trabeculation hpf. (F) gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 거의 완전히 복원 100 배수 네트워크 hpf. 100 (G) wea 돌연변이 hpf 아무 trabeculation와 부드러운 심 실 벽을 보여줍니다. (H) wea 돌연변이 제 브라에 인간 Nrg1 의 주입 부분적으로 복원 100 trabeculation hpf. (I) tnnt2a 75에서 아무 trabeculation 했다 미주리의 주입 (표시 되지 않음) 하는 hpf와 100 hpf. (J) 100에서 아무 trabeculation를 보였다 clo 돌연변이 hpf. (K) gata1a 미주리의 주입 크게 감소 Notch1, Nrg1, 및 Jag2 의 mRNA 표현 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). Gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 크게 Notch1b, Nrg1, ErbB, 및 Jag1 제어에 비해 표현의 증가. (L) wea 돌연변이 했다 노치 관련 유전자의 상당히 낮은 식 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 인간 Nrg1 의 주입 증가 노치 관련 유전자;의 표현 Jag1 및 Jag2 컨트롤 보다 훨씬 더 높은 했다. (M) tnnt2a 모 주입 및 clo 돌연변이 보여 상당히 낮은 표현의 노치 관련 유전자 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 스케일 바: 50 μ m. 데이터는 평균 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 조작에 WSS 증가 Tg(cmlc:gfp) 노치 ligand, 수용 체 및 대상 유전자 발현과 제 브라 vivo에서 . EPO(A) 의 주입 또는 심장 박동 증가 통해 ISO (B) 의 추가-표현의 조 통해 WSS 증가 trabeculation를 증가 하지 않았다 하 고 배수 네트워크 컨트롤의 저것과 유사 했다. (C) EPO mRNA 또는 Isoproterenol 주입 노치 ligand, 수용 체 또는 대상 유전자의 표정 변화 하지 않았다 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 진동 또는 타악기 전단 응력에 따라 내 피 세포 생체 외에서 . 평균 τ의 타악기 전단 응력에 따라 HAECs 30 x 10-5 1에서 n = upregulated 노치 관련 유전자 표현과 노치 관련 유전자 표현의 downregulated ADAM10 억제제 적용 했다 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 소수 단축 및 방출 분 율의 trabeculation의 효과. (A-C) AG1478 및 gata1a 모 추가 크게 감소 100 소수 단축 hpf, 하지만 인간의 Nrg1 및 gata1a 모 공동 주입 그것을 개선. (D) gata1a 주입 및 AG1478 크게 감소 100 소수 단축 hpf (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). Gata1a 및 Nrg1 mRNA의 공동 주입 부분 단축 개선. (E-F) AG1478 및 gata1a 모 75에서 끝 심장 수축과 심장 확장 볼륨을 증가 했다 하는 것을 보여주었다 LSFM와 4 차원 동기화 알고리즘을 통합 hpf (E) 및 100 hpf (F). 데이터는 평균 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

제 브라 Jag1 앞으로 CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
뒤로 CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
제 브라 Jag2 앞으로 AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
뒤로 GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
제 브라 Dll4 앞으로 CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
뒤로 CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
제 브라 BMP10 앞으로 GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
뒤로 TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafish ErBb2 앞으로 GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
뒤로 AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafish Nrg-1 앞으로 GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
뒤로 CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
제 브라 Notch1b 앞으로 CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
뒤로 GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Zebrafish 심사에 사용 한 표 3: 뇌관

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Discussion

이 프로토콜에서 우리 4 차원 이미징 biomechanical 세력의 변화에 대 한 응답에서 배수 네트워크의 개발을 추적 하기 위해 사용 될 수 있다는 것으로 나타났습니다. 특히, 내 피 세포에 의해 경험된 전단 응력 노치 신호 폭포, 차례 차례로 trabeculation를 승진 시키는 시작 합니다. 우리는 (1) gata1a 모 사출 조 감소 하 고 따라서 벽 전단 응력 감소, (2) tnnt2a 모 사출 벽 전단 응력, 그리고 (3) wea를 줄이기 위해 심 실 수축 기능을 저해 표시는이 원고 돌연변이 부족 다음 감소는 hemodynamic 힘은 심 실 심 방 수축. 심장 벽에 전단 응력을 줄임으로써, 우리는 노치 신호 qRT-PCR을 통해 계량 하 고 감소 wss 했음을 발견 노치 신호 감소. 더 증명 하기 위해 우리의 가설, clo 돌연변이 부족 endocardium trabeculae, 형성 하지 않았다 그리고 그 전단 응력은 노치 신호 활성화 하는 것을 보여주었다 ADAM10 존재와 타악기 전단 응력을 내 피 세포를 쓰는.

Confocal 현미경 검사 법 등 다른 이미징 기술을 3 차원14이미지 샘플을 사용할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 등 많은 단점이 있다. 예를 들어 confocal 영상 샘플에 깊이 침투 수 없습니다, 그리고 낮은 축 해상도 느린 검색 속도19,42. Confocal 영상에 침투 깊이 제한으로 인해 전체에서 zebrafish 태아 같은 작은 샘플 몇 군데 수만 수 있습니다. 두 광자 공초점 현미경 침투 깊이 향상 하지만 해상도, 느린 검색 속도, 및 높은 비용이 기법은 바람직하지 않은13. 그러나 두 광자 현미경 및 LSFM를 성공적으로 결합 하는 연구 되었습니다18,, 결점은 여전히 눈에 띄는42.

LSFM, 다른 한편으로, 최소 사진 표백 및 손상13,,1842, 빠른 수집 속도, 및 유사한 침투 깊이13있다. 또한, 듀얼 렌즈 단일 면 (그림 1)의 흥분 때문에, 배경 잡음은 크게 감소43이다. 그러나, 샘플 vivo에서 zebrafish14,,1719이외의 모델에 적용 하기 어려운 샘플을 무력화 하는 젤에 포함 될 필요가 있다. 또한, 형광 빛의 이용 제한 몇 밀리미터에 깊이 침투 합니다. LSFM는 시각화에 대 한 좋은 방법입니다, 비록 그것은 양적 데이터로 보완 중요입니다. LSFM 질적만 있기 때문에 다양 한 해석에 따라 수 있습니다. QRT-PCR를 사용 하 여, 우리 LFSM 4 차원 이미지 라이브 샘플에서 발생 하는 이벤트에 대 한 올바른 표현을 했다 확인할 수 있습니다. 때때로 더 큰 견본에 줄무늬와 그림자 이미지를 형성할 수 있다. 그러나, 이러한 유물42를 줄이기 위해 양면 조명 또는 mSPIM을 이용하실 수 있습니다. LSFM은 너무 다양 하기 때문에 높은 해상도 전반적으로 더 나은 품질의 이미지를 캡처의 능력은 LSFM 약속의 미래. 앞에서 설명한 LSFM 성공적인 이미징18,42에 대 한 다른 이미징 시스템과 결합할 수 있습니다.

우리는 이전 23 x 10-5 N 1 Hz에서 24 h에 대 한의 타악기 전단 응력을 실질적으로 적용 하는 upregulates 노치 신호 vitro에(그림 4)17시연 했다. 우리 다시 한번 입증 전단 세력 노치 신호 조 (gata1a 모)4, 심장 수축 (tnnt1a 모)5, 심 방 수축 (wea 돌연변이), endocardial의 유전자 조작에 의해 활성화 삭제 (clo 돌연변이), 그리고 노치 신호 (안내 [flk:mCherry; tp1:gfp])의 지 방화. 우리가 설명 여기에 노치 관련 유전자 아래로 (그림 2 K, L, M)은심 실 벽 전단 응력을 낮추는 방법으로 합니다. 또한, 우리는 Nrg1 mRNA trabeculation 구조, 노치 신호, 복원 수 있었다 고 심 실 분수 단축 및 방출 분 율 향상을 수 있었다 (그림 2E, F, H, K M, 그림 5) . 심장 기능의 복원 수축 기능 중재 hemodynamic 세력 활성화 노치 신호 (그림 2 KM)에 증가 의해 표시 했다.

우리는 또한 전단 응력 활성화 노치 신호 하는 것이 endocardial 종속은 결정 합니다. Gata1a 모, tnnt2a 모, wea 돌연변이 또는 AG1478 치료를 사용 하 여 trabeculation을 저해 하 고 아래로 (그림 2 KM)는노치 신호. 그러나 Nrg1 trabeculation와 wea 돌연변이에 노치 신호를 구출 하는 때 공동 gata1a 주사 모 (그림 2D, H, K, L). 벽 전단 응력 (EPO 주사) 또는 노치 신호 (10 세/nL Nrg1 주입) 증가 했다, 형태학, 측면에서 EPO 그룹에 변화 했다 하지만 비정상적인 심 실 morphogenesis Nrg1에 증가 복용량 (그림 3).

결론적으로, 우리는 전단 응력의 mechanotransduction 노치 신호 전달 경로 활성화 나타났습니다. 적용 하 여 4 차원 LSFM와 유전자 조작된 zebrafish, 우리는 새로운 개발 어떻게 중요 한 혈액의 흐름을 보여 주는 모델 시스템 그것의 형태학, 수축, 및 전반적인 기능에 심장 개발 중 이다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 인간을 제공 하기 위한 스탠포드 대학에서 윌리엄 탤벗에 감사를 표현 하 고 싶습니다 Nrg1 cDNA를 제공 하기 위한 UCSD에서 데보라 Yelon는 wea 돌연변이입니다. 저자 또한 이미지 수집 도와주 신 시아 첸을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구 보조금 NIH HL118650 (T.K. Hsiai)에 의해 지원 되었다 (T.K. Hsiai)에 HL083015, HD069305 (하려면 노스캐롤라이나 치 T.K. Hsiai.), HL111437 (T.K. Hsiai 노스캐롤라이나 치)를, (T.K. Hsiai)에 HL129727, T32HL007895 (R.R. Sevag Packard)에, HL 134613 (V. Messerschmidt) 하 고 텍사스 시스템 별 자금 (현)의 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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