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Bioengineering

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser le développement des cœurs chez le poisson zèbre en 4 Dimensions (4D). L’imagerie 4D, par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM), prend 3 Dimensions (3d) images au fil du temps, de reconstruire les cœurs en voie de développement. Nous montrons qualitativement et quantitativement que cette contrainte de cisaillement active endocardique Notch signalisation au cours du développement de chambre, qui favorise la trabeculation cardiaque.

Abstract

Les forces hémodynamiques que par le développement cardiaque de coeur influence, surtout trabeculation, qui forme un réseau d’excroissances ramifiées par le myocarde. Programme d’amélioration génétique défauts dans l’encoche de signalisation cascade participent ventriculaires défauts comme la cardiomyopathie Non-Compaction ventriculaire gauche ou Syndrome de coeur gauche hypoplasique. Utilisant ce protocole, il peut être déterminé que la contrainte de cisaillement piloté par trabeculation et la signalisation Notch sont liés à un autre. À l’aide de la microscopie de Fluorescence lumière-feuille, visualisation du poisson-zèbre-coeur en développement a été possible. Dans ce manuscrit, il a cherché à déterminer si les forces hémodynamiques modulent l’ouverture de trabeculation via la signalisation Notch et par conséquent, influer sur la fonction contractile se produit. Qualitative et quantitative de cisaillement analyse des contraintes, 4-D (3-J + temps) images ont été acquises au cours de la morphogenèse cardiaque de poisson-zèbre et fluorecence feuilles lumière intégrée avec 4D synchronisation capturé la motion ventriculaire. La viscosité du sang a été réduite via gata1a- morpholino oligonucléotides (MO) la micro-injection pour diminuer la contrainte de cisaillement, ainsi, down-régulation encoche de signalisation et d’atténuer les trabeculation. Coinjection de Nrg1 ARNm avec gata1a MO a sauvé les gènes liés à l’encoche pour restaurer trabeculation. Pour confirmer la contrainte de cisaillement, piloté par la signalisation Notch des influences trabeculation, contraction de cardiomyocyte a été encore arrêtée via tnnt2a-MO pour réduire les forces hémodynamiques, ainsi, down-régulation des gènes de cible encoche pour développer un non-trabéculé myocarde. Enfin, corroboration des patrons d’expression des gènes sensibles aux contraintes de cisaillement de Notch a été réalisée en soumettant des cellules endothéliales à flux pulsatile. Ainsi, la microscopie de lumière-feuille 4D découvert hémodynamiques forces qui sous-tendent la signalisation Notch et trabeculation présentant de l’intérêt clinique à une cardiomyopathie non-compaction.

Introduction

Forces biomécaniques, telles que la contrainte de cisaillement hémodynamique, sont intimement impliqués dans la morphogenèse des cardiaque. En réponse aux forces de cisaillement hémodynamiques, sillons et crêtes myocardiques se développent dans un réseau trabéculaire ondulants dans l’alignement de la direction de la contrainte de cisaillement dans l’ensemble de l’auriculo-ventriculaire (AV) vanne1. Trabeculation cardiaque est nécessaire d’augmenter la contractilité et la masse myocardique2. Des mutations dans l’encoche, voies de signalisation entraînent des malformations cardiaques congénitales chez les humains et les autres vertébrés3. Par exemple, gata1a4 et tnnt2a5 morpholino oligonucléotides (MO) ont été montrés pour réduire l’érythropoïèse, tandis que l’érythropoïétine (EPO) d’ARNm6 et l’isoprotérénol (ISO)7 augmentent rouge sang cellules et la fréquence cardiaque, respectivement et par conséquent mur contrainte de cisaillement (WSS). En outre, signalisation ErbB2, en aval de l’encoche, favorise cardiomyocyte prolifération et la différenciation pour générer la force contractile, qui à son tour active Notch signalisation8,9. Il est suggéré que la contrainte de cisaillement régit Notch signalisation conduite trabeculation pour le développement ventriculaire. Actuellement, il y a beaucoup d’études qui tentent de mieux comprendre les événements de programmation génétiques conduisant à des malformations cardiaques congénitales (CHD)10,11,12, mais très peu étudient comment les forces mécaniques influencent le coeur formant.

Afin d’étudier les forces mécaniques agissant sur l’endocarde, une surveillance étroite au cours de la période de développement doit être mis en œuvre. Toutefois, il est difficile d’obtenir des images de bonne qualité en vivo battant échantillons en raison de l’inhérence de microscopie traditionnelle13. Afin d’observer l’évolution dans le temps au sein d’un échantillon, physique de sectionnement et de coloration, se doivent donc se produire13,14,15. Bien que la microscopie confocale est largement utilisée pour l’image de la structure 3D d’échantillons14,16, acquisition de ces systèmes d’imagerie est encore limitée par les faibles vitesses de balayage.

La microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM) est une technique d’imagerie qui permet la visualisation de in vivo des événements dynamiques avec long travail distance13. Cette technique utilise une microscopie fluorescente lumière-feuille pour la section optiquement un échantillon de17. En raison de l’éclairage de seulement une feuille mince de la lumière sur l’échantillon, il y a une réduction de blanchiment photo et photo toxicité13,18. Le grand champ de vue et de longue distance de travail permet de grands échantillons de rester intact, car ils sont imagés13,14,17. Le faible grossissement permet une plus grande surface à être photographiée, tandis que la longue distance de travail permet d’échantillons plus épais être photographié sans compromettre le rapport signal-bruit. De nombreux groupes ont utilisé LSFM image entière embryons17, brains14,18, des muscles et des coeurs19 parmi les autres tissus, montrant les divers types d’échantillons qui peuvent être photographiées.

Bien que des recherches antérieures force de cisaillement hémodynamiques réduite par l’occlusion les pistes flux entrant ou sortant du cœur zebrafish, l’information est exclusivement qualitative. Il en résulte un anormal (troisième chambre bouclage cardiaque diminuée et vanne avec facultés affaiblies formation20. Les images LSFM 4D donnent une nouvelle perspective dans la façon dont le cisaillement hémodynamique forces affectent le développement du tissu cardiaque. Ces forces mécaniques peuvent activer des molécules de signalisation sensibles à la force et induire la formation des crêtes trabéculaires. En raison de l’aspect du temps additionnel d’imagerie 4D, on est capable de suivre les changements dans le développement en temps réel, ce qui pourrait conduire à de nouvelles révélations qui avaient passés inaperçues auparavant. Le poisson-zèbre est un modèle idéal pour l’imagerie parce que les scientifiques peuvent observer un animal vertébré complet contre seulement les interactions cellule-cellule. L’oxygène peut également diffuser à travers l’embryon entier, qui permet un développement se produire sans selon le système vasculaire, à la différence dans le développement chez les mammifères. Même si le coeur de poisson-zèbre ne possède pas les organes pulmonaires, qui exigent un cœur à quatre cavités, il y a un grand nombre de gènes cardiaques qui sont conservées entre les poissons zèbres et l’homme21.

Dans ce manuscrit, nous expliquent comment utiliser la microscopie en fluorescence lumière-feuille d’imager les travées en développement dans les coeurs de poisson-zèbre dans diverses circonstances. Tout d’abord, l’injection de gata1a4 ou tnnt2a5 MOs servaient à bas la viscosité du sang et par conséquent WSS. La morphologie du cœur a été enregistrée puis. Dans un autre groupe de poissons, nous a augmenté le WSS en administrant des ARNm de l’OEB 6 ou isoprotérénol7 et observer les résultats. Nous avons également mené une étude de cellule avec différents débits pulsatile ou oscillant. Après chaque groupe d’imagerie, nous avons constaté que WSS captée par l’endocarde via l’encoche signalisation initiés trabeculation.

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Protocol

Les méthodes suivantes ont été réalisées dans le respect de protocoles UTA et UCLA IACUC. Ces groupes expérimentaux ont été utilisés avec transgéniques Tg(cmlc2:gfp), les mutants wea (atrium faible) ou clo (cloche) : (a) type sauvage (WT) contrôle, (b) gata1a MO et injections de (c) tnnt2a MO (tableau 1).

Modèle Nom Gènes modifiés Phénotype Référence
Contrôle Type sauvage Aucun N/A
TG(cmlc2:GFP) Chaîne légère de la myosine cardiaque Fluorescence verte spécifiquement exprimé dans le myocarde 34
Contrainte de cisaillement de mur une diminution Mutant faible atrium (wea) Chaîne de heacy la myosine spécifiques à Atrium Atrium ne peuvent pas contracter, compact épais mur myocardique, lumen étroit, ventricule, atrium dilatée, 37
Mutant de cloche (clo) N/A Retrait complet de l’endocarde, unaturally grand atrium avec petit ventricule, cushins cardiaque qui n’existe pas 41
gata1a MO gata1a  Anémie, un manque de globules rouges 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Contrainte de cisaillement mur accrue OEB ARNm Aucun Polyglobulie sévère, augmentation du nombre de cellules sanguines, en circulation a augmenté de viscosité 6
Isoprotenerol Aucun Augmentation du rythme cardiaque 7

Tableau 1 : Les descriptions de poisson-zèbre. Définitions et descriptions de poissons zèbres utilisés dans des expériences.

1. étudier le programme d’installation

  1. Préparer Nrg1 et OEB ARNm pour le sauvetage de trabeculation.
    1. Obtenir des ADNc humain Nrg1 et amplifier d’un plasmide de donateurs.
      Remarque : L’ADNc humain Nrg1 était douée de William Talbot, de l’Université Stanford.
      1. Sortez les réactifs nécessaires et matériaux, nommément PCR mastermix (stockés à-20 ° C), amorces (voir tableau 2) (stockés à-20 ° C), une plaque PCR (conservée à température ambiante) et une pipette de 20 μL (conservée à température ambiante). Voir Table des matières pour les exemples de produits.
        Table 2
        Tableau 2 : Amorces pour le clonage d’êtres humains Nrg1 .
      2. Préparer le mastermix pour chaque amorce en trois exemplaires à l’aide de la pipette de 20 μL. Pour 1 ensemble de géométrie, utilisez 37,5 μL de la mastermix, 3 μL d’eau exempte d’ADN, 4,5 μL d’apprêt. Pour plus de géométrie, il suffit de multiplier par le nombre d’échantillons.
      3. Diluer la solution de travail humain Nrg1 cDNA (concentration de 20 ng/μg) dans la bande de primaire avec de l’eau sans ADN afin qu’il y a 10 μL total / puits par échantillon.
        Remarque : Veiller à ce que chaque solution sous étape 1.1.1 est répartie uniformément. Pour cela mélangez chaque solution en pipettant également de haut en bas. Pour éviter la contamination croisée, utiliser un embout de la pipette pour un échantillon seulement.
      4. Aliquoter le cDNA Nrg1 avec la pipette multicanaux de 10 μL à désiré puits de la plaque de la PCR.
      5. Ajouter 14,5 μL de la mastermix à l’ADNc dans les puits. Appliquer une collant de la couverture sur la plaque PCR pour sceller les puits et placer dans la machine PCR.
      6. Démarrage de la machine PCR et veiller à ce que le cycle atteint une température appropriée selon les enzymes et les amorces utilisées.
    2. Cloner l’ADNc Nrg1 dans le Bureau2 plasmidique+ sur les sites BamHI et EcoRI utilisant des enzymes excès BamHI et EcoRI pour assurer l’ADNc est ligaturé dans tous les plasmides.
      1. Mélanger l’ADNc Nrg1 avec le donateur Bureau2 plasmidique+, disponible dans le commerce master mix solution et amorces (tableau 2).
        Remarque : Le volume de réaction totale doit être 50 μL avec 25 μl du mélange principal, 3 μL d’amorces et 1 μL de plasmide 20 ng/μL donneur Nrg1 cDNA.
      2. Placez le mélange de l’étape 1.1.2.1 dans la machine PCR et définir les paramètres pour répondre aux spécifications suivantes : 98 ° C pour 10 s 55 ° C pendant 5 ou 15 s et 72 ° C pendant 5 s/Ko.
      3. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification suivant les instructions du fabricant. Éluer le produit en 50 μL de tampon d’élution.
      4. Digérer le produit PCR purifié et 5 μg de Bureau2+ avec BamHI et EcoRI séparément à 37 ° C pendant 2 h dans un volume réactionnel de 200 μl. Purifier la digestion qui en résulte avec une trousse commerciale et éluer à 20 μL et 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivement.
      5. Ligaturer 4 μL de Nrg1 ADNc et 2 μL de la Bureau2 digérées+ plasmide dans une 25 μL réaction avec 1 μL d’un catalyseur de ligase à 16 ° C durant la nuit.
        Remarque : La procédure peut être arrêtée ici pour une nuit d’incubation.
      6. Utiliser 2 μL de la solution de la ligature de l’étape 1.1.2.5 transform dans 50 μl de cellules de bactéries e. coli adaptés pour le clonage (voir Table des matières).
    3. Confirmer que la transformation a eu lieu par dépistage que l’ADNc Nrg1 clones par PCR. Choisir au hasard les clones et les ajouter à une solution des amorces spécifiques, polymérase et triphosphates de désoxyribonucléotides (dNTPs).
      Remarque : Les contrôles ont été le vecteur (Bureau2+) avec et sans l’insert (ADNc humain). Ne prenez pas trop grande d’une colonie, parce que les bactéries excessives peuvent inhiber la PCR.
      1. Prélever 8 colonies de la transformation et l’écran Bureau2+-Nrg1 clones en utilisant les amorces PCR du tableau 2.
      2. La culture d’un clone avec l’ADNc Nrg1 pour isoler le Bureau2+-Nrg1 ADN plasmidique. Ensemencer avec 100 μL de bactérie e. coli avec Bureau2+-Nrg1 plasmide dans 100 mL de LB médias et culture en secouant (160-225 tr/min) à 37 ° C.
    4. Transfecter Bureau2 purifiée+-Nrg1 plasmide dans les cellules HEK-293 cellules dans une plaque de 6 puits à l’aide d’un réactif de transfection commerciale suivant les instructions du fabricant.
    5. 24h après la transfection, lyser les cellules à l’aide d’un tampon de lyse et traversent un gel SDS-PAGE, transfert sur une membrane de gel et puis tache avec anti-Nrg1 anticorps22. Vérifier l’expression de la protéine Nrg1 utilisant un Western Blot.
      Remarque : Le contrôle est un vide Bureau2+ plasmide. Peut être suspendu ici en cas de transfert de membrane de gel durant la nuit.
    6. Synthétiser les ARNm Nrg1 à l’aide d’un produit commercial semblable à celui de la Table des matières et suivez les instructions du fabricant.
      1. Prendre 5 μL de la Bureau2+-Nrg1 l’ADN de la culture de bactéries isolées et digest avec NotI dans une réaction de 200 μL pendant 2 h à 37 ° C pour linéariser le plasmide.
      2. Purifier le plasmide linéarisé avec une trousse commerciale et éluer à 20 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Conduite en vitro transcription avec un kit d’isolation ARN commerciale dans une réaction de 20 μL utilisant 5 μL du plasmide linéarisé suivant les instructions du fabricant.
      4. Ajouter que le in vitro transcrit Nrg1 à 350 μL de tampon de lyse RNA et ensuite purifier avec un kit d’isolation d’ARN. Éluer la RNA dans 60 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Mesurer la concentration en ARN et stocker à-80 ° C pour une utilisation future.
    7. Suivez les étapes 1.1.6.1 - 1.1.6.5 ci-dessus pour la cDNA de l’OEB et la préparation de l’ARNm mais le clone l’ADNc dans le plasmide Bureau2 + EcoRI et XhoI sites au lieu de cela.
  2. Injecter Morpholino zebrafish
    1. La conception23 les injections de MO à l’aide d’un outil en ligne (Table des matières) contre la séquence de l’ATG gata1a4 (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) et tnnt2a5 (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Ajouter gata1a et tnnt2a MO séparément à l’eau exempte de nucléase à rendre la concentration finale de 8 ng/nL et 4 ng/nL, respectivement. Répéter avec l’OEB ARNm avec une concentration finale de 20 pg/nL. Assurez-vous que le volume final est de 1 mL.
    3. Injecter 1 nL de la 8 ng/ml d' gata1a MO et 1 nL de la 4 ng/nL de tnnt2a MO dans des embryons de poisson zèbre séparé 1 à l’étape 4 cellules pour réduire la paroi ventriculaire contrainte de cisaillement (WSS)24. Pour augmenter le WSS, injecter 1 nL de 20 pg/ml d’EPO ARNm6 dans les embryons de poisson-zèbre à l’étape 1 à 4 éléments.
  3. Traiter chimiquement zebrafish pour inhiber les trabeculation
    1. À l’aide d’une pipette 20 mL, diluer la AG1478 10 mg/mL dans le DMSO de 1 % en moyenne de E3 à une concentration finale de 5 μM à 30 hpf dans un tube de 15 mL. Comme contrôle, traiter chaque poisson avec 1 % DMSO uniquement.
    2. Ajouter ester de t-butyle N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine (DAPT) dans le 1 % DMSO (100 μM) au milieu de l’E3 dans un tube de 15 mL pour inhiber la signalisation Notch à 40 hpf de manière similaire. Comme contrôle, traiter avec seulement 1 % DMSO.

2. Techniques d’imagerie

  1. LSFM cardiaque 4D Imaging avec algorithme de synchronisation
    1. Prenez des images 2D de l’embryon des poissons entiers multiples cardiaque battant cycles en suivant les étapes ci-dessous (Figure 1). Assurez-vous que l’épaisseur de la feuille de lumière est environ de 5 μm. Prendre 500 images de x-y avec un temps de pose de 10 ms. ensemble le z-balayage à 1 μm pour l’échantillonnage numérique sans perte selon le principe de l’échantillonnage Nyquist25.
      1. Créer un gel d’agarose de 1 % (p/v) en ajoutant 1 g d’agarose à 100 mL et chauffer jusqu'à ce que tous les agarose est dissoute. Charger un petit tube en plastique avec l’embryon et l’agarose à l’aide d’une pipette 20 μL et fixez-le sur la scène.
      2. Ouvrez l’image logiciel de visualisation, puis cliquez sur Live pour voir l’affichage en direct de l’échantillon. Ajuster l’objectif à l’aide du bouton afin que l’échantillon est mise au point. De même, déplacer la scène jusqu'à ce que l’affichage en direct de l’échantillon indique la partie supérieure de l’embryon.
      3. Prendre des images de 500 fois pendant 5 s au grossissement de 10 X à l’aide du microscope logiciel26.
      4. Déplacer la scène en utilisant le moteur dans un nouveau calque (1 μm de l’axe z) et répéter la procédure d’imagerie.
      5. Répétez les 2 étapes ci-dessus jusqu'à ce que le coeur entier est entièrement imagée.
    2. Assurer l’intégrité des données en négligeant les images de premier et dernier cycle cardiaque. Trouver la période du cycle cardiaque en faisant correspondre les images qui ont été prises au même moment dans le cycle cardiaque, mais à des époques différentes. Utiliser l’équation suivante qui a été développée pour trouver la période :
      Equation 1(1)
      où D est la fonction de coût utilisée pour fixer une hypothèse de l’époque, jem l’image capturée, τ' le temps l’image a été capturée, zk l’indice z-direction de l’image, x,m est la vecteur de l’indice de pixel, et T' est l’hypothèse de périodique.
    3. Utilisez l’équation suivante pour trouver le déplacement relatif entre les deux images dans des stades semblables :
      Equation 2(2)
      où Qk', k dénote une fonction de coût pour le déplacement relatif, R est le quartier spatial possible, L est la durée totale de la capture de l’image, la x est pixel index, zk et zk' sont les tranches de première et deuxième axe z, t est le temps et s est l’hypothèse du déplacement relatif.
    4. Convertir le déplacement relatif au décalage absolu en ce qui concerne la première image et résoudre l’équation linéaire à l’aide de l’approche Pseudo-inverse, pour trouver la relation absolue pour aligner la section suivante d’images, comme décrit précédemment27.
    5. Au final des images 4-D ont été traitées à l’aide de logiciels de traitement d’image (Table des matières).
      1. Empilement des images 2D en 3D
        1. Ouvrez une logiciel de traitement d’image commerciale.
        2. Cliquez sur Open Data.
        3. Sélectionnez toutes les images à être empilés en 3-d > cliquez sur Load.
        4. Ajouter de la taille du voxel de 0,65 x 0,65 x 1 > cliquez sur OK.
        5. Cliquez sur la zone de Multi-Planar affichage pour visualiser l’image en 3D.
        6. Faites un clic droit de la boîte bleue slice_1.tiff > sélectionnez affichage > sélectionnez Volren.
        7. Cliquez sur modifier > sélectionner Options > sélectionnez modifier la palette des couleurs.
        8. Ajuster la couleur en utilisant les boîtes de contour rouge > cliquez sur OK.
      2. Conversion 3D en 4D
        1. Cliquez sur "fichier > ouvrir les séries chronologiques.
        2. Sélectionnez le TIFF 3D qui ont été faites juste > cliquez sur Load.
        3. Entrez la même taille de voxel qu’avant.
        4. Faites un clic droit de la boîte bleue slice_1.tiff > sélectionnez «affichage» > sélectionnez Volren.
        5. Cliquez sur modifier > sélectionner Options > sélectionnez modifier la palette des couleurs. Ajustez la couleur en utilisant les cases > cliquez sur OK.
        6. Faites un clic droit de Commande série Time > cliquez sur Movie maker > Appuyez sur le bouton lecture pour regarder le film.
        7. Ajouter un nom de fichier, taille de l’image, cadence qualité égale à 1, tapez monoscopique > cliquez sur Apply
        8. Exporter la vidéo. Ouvrir la vidéo dans un logiciel approprié.

3. analyse qRT-PCR

  1. Poisson zèbre ARN afin de quantifier des ligands Notch, récepteurs, de coeur et cibler les expressions des gènes
    1. Sacrifier le poisson-zèbre en les soumettant à une surdose de tricaïne metoksid28,29. En utilisant un protocole décrit précédemment30, le cœur de poisson-zèbre ont été excisé et préparé pour l’ARN.
    2. Isoler l’ARN total et de synthétiser l’ADNc grâce au kit de synthèse de cDNA suivant les instructions du fabricant.
    3. Concevoir les amorces PCR pour les ligands Notch Jag1, Jag2, Dll4, récepteurs Notch1bet signalisation liés gènes Nrg1 et ErbB2. Voir le tableau 3 pour les amorces, nous avons utilisé.
    4. Ajouter les amorces de l’étape 3.1.3, l’ARNm isolé de l’étape 3.1.2 et un mastermix commercial jusqu'à la tôle de la PCR. Exécutez le qRT-PCR aux températures appropriées et heures selon les enzymes utilisées. Normaliser les résultats à l’actine α poisson zèbre.
      Remarque : Cela va calculer les niveaux d’expression pour chacun des gènes, récepteurs et ligands.

4. des expériences in vitro humain cellules endothéliales aortiques (HAEC)

  1. Modèle de la contrainte de cisaillement dynamique
    1. Cellules en culture HAEC avec HAEC milieux de culture. Une fois entièrement confluentes, exposer les cellules à flux laminaire et flux pulsatile de 23 x 10-5 N à la fréquence de 1 Hz pendant 24 h.
      1. EC d’échauffement médias/DMEM 10 % FBS dans une eau de bain pendant 20 min.
      2. Récupérer des cellules HAEC du réservoir d’azote liquide et placez le flacon dans le bain d’eau jusqu'à ce que fondu.
      3. À l’aide d’une pipette μL 1 000, enlever les cellules décongelées et mettez-les dans un tube de 15 mL avec 3 à 5 mL de médias. Centrifuger la solution cellulaire à 53 x g pendant 3 min.
      4. Aspirer la solution large et ajouter assez de médias pour un volume total de 10 mL. Verser la solution de cellule dans une fiole de T75 stérile, cap le ballon et distribuer les cellules uniformément sur le fond de la plaque.
      5. Marquer la fiole avec initiales, date, type de cellule et le numéro de passage. Incuber le ballon à 37 ° C, 5 % de CO2, jusqu'à ce que les cellules sont 80 % anastomosé. N’oubliez pas de changer les médias tous les 2-3 jours.
      6. À l’aide d’une pompe commerciale, raccorder la tubulure au ballon et réglez les paramètres mentionnés ci-dessus dans l’étape 4.1.131,32,33.
    2. Ajouter GI254023X à 50 mL de milieu, HAEC à une concentration finale de 5 μM pendant 30 min.
    3. Avec le prémélange GI254023X, un inhibiteur de l’ADAM10 qui supprime l’encoche de signalisation, mener le même flux laminaire ou expériences de flux pulsatile comme dans 4.1.1.
    4. Quantifier les ligands Notch (Jag1, Jag2 et Dll4) et les gènes cibles de Notch (poilu et exhausteur de split [Hes]) par qRT-PCR pour quatre groupes d’échantillons HAEC (hotte à flux laminaire, hottes à flux laminaire + GI254023X, flux pulsatile, pulsatile flow + GI254023X) décrit précédemment32.

5. le sauvetage et la surexpression de la signalisation Notch

  1. Injecter 1 nL de l’ARNm de Nrg1 préparés à une concentration de 5 pg/nL (de l’étape 1.1.6) à l’étape 1 à 4 éléments avec le gata1a MO pour surexprimer Notch cible gènes24.
  2. Injecter 1 nL de l’ARNm Nrg1 dans wea mutant dans une semblable manière24.
  3. Double la concentration de l’ARNm Nrg1 (10 pg/nL) et injecter24 1 nL dans le poisson-zèbre, d’observer la morphologie ventriculaire.
  4. Injecter 1 nL de la 20 pg/BN d’EPO ARNm6 dans les embryons de poisson-zèbre à l’étape 1 à 4 éléments pour augmenter l’hématopoïèse pour augmenter ventriculaire WSS aussi déjà montré24.
  5. Injecter 1 nL de 50 μM isoprotérénol7, ce qui augmente le taux de la contractilité dans le milieu de l’E3 pour 24h tout en poisson zèbre sont cultivées comme démontré précédemment24.
  6. Effectuer l’imagerie 4D LSFM pour chaque groupe. Suivez les instructions de mesures 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantification de la fraction de raccourcissement et le volume de changement au fil du temps

  1. Effectuer l’imagerie 4D LSFM pour chaque groupe de 50, 75 et 100 hpf. Suivez les instructions de mesures 2.1.1-2.1.5.2.8. Divisez chaque image donc chacun a 600 nœuds pour la réplication de la motion de la paroi cardiaque.
  2. Mesurer le changement de diamètre du ventricule pendant la diastole et la systole à l’aide de la formule suivante :
    Equation 3(3)
    Charger des images 3D ventriculaires à chaque 0,1 s avec logiciel de visualisation et de mesure du volume.
  3. Tracer le changement de volume au fil du temps pour chaque groupe expérimental à 75 hpf et 100 hpf.

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Representative Results

LSFM servait dans ce manuscrit afin d’acquérir des images 2D et 3D haute résolution. Comme le montre la Figure 1 a et 1 b, l’objectif de l’illumination dirige la nappe de lumière à l’échantillon. En raison de la minceur de la nappe de lumière, seulement un seul plan est éclairé. La lentille de détection est placé perpendiculairement à l’objectif de l’illumination et se concentre sur le plan lumineux (Figure 1 b). La nappe de lumière de l’objectif de l’illumination analyse ensuite l’échantillon de gauche à droite (Figure 1). La numérisation permet moins de blanchiment photo, photo-toxicité et a un rapport signal-bruit plus faible.

LSFM a été appliqué à des embryons de Tg(cmlc2a:gfp) pour visualiser l' ensemble de la structure cardiaque34 par rapide balayage (> 30 s) avec une résolution de voxel de 0,65 x 0,65 x 1 µm. en raison d’un éclairage de plan unique, bruit de fond a été significativement réduite (Figure 1). Crêtes trabéculaires dépassait dans la lumière ventriculaire à 75 hpf, ainsi qu’un réseau trabéculaire a été clairement démontré à 100 hpf (Figure 2 a, B). Gata1a MO la micro-injection réduites hématopoïèse et viscosité de 90 %4,35. Cette viscosité baisse atténuée hémodynamique contrainte de cisaillement, ce qui entraîne une ouverture retardée et la densité du réseau trabéculaire 75 hpf et 100 hpf comparativement au groupe témoin (Figure 2 C, D). Par ailleurs, Notch ligands (Dll4, Jag1et Jag2), récepteur (Notch1b), et des éléments de signalisation en aval (Nrg1 et ErbB2) ont été diminuées en réponse à gata1a MO injection (p < 0,05, n = 5) (Figure 2 K)2,8,36. Coinjection de gata1a MO à 5 μM de Nrg1 régulée Notch gènes liés signalisation ARNm et formation trabéculaire sauvée à 75 hpf et 100 hpf (Figure 2E, F, K). Ainsi, gata1a MO réduite hémodynamiques forces menant à la régulation de la signalisation Notch, tandis que Nrg1 ARNm sauver la régulation des gènes liés à encoche et re-lancé trabeculation.

Afin de prouver plus loin notre hypothèse selon laquelle la modification hémodynamique forces et donc trabeculation par l’intermédiaire de signalisation Notch, nous avons introduit le mutant de wea , qui développe un atrium non contractiles37. En l’absence d’afflux ventriculaire et hémodynamiques forces pendant la systole auriculaire, wea mutants expriment inférieur cardiaque ARNm de la protéine Notch gènes composant de signalisation et de gènes cibles par rapport aux témoins et le port non-trabéculé, petite et faiblement contractantes les ventricules (Figure 2, L). Toutefois, la micro-injection Nrg1 ARNm dans les mutants wea régulée l’encoche signalisation, accompagné par le sauvetage partiel de crêtes trabéculaires, conduisant à un ventricule contractile plus prononcé malgré une oreillette non contractiles ( Figure 2 H, L)2. Dans ce contexte, les mutants de wea corroborent la relation entre l’oreillette et non contractiles et un ventricule non-trabéculé, soulignant la modulation hémodynamique de trabeculation via la signalisation Notch.

Tnnt2a MO a été livré pour arrêter la contraction cardiaque en inhibant la troponine T38,,39. Le tnnt2a MO-injecté poisson était totalement dépourvues de circulation et WSS ventriculaire en raison de l’importante entaille diminuées de signalisation, conduisant à une lisse surface et mince paroi ventriculaire comparativement au groupe témoin (Figure 2I, M) . Afin d’étudier si WSS sur l’endocarde était une exigence pour trabeculation, nous avons également des mutants de cloche (clo) pour lequel endocarde et le revêtement endothélial du cœur ne développent pas40,41. Le mutant clo n’a pas pu développer des trabécules cardiaques et a montré la plus petite taille ventricule et cardiaque incomplète en boucle (Figure 2J). Ainsi, la muqueuse endocardique est nécessaire au sens de cisaillement hémodynamique pour activer l’encoche (Figure 2 M)de signalisation. Toutefois, lorsque la contrainte de cisaillement hémodynamique a été augmentée en augmentant l’hématopoïèse ou traitement d’isoprotérénol d’augmenter la contractilité, les niveaux d’expression des gènes liés à l’encoche n’a pas augmenté, et la morphologie du réseau trabéculaire n’a pas changé (Figure 3).

Pour démontrer davantage la relation entre la contrainte de cisaillement et la signalisation Notch, HAECs ont été utilisés pour les essais in vitro . Un flux pulsatile s’est exercé sur les cellules confluentes pour simuler la contrainte de cisaillement hémodynamique observée par les cellules endothéliales. Il est démontré que la culture par rapport à statique, pulsatile culture augmente l’expression des gènes liés à l’encoche (Figure 4). En outre, traitement avec l’inhibiteur de ADAM10 a considérablement réduit Notch signalisation (Figure 4).

Ensuite, nous avons calculé ventriculaire rétrécissement fractionnaire et changement de la cavité ventriculaire en volume au fil du temps pour le type sauvage, gata1a MO, AG1478, et ceux sauvés par groupes injection Nrg1 à 50 hpf, 75 hpf et 100 hpf (Figure 5 a- C) . Traitement avec ErbB signalisation inhibiteur, AG1478, considérablement retardé et réduit fractionnaire raccourcissement durant la diastole ventriculaire à 100 hpf (Figure 5 a). Gata1a MO tant AG1478 traitement réduit taille chambre ventriculaire pendant la contraction, tels qu’évalués par les changements en 4D LSFM (Figure 5E, F). Les deux groupes ont développé un volume télésystolique et - diastolique accru par rapport à la souche sauvage. Coinjection de Nrg1 ARNm avec gata1a MO restaurée tant raccourcissement fractionnaire, Fraction d’éjection vers ceux du type sauvage.

Figure 1
Figure 1 : Fluorescent lumière vue d’ensemble de la feuille. (A) système représentant LSFM où l’échantillon est placé à l’intersection de la nappe de lumière de l’objectif de l’éclairage (IL) et le chemin d’accès détection de la lentille de détection (DL). (B) la lentille cylindrique derrière l’IL crée la micron légère feuille (violette) au sein de l’échantillon, qui excite une feuille mince de l’échantillon. La lentille de détection enregistre le signal fluorescent émis. (C) une représentation schématique de la feuille mince laser (violet) sectionnement optiquement l’embryon de poisson zèbre qui se déplace de droite à gauche. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Morphologie ventriculaire de manipulé génétiquement TG(CMLC:GFP) poisson zèbre avec encoche Ligand du récepteur et l’expression des gènes cibles. (A) le réseau trabéculaire est montré à 75 hpf du poisson-zèbre de contrôle. (B) le réseau trabéculaire à 100 hpf du poisson-zèbre de contrôle. (C) l’Injection de gata1a MO à l’étape 1 à 4 éléments ont montré peu ou pas trabeculation à 75 hpf. (D) Injection de gata1a MO dans le poisson-zèbre a retardé la formation du réseau trabéculaire. (E) coinjection de gata1a MO et humain d’ADN messagère Nrg1 partiellement restauré trabeculation 75 hpf. (F) coinjection de gata1a MO et humain d’ADN messagère Nrg1 presque entièrement restauré le réseau trabéculaire à 100 hpf. (G) wea mutant à 100 hpf montre aucune trabeculation et une paroi ventriculaire lisse. (H) Injection de humaine Nrg1 dans le poisson-zèbre mutant wea partiellement restauré trabeculation à 100 hpf. (I) l’Injection de tnnt2a MO a montré aucune trabeculation à 75 hpf (non illustré) et 100 hpf. (J) CLO mutant a montré aucune trabeculation à 100 hpf. (K) l’Injection de l' gata1a MO réduit significativement l’expression de l’ARNm de Notch1, Nrg1 et Jag2 (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs contrôle). Coinjection de gata1a MO et humain d’ADN messagère Nrg1 augmente significativement l’expression Notch1b, Nrg1, ErbB et Jag1 par rapport au témoin. (L) le mutant wea avait l’expression significativement plus faible de gènes liés à l’encoche (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs contrôle). Injection d’humain Nrg1 augmenté l’expression de gènes liés à l’encoche ; Jag1 et Jag2 étaient significativement supérieurs de contrôle. (M) , le mutant d’injection et clo tnnt2a MO a montré une significativement plus faible expression des gènes liés à l’encoche (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs contrôle). Barreaux de l’échelle : 50 μm. Les données apparaissent comme l’écart moyen. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Augmentation WSS dans manipulé TG(CMLC:GFP) poisson zèbre avec l’expression du gène Notch ligand, récepteurs et cible en vivo . Augmentant le WSS via la surexpression de l’hématopoïèse avec l’injection d’EPO(A) ou de l’adjonction de l’ISO, (B) , via l’augmentation du rythme cardiaque n’a pas augmenté trabeculation et disposait d’un réseau trabéculaire semblable à celle du contrôle. (C) l’injection d’EPO ARNm ou isoprotérénol n’a pas changé l’expression des gènes de ligand, récepteurs ou target Notch (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs contrôle). Ce chiffre a été modifié par Lee et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Cellules endothéliales soumis à la contrainte de cisaillement oscillatoire ou pulsatile à la vitro . HAECs soumis à la contrainte de cisaillement pulsatile de τmoyenne = 30 x 10-5 n/s à 1 Hz avait surexprimés gène Notch liés expressions et diminuée des expressions génétiques liées à cran lorsque l’inhibiteur de la ADAM10 a été appliquée (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs control). Ce chiffre a été modifié par Lee et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effet de trabeculation de la fraction de raccourcissement et d’éjection fractionnaire. (A-C) Ajout de AG1478 et gata1a MO diminue significativement le raccourcissement fractionnaire à 100 améliore, hpf, mais coinjection de humaines Nrg1 et gata1a MO. (D) gata1a injection et AG1478 diminuent significativement le raccourcissement fractionnaire à 100 hpf (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs contrôle). Coinjection de gata1a et de l’ARNm Nrg1 amélioré le raccourcissement fractionnaire. (E-F) Intégration de l’algorithme de synchronisation 4D avec LSFM montre que les AG1478 et gata1a MO avaient augmenté fin des volumes systoliques et diastoliques 75 hpf (E) et 100 hpf (F). Les données apparaissent comme l’écart moyen. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Poisson zèbre Jag1 Vers l’avant CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Vers l’arrière CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Jag2 de poisson-zèbre Vers l’avant AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Vers l’arrière GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Poisson zèbre Dll4 Vers l’avant CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Vers l’arrière CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
BMP10 de poisson-zèbre Vers l’avant GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Vers l’arrière TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Poisson zèbre ErBb2 Vers l’avant GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Vers l’arrière AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Poisson zèbre Nrg-1 Vers l’avant GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Vers l’arrière CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Notch1b de poisson-zèbre Vers l’avant CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Vers l’arrière GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tableau 3 : Amorces utilisées pour le dépistage de poisson-zèbre.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré que l’imagerie 4D peut être utilisé pour suivre le développement d’un réseau trabéculaire en réponse à l’évolution des forces biomécaniques. En particulier, la contrainte de cisaillement expérimentés par les cellules endothéliales initie l’encoche signalisation cascade, qui à son tour favorise la trabeculation. Dans ce manuscrit, nous avons démontré que (1) injection de gata1a MO a diminué l’hématopoïèse et donc il a réduit la contrainte de cisaillement mur, (2) tnnt2a MO injection inhibe la fonction contractile ventriculaire afin de réduire la contrainte de cisaillement de mur et wea (3) mutants n’avait pas la contraction auriculaire, ce qui diminue la force hémodynamique sur le ventricule. En réduisant la contrainte de cisaillement sur les parois cardiaques, nous avons quantifié la signalisation Notch via qRT-PCR et constaté qu’avec WSS réduite, il y avait réduit la signalisation Notch. Pour encore prouver notre hypothèse, mutants de clo qui manquaient endocarde ne forment pas de colonnes charnues, et soumettant les cellules endothéliales pulsatile de cisaillement avec ADAM10 présents ont montré que la contrainte de cisaillement active la signalisation Notch.

Les autres techniques d’imagerie telles que la microscopie confocale permet aux échantillons d’image en 3-d14. Cependant, cette technique et autres ont beaucoup d’inconvénients. Par exemple, l’imagerie confocale ne peuvent pénétrer profondément dans les échantillons, a la basse résolution axiale et lent balayage vitesses19,42. En raison de la limite de profondeur de pénétration dans l’imagerie confocale, petits échantillons, tels que des embryons de poisson-zèbre, peuvent seulement être photographiées dans son intégralité. Microscopie confocale biphotonique améliore la profondeur de pénétration, mais la résolution, vitesse de balayage lent et coût élevé font de cette technique indésirables13. Il y a eu des études qui combinent avec succès les microscopie biphotonique et LSFM18, cependant, les inconvénients sont encore importants42.

LSFM, a d’autre part, le moins photo-blanchiment et dommages13,18,42, vitesse d’acquisition rapide et même pénétration profondeur13. En outre, en raison du doubles lentilles et l’excitation d’un seul plan (Figure 1), le bruit de fond est considérablement réduit43. Toutefois, les échantillons doivent être incorporées dans les gels d’immobiliser l’échantillon, ce qui le rend difficile à appliquer en vivo modèles autres que le poisson-zèbre14,17,19. En outre, l’utilisation de la lumière fluorescente limite la pénétration en profondeur de quelques millimètres. Même si LSFM est une bonne méthode pour la visualisation, il est essentiel qu’elle est complétée par des données quantitatives. LSFM étant uniquement qualitative, elle peut être sujette à diverses interprétations. Par qRT-PCR, nous avons pu confirmer que les images de 4D LFSM étaient une représentation correcte des événements qui se produisent dans les échantillons vivants. Parfois dans plus grands échantillons, rayures et ombres peuvent se former dans les images. Cependant, les illumination recto-verso ou mSPIM peut être utilisé pour réduire ces artefacts42. LSFM étant tellement polyvalent, sa capacité de capture de haute résolution et des images de meilleure qualité dans l’ensemble rend l’avenir LSFM prometteur. A été mentionné précédemment, LSFM est cumulable avec d’autres systèmes d’imagerie pour la réussite d’imagerie18,42.

Nous avons démontré précédemment que l’application d’une contrainte de cisaillement pulsatile de des 23 x 10-5 N à 1 Hz pendant 24 h sensiblement augmente Notch signalisation in vitro(Figure 4)17. De plus, nous avons démontré que les forces de cisaillement activent la signalisation Notch par manipulation génétique de l’hématopoïèse (gata1a MO)4, contraction cardiaque (tnnt1a MO)5, contraction auriculaire (wea mutant), endocardique suppression (clo mutant) et localisation de la protéine Notch signalisation (Tg [flk:mCherry ; tp1:gfp]). Nous décrivons ici qu’en abaissant la contrainte de cisaillement du mur dans le ventricule, que les gènes liés à l’encoche ont été diminuées (Figure 2, K, L, M). En outre, nous avons pu démontrer que Nrg1 ARNm a pu sauver des trabeculation, de rétablir la signalisation Notch et améliorer ventriculaire raccourcissement fractionnaire et fraction d’éjection (Figure 2E, F, H, K-M, Figure 5) . La restauration de la fonction cardiaque a été démontrée par l’augmentation contractiles induite par la fonction hémodynamiques forces qui a activé le cran de signalisation (Figure 2 K- M).

Nous avons également déterminé que la signalisation d’encoche activés par la contrainte de cisaillement est dépendante endocardique. À l’aide de gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutant ou traitement AG1478, trabeculation est inhibée et la signalisation Notch diminuées (Figure 2 K- M). Mais, Nrg1 sauvé trabeculation et la signalisation Notch chez wea mutants et quand injecté conjointement avec gata1a MO (Figure 2D, H, K, L). Lorsque la contrainte de cisaillement de mur (injectiond’EPO ) ou Notch (10 pg/nL Nrg1 injection) de signalisation a été augmenté, il n’y avait aucun changement dans le groupe de l’OEB en ce qui concerne la morphologie, mais la morphogenèse ventriculaire anormale était présente dans la Nrg1 dose accrue (Figure 3).

En conclusion, nous avons montré que la mécanotransduction de contrainte de cisaillement active l’encoche voie de signalisation. En appliquant LSFM 4D et poisson zèbre génétiquement modifiée, nous avons développé un nouveau système de modèle qui montre l’importance débit sanguin est pendant le développement cardiaque à sa morphologie, la contractilité et la fonction globale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier William Talbot, de l’Université de Stanford pour la fourniture de l’homme Nrg1 ADNc et Deborah Yelon de UCSD pour fournir les WEA mutants de . Les auteurs aimeraient également remercier Cynthia Chen avec acquisition d’images. Cette étude a été financée par des subventions HL118650 NIH (à T.K. Hsiai), HL083015 (de T.K. Hsiai), HD069305 (à N.C. Chi et T.K. Hsiai.), HL111437 (pour Hsiai de T.K. et N.C. Chi), HL129727 (de T.K. Hsiai), T32HL007895 (à R.R. Sevag Packard), HL 134613 (à V. Messerschmidt) et Université du Texas système étoiles financement (de J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Bio-ingénierie numéro 138 microscopie illumination plan sélectif signalisation Notch trabeculation hémodynamique zebrafish développement cardiaque contrainte de cisaillement imagerie cardiaque 4 dimensions mécanobiologie coeur microscopie de fluorescence de nappe de lumière

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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