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Bioengineering

प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विकासशील Zebrafish दिल पर कतरनी तनाव मॉडुलन के प्रभाव के 4 आयामी छवियों पर कब्जा करने के लिए

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां, हम 4-आयाम (4-डी) में zebrafish में दिल के विकास की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । 4-डी इमेजिंग, प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) के माध्यम से, समय के साथ 3 आयामी (3-डी) छवियों लेता है, विकासशील दिलों को फिर से संगठित करने के लिए । हम गुणात्मक और मात्रात्मक बताते है कि कतरनी तनाव endocardial पायदान सक्रिय करता है चैंबर के विकास के दौरान संकेतन, जो हृदय trabeculation को बढ़ावा देता है ।

Abstract

hemodynamic दिल प्रभाव हृदय विकास, विशेष रूप से trabeculation, जो मायोकार्डियम से शाखाओं में बंटी का एक नेटवर्क रूपों द्वारा अनुभवी बलों । आनुवंशिक रूप से संकेतन झरना में कार्यक्रम दोष वेंट्रिकुलर दोषों में शामिल है जैसे वाम वेंट्रिकुलर गैर-संपीड़न Cardiomyopathy या Hypoplastic छोड़ दिया दिल सिंड्रोम । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, यह निर्धारित किया जा सकता है कि कतरनी तनाव trabeculation और पायदान संकेतन प्रेरित एक दूसरे से संबंधित हैं । प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, विकासशील zebrafish दिल के दृश्य संभव था । इस पांडुलिपि में, यह आकलन किया गया था कि hemodynamic बलों पायदान संकेतन के माध्यम से trabeculation की दीक्षा मिलाना और इस प्रकार, प्रभाव सिकुड़ा समारोह होता है । गुणात्मक और मात्रात्मक कतरनी तनाव विश्लेषण के लिए, 4 डी (3-डी + समय) छवियों zebrafish कार्डियक morphogenesis के दौरान अधिग्रहीत किया गया था, और 4-डी तुल्यकालन के साथ एकीकृत प्रकाश-पत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वेंट्रिकुलर गति पर कब्जा कर लिया. रक्त चिपचिपापन gata1a-morpholino oligonucleotides के माध्यम से कम हो गया था (मो) सूक्ष्म इंजेक्शन कतरनी तनाव को कम करने के लिए, जिससे, नीचे पायदान संकेतन और क्षीणन trabeculation को विनियमित. सह gata1a मो के साथ Nrg1 mRNA के इंजेक्शन trabeculation बहाल करने के लिए पायदान से संबंधित जीन बचाया । करने के लिए कतरनी तनाव को प्रेरित पायदान सिग्नलिंग प्रभाव trabeculation की पुष्टि, cardiomyocyte संकुचन आगे tnnt2aके माध्यम से गिरफ्तार किया गया-एमओ hemodynamic बलों को कम करने के लिए, जिससे, नीचे पायदान लक्ष्य जीन को विनियमित करने के लिए एक गैर trabeculated विकसित मायोकार्डियम. अंत में, कतरनी तनाव उत्तरदायी पायदान जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का मंडन endothelial कोशिकाओं को गुणवाला प्रवाह के अधीन द्वारा आयोजित किया गया था । इस प्रकार, 4-डी प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी खुला hemodynamic सेना के निशान अंतर्निहित पायदान संकेतन और गैर के लिए नैदानिक प्रासंगिकता के साथ trabeculation-कॉंपैक्ट cardiomyopathy ।

Introduction

ऐसे hemodynamic कतरनी तनाव के रूप में यांत्रिक बलों, अच्छी तरह से कार्डियक morphogenesis में शामिल हैं । hemodynamic कतरनी बलों, रोधगलन और खांचे के जवाब में अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक (ए वी) वाल्व1भर में कतरनी तनाव की दिशा के साथ संरेखण में एक लहर की तरह trabecular नेटवर्क में विकसित । कार्डियक trabeculation सिकुड़ा समारोह और रोधगलन द्रव्यमान को बढ़ाने के लिए आवश्यक है2. पायदान संकेत मार्ग में उत्परिवर्तनों मानव और अंय रीढ़3में जन्मजात हृदय दोष में परिणाम । उदाहरण के लिए, gata1a4 और tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) को erythropoiesis कम दिखाया गया है, जबकि erythropoietin mRNA (ईपीओ)6 और Isoproterenol (ISO)7 वृद्धि लाल रक्त क्रमशः कोशिकाओं और दिल की दर, और इसलिए दीवार कतरनी तनाव (WSS) । इसके अलावा, ErbB2 संकेतन, पायदान के बहाव, cardiomyocyte प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है सिकुड़ा बल उत्पंन, जो बारी में8,9संकेतन सक्रिय हो जाता है । यह सुझाव दिया है कि कतरनी तनाव वेंट्रिकुलर विकास के लिए प्रेरित trabeculation संकेत पायदान नियंत्रित करता है । वर्तमान में, वहां कई अध्ययनों कि आगे आनुवंशिक प्रोग्रामिंग जंमजात हृदय दोष (CHD)10,11,12के लिए अग्रणी घटनाओं को समझने की कोशिश कर रहे हैं, लेकिन बहुत कम जांच कर रहे है कैसे यांत्रिक बलों के गठन दिल को प्रभावित करते हैं ।

endocardium पर अभिनय करने वाले यांत्रिक बलों की जांच के लिए, विकासात्मक अवधि के दौरान निकट अवलोकन को कार्यान्वित किए जाने की आवश्यकता है । हालांकि, यह पारंपरिक माइक्रोस्कोपी13के inherence के कारण vivo पिटाई के नमूनों में अच्छी गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. आदेश में समय पर एक नमूना के भीतर विकास का निरीक्षण करने के लिए, शारीरिक अनुभाग और धुंधला, इसलिए,13,14,15होने की जरूरत है । हालांकि फोकल माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से14नमूनों की 3-डी संरचना छवि के लिए प्रयोग किया जाता है,16, इन इमेजिंग ' सिस्टम अधिग्रहण अभी भी धीमी गति से स्कैनिंग द्वारा सीमित है ।

लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) एक अनूठी इमेजिंग तकनीक है जो vivo गतिशील घटनाओं में लंबे समय से काम कर दूरी13के दृश्य की अनुमति देता है । इस तकनीक को एक प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है ऑप्टिकली अनुभाग एक नमूना17। रोशनी के केवल नमूने पर प्रकाश की एक पतली चादर के कारण, वहां फोटो-ब्लीचिंग और फोटो विषाक्तता में कमी है13,18। देखने के बड़े क्षेत्र और लंबे समय से काम कर दूरी के लिए बड़े नमूनों के लिए अनुमति देता है बरकरार रहने के रूप में वे13,14,17छवि बना रहे हैं । कम इज़ाफ़ा एक बड़ा क्षेत्र के लिए छवि बनाई जा करने के लिए अनुमति देता है, जबकि लंबे समय से काम कर दूरी के लिए अनुमति देता है मोटा नमूनों के लिए संकेत-शोर अनुपात समझौता किए बिना छवि है । कई समूहों छवि पूरे भ्रूण17, दिमाग14,18, मांसपेशियों और अंय ऊतकों के बीच19 दिलों को LSFM का इस्तेमाल किया है, नमूनों की विविध प्रकार है कि छवि जा सकता है दिखा ।

हालांकि पिछले अनुसंधान zebrafish दिल की बहिर्वाह या बहिर्वाह पटरियों occluding द्वारा कम hemodynamic कतरनी बल का प्रदर्शन किया, जानकारी केवल गुणात्मक है । यह एक असामान्य तीसरे कक्ष में परिणाम, कार्डियक looping कम, और बिगड़ा वाल्व गठन20. 4-डी LSFM छवियां जिस तरह से hemodynamic कतरनी बलों कार्डियक ऊतक के विकास को प्रभावित करने में एक नया परिप्रेक्ष्य दे । इन यांत्रिक बलों बल के प्रति संवेदनशील संकेत अणुओं को सक्रिय करने और trabecular लकीरें के गठन के लिए प्रेरित कर सकते हैं । 4-डी इमेजिंग के जोड़े गए समय पहलू के कारण, एक वास्तविक समय में विकास में परिवर्तन ट्रैक करने में सक्षम है, जो नए खुलासे के लिए ले जा सकता है कि पहले किसी का ध्यान नहीं गया था । zebrafish इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल है क्योंकि वैज्ञानिकों केवल सेल सेल बातचीत बनाम एक पूरे हड्डीवाला पशु का पालन कर सकते हैं । ऑक्सीजन भी पूरे भ्रूण है, जो विकास संवहनी प्रणाली पर निर्भर करता है, स्तनधारी विकास के विपरीत बिना होने के लिए अनुमति देता है के माध्यम से फैलाना कर सकते हैं । हालांकि zebrafish दिल फेफड़े के अंगों, जो एक चार चैंबर दिल की आवश्यकता की कमी है, वहां हृदय जीन है कि zebrafish और21मनुष्यों के बीच संरक्षित कर रहे है की एक बड़ी संख्या है ।

इस पांडुलिपि में, हम विभिन्न परिस्थितियों में zebrafish दिलों में विकासशील trabeculae छवि के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का वर्णन कैसे. सबसे पहले, gata1a4 या tnnt2a5 राज्यमंत्री के इंजेक्शन के लिए रक्त चिपचिपापन कम करते थे, और इसलिए WSS । इसके बाद दिल की आकृति विज्ञान का दर्जा मिला । मछली के एक अलग समूह में, हम ईपीओ mRNA6 या isoproterenol7 प्रशासन द्वारा WSS वृद्धि हुई है और परिणाम मनाया । हम भी अलग गुणवाला या थरथरानवाला प्रवाह दरों के साथ एक सेल अध्ययन का आयोजन किया । इमेजिंग प्रत्येक समूह के बाद, हमने पाया है कि WSS संकेतन शुरू trabeculation पायदान के माध्यम से endocardium द्वारा महसूस किया ।

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Protocol

निंनलिखित तरीकों को उता और UCLA IACUC प्रोटोकॉल के अनुपालन में किया गया । इन प्रायोगिक समूहों का उपयोग ट्रांसजेनिक टीजी (cmlc2: gfp), wea (कमजोर atrium) या clo (cloche) म्यूटेंट: (क) वन्य-प्रकार (WT) नियंत्रण, (ख) gata1a मो, और (ग) tnnt2a मो इंजेक्शन (तालिका १) के साथ किया गया.

मॉडल नाम संशोधित जीन Phenotype संदर्भ
नियंत्रण जंगली प्रकार कोई N/A
टीजी (cmlc2: gfp) कार्डियक मायोसिन लाइट चेन हरित flourescence विशेष रूप से मायोकार्डियम में व्यक्त ३४
कम दीवार कतरनी तनाव कमजोर atrium (wea) उत्परिवर्ती Atrium-विशिष्ट मायोसिन heacy शृंखला Atrium अनुबंध नहीं कर सकते, कॉंपैक्ट निलय, मोटी रोधगलन दीवार, संकीर्ण लुमेन, dialated Atrium, ३७
Cloche (clo) उत्परिवर्ती N/A endocardium के पूर्ण हटाने, छोटे निलय, विद्यमान कार्डियक cushins के साथ unaturally बड़े atrium ४१
gata1a मो gata1a  लाल रक्त कोशिकाओं की कमी से एनीमिया 4
tnnt2a मो tnnt2a ३९
बढ़ी दीवार कतरनी तनाव ईपीओ mRNA कोई गंभीर polycythemia, परिचालित रक्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि, चिपचिपापन बढ़ा 6
Isoprotenerol कोई हृदय की दर में वृद्धि 7

तालिका 1: विवरण Zebrafish । परिभाषाएं और प्रयोगों में इस्तेमाल Zebrafish का वर्णन ।

1. अध्ययन सेटअप

  1. trabeculation बचाव के लिए Nrg1 और ईपीओ mRNA तैयार करें ।
    1. मानव Nrg1 सीडीएनए प्राप्त करना और एक दाता प्लाज्मिड से बढ़ाना.
      नोट: ह्यूमन Nrg1 सीडीएनए को स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी से विलियम टालबोट से भेंट की गई ।
      1. आवश्यक रिएजेंट और सामग्री ले लो, अर्थात् पीसीआर mastermix (में संग्रहित-20 डिग्री सेल्सियस), प्राइमर ( तालिका 2देखें) (में संग्रहित-20 ° c), एक पीसीआर प्लेट (कमरे के तापमान पर संग्रहीत), और एक 20 μL पिपेट (कमरे के तापमान पर संग्रहीत) । उदाहरण के उत्पादों के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
        Table 2
        तालिका 2: मानव Nrg1 क्लोनिंग के लिए प्राइमर ।
      2. 20 μL पिपेट का उपयोग करते हुए तपसिल में निर्धारित प्रत्येक प्राइमरी के लिए mastermix तैयार करें । triplicates के 1 सेट के लिए, mastermix के ३७.५ μL, डीएनए के 3 μL-फ्री वॉटर, प्राइमरी के ४.५ μL का उपयोग करें । अधिक triplicates के लिए, बस नमूनों की संख्या से गुणा ।
      3. काम समाधान मानव Nrg1 सीडीएनए (20 एनजी/μg एकाग्रता) के साथ प्राइमरी पट्टी में डीएनए मुक्त पानी इतना है कि वहां 10 μL प्रति अच्छी तरह से नमूना है ।
        नोट: सुनिश्चित करें कि 1.1.1 कदम के तहत प्रत्येक समाधान समान रूप से वितरित किया जाता है । प्रत्येक समाधान मिश्रण द्वारा pipetting ऊपर और नीचे से यह मत करो । क्रॉस-दूषण को रोकने के लिए, केवल एक नमूना के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें ।
      4. Aliquot ने Nrg1 सीडीएनए के साथ मिलकर 10 μL मल्टी चैनल पिपेट को पीसीआर प्लेट में मनचाहा कुंए से बाहर कर देना चाहा ।
      5. कुएं में सीडीएनए को mastermix के १४.५ μL जोड़ें । कुएं को सील करने के लिए पीसीआर प्लेट पर स्टिकी कवर लगाएं, और पीसीआर मशीन में रखें ।
      6. पीसीआर मशीन शुरू और यह सुनिश्चित करें कि चक्र एंजाइमों और इस्तेमाल किया प्राइमरों के अनुसार उचित तापमान तक पहुंचता है ।
    2. क्लोन प्लाज्मिड pCS2 में Nrg1 सीडीएनए+ BamHI और EcoRI साइटों पर अतिरिक्त एंजाइमों का उपयोग BamHI और EcoRI सुनिश्चित करने के लिए सीडीएनए सभी ligated में plasmids है ।
      1. दाता प्लाज्मिड pCS2+, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मास्टर मिक्स समाधान और प्राइमर (तालिका 2) के साथ Nrg1 सीडीएनए मिश्रण ।
        नोट: कुल प्रतिक्रिया मात्रा ५० μL मास्टर मिक्स के 25 μL के साथ होना चाहिए, प्राइमरों के 3 μL और μL प्लाज्मिड के साथ 20 एनजी/Nrg1 दाता सीडीएनए के 1 μL ।
      2. पीसीआर मशीन में कदम 1.1.2.1 से मिश्रण प्लेस और निम्नलिखित विनिर्देशों को पूरा करने के लिए मापदंडों सेट: 5 या 15 एस के लिए 10 एस, ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए ९८ ° c, और ७२ ° c 5 s/
      3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक शुद्धि किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें । Elute में उत्पाद ५० μL का रेफरेंस बफर है ।
      4. शुद्ध पीसीआर उत्पाद और pCS2 के 5 μg+ BamHI और EcoRI के साथ अलग से ३७ ° c में एक २०० μL प्रतिक्रिया मात्रा में 2 घंटे के लिए डाइजेस्ट । परिणामस्वरूप पाचन को एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध करें और 20 μL और Tris-एचसीएल (पीएच ८.५) के १०० μL में क्रमशः elute ।
      5. Ligate 4 μL के Nrg1 सीडीएनए और 2 μL के पच pCS2+ प्लाज्मिड के साथ एक 25 μL प्रतिक्रिया में एक μL उत्प्रेरक के 16 ° c रातोंरात पर ligase ।
        नोट: प्रक्रिया रातोंरात गर्मी के लिए यहां रोका जा सकता है ।
      6. चरण 1.1.2.5 से बंधाव समाधान का उपयोग 2 μL और ई. कोलाई बैक्टीरिया कोशिकाओं की क्लोनिंग के लिए उपयुक्त की ५० μL में बदलना ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. पुष्टि करें कि परिवर्तन पीसीआर का उपयोग कर Nrg1 सीडीएनए क्लोन को परखने के द्वारा हुई । यादृच्छिक पर क्लोन चुनें और विशिष्ट प्राइमरों, पोलीमरेज़, और deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) के एक समाधान में जोड़ें ।
      नोट: नियंत्रण वेक्टर (pCS2+) के साथ और बिना डालने (मानव सीडीएनए) थे । एक कॉलोनी के बहुत बड़े मत उठाओ क्योंकि अत्यधिक बैक्टीरिया पीसीआर को बाधित कर सकते हैं ।
      1. 2 तालिकासे पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर परिवर्तन और स्क्रीन pCS2+-Nrg1 क्लोन से 8 कालोनियों उठाओ ।
      2. संस्कृति एक क्लोन Nrg1 सीडीएनए के साथ pCS2 को अलग करने के लिए+-Nrg1 प्लाज्मिड डीएनए । pCS2 के साथ ई. कोलाई बैक्टीरिया के १०० μL के साथ Inoculate+-Nrg1 प्लाज्मिड पौंड मीडिया के १०० मिलीलीटर में, और संस्कृति मिलाते हुए (१६०-२२५ RPM) ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. Transfect शुद्ध pCS2+-Nrg1 प्लाज्मिड में HEK-२९३ कोशिकाओं में एक 6 अच्छी तरह से थाली में एक वाणिज्यिक अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    5. अभिकर्मक के बाद 24 ज, एक lysis बफर का उपयोग कर कोशिकाओं लाइसे और एक एसडीएस-पृष्ठ जेल के माध्यम से चलाने के लिए, एक जेल झिल्ली को स्थानांतरित, और फिर विरोधीNrg1 एंटीबॉडी22के साथ दाग । एक पश्चिमी दाग का उपयोग कर Nrg1 प्रोटीन अभिव्यक्ति सत्यापित करें ।
      नोट: नियंत्रण एक खाली pCS2+ प्लाज्मिड है । यहां रोका जा सकता है अगर जेल झिल्ली हस्तांतरण रातोंरात होता है ।
    6. एक वाणिज्यिक उत्पाद सामग्री की तालिका में इसी तरह का उपयोग कर Nrg1 mRNA संश्लेषित और निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
      1. जीवाणु पृथक संस्कृति से pCS2+-Nrg1 डीएनए के 5 μL ले लो, और नोति के साथ एक २०० μL प्रतिक्रिया में ३७ ° c linearize प्लाज्मिड करने के लिए 2 ज के लिए डाइजेस्ट ।
      2. Tris-HCl (pH ८.५) के 20 μL में एक कमर्शियल किट और elute के साथ रेखीय प्लाज्मिड को शुद्ध करें ।
      3. इन विट्रो प्रतिलेखन में एक वाणिज्यिक आरएनए अलगाव किट के साथ एक 20 μL प्रतिक्रिया के 5 μL का उपयोग करते हुए निर्माता के निर्देशों के बाद रैखिक प्लाज्मिड.
      4. जोड़ें Nrg1 में ३५० आरएनए lysis बफर के μL के लिए लिखित और फिर एक आरएनए अलगाव किट के साथ शुद्ध । आरएनए को Tris-एचसीएल (pH ८.५) के ६० μL में Elute ।
      5. आरएनए एकाग्रता को मापने और भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    7. ईपीओ सीडीएनए और mRNA तैयारी के लिए ऊपर दिए गए चरणों 1.1.6.1-1.1.6.5 का पालन करें, लेकिन सीडीएनए में pCS2 + प्लाज्मिड और EcoRI साइटों पर क्लोन करने के बजाय ।
  2. zebrafish में Morpholino इंजेक्षन
    1. डिजाइन23 मो इंजेक्शन का उपयोग कर एक ऑनलाइन उपकरण (सामग्री तालिका) के ATG अनुक्रम के खिलाफ gata1a4 (5 ′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ′) और 5 tnnt2a (5 ′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ′) ।
    2. nuclease-मुक्त पानी के लिए अलग से gata1a और tnnt2a मो जोड़ें 8 एनजी/nL और 4 एनजी/nL के अंतिम सांद्रता, क्रमशः बनाने के लिए । ईपीओ mRNA के साथ एक अंतिम एकाग्रता के साथ दोहराएँ 20 स्नातकोत्तर/nL. सुनिश्चित करें कि अंतिम मात्रा 1 मिलीलीटर है ।
    3. 1 nL के 8 एनजी/nL के gata1a मो और 1 nL के 4 में nL मो के 4-सेल चरण के लिए tnnt2a की दीवार कतरनी तनाव (WSS) को कम करने के लिए 1 से 2 zebrafish । WSS बढ़ाने के लिए, 1-to 4-सेल स्टेज पर zebrafish भ्रूण में ईपीओ mRNA6 के 20 स्नातकोत्तर/nL के 1 nL इंजेक्षन ।
  3. रासायनिक उपचार zebrafish को बाधित trabeculation
    1. एक 20 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, 10 मिलीग्राम/एमएल AG1478 में 1% DMSO में 5 माइक्रोन के एक अंतिम एकाग्रता के लिए E3 मध्यम में पतला 30 hpf में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब । एक नियंत्रण के रूप में, 1% DMSO के साथ ही प्रत्येक मछली का इलाज ।
    2. जोड़ें n-[n-(3, 5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butyl एस्टर (DAPT) में 1% DMSO (१०० माइक्रोन) के लिए E3 मध्यम एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ४० hpf में संकेतन एक समान फैशन में पायदान बाधित करने के लिए । एक नियंत्रण के रूप में, केवल 1% DMSO के साथ इलाज ।

2. इमेजिंग तकनीक

  1. 4-डी कार्डियक LSFM इमेजिंग सिंक्रनाइज़ेशन एल्गोरिथ्म के साथ
    1. 2-कई हृदय की धड़कन चक्र के नीचे दिए गए चरणों का उपयोग कर साइकिल पर पूरे मछली भ्रूण की दो-डी छवियों ले लो (चित्रा 1) । सुनिश्चित करें कि लाइट-शीट की मोटाई लगभग 5 माइक्रोन है । लो ५०० एक्स-y फ्रेम के एक जोखिम समय के साथ 10 सुश्री सेट z-Nyquist नमूना25सिद्धांत के अनुसार दोषरहित डिजिटल नमूने के लिए 1 माइक्रोन के लिए स्कैनिंग ।
      1. agarose के 1 g को जोड़कर 1% (w/v) agarose जेल बनाएं और इसे तब तक गर्म करें जब तक कि सभी agarose भंग न हो जाएं । भ्रूण के साथ एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब लोड और एक 20 μL पिपेट का उपयोग कर agarose और मंच पर यह सुरक्षित ।
      2. छवि को देखने के सॉफ्टवेयर खोलें और नमूना के लाइव दृश्य देखने के लिए लाइव क्लिक करें । नमूना ध्यान में है ताकि घुंडी का उपयोग कर उद्देश्य को समायोजित करें. इसी तरह स्टेज को मूव करें ताकि सैंपल के लाइव व्यू भ्रूण के ऊपर से पता चल सके ।
      3. 5 एस के लिए ५०० बार छवियां ले लो 10x के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3.
      4. एक नई परत (z-अक्ष में 1 माइक्रोन) और इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराने के लिए मोटर का उपयोग कर मंच हटो ।
      5. जब तक पूरे दिल पूरी तरह से छवि है 2 कदम ऊपर दोहराएं ।
    2. प्रथम और अंतिम कार्डियक चक्र छवियों की अवहेलना करके डेटा अखंडता सुनिश्चित करें । कार्डियक चक्र में एक ही समय बिंदु पर लिया गया था कि छवियों मिलान द्वारा कार्डियक चक्र की अवधि का पता लगाएं, लेकिन विभिन्न अवधि में. अवधि ढूँढने के लिए विकसित किया गया था निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      Equation 11
      जहां D लागत एक अवधि परिकल्पना फिटिंग के लिए इस्तेमाल समारोह है, मैं कब्जा कर लिया छवि एम , τ ' समय छवि पर कब्जा कर लिया था, z कश्मीर छवि के दिशा सूचकांक, एक्सएम है पिक्सेल सूचकांक के सदिश, और टी ' आवधिक परिकल्पना है ।
    3. समान चरणों में दो चित्रों के बीच संबंधित shift ढूँढने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      Equation 22
      जहां क्ष' कश्मीर, कश्मीर के रिश्तेदार बदलाव के लिए एक लागत समारोह के अर्थ, आर संभव स्थानिक पड़ोस है, एल छवि पर कब्जा करने का कुल समय है, एक्स पिक्सेल सूचकांक है, zकश्मीर और z' कश्मीर पहली और दूसरी z-दिशा स्लाइसें हैं, टी समय है, और एस सापेक्ष बदलाव परिकल्पना है ।
    4. पहले छवि के संबंध में निरपेक्ष बदलाव के सापेक्ष बदलाव कन्वर्ट और रैखिक छद्म व्युत्क्रम दृष्टिकोण का उपयोग कर समीकरण को हल करने के लिए, छवियों के अगले भाग के रूप में पहले27वर्णित संरेखित करने के लिए निरपेक्ष संबंध खोजने के लिए ।
    5. अंतिम 4-डी छवियों छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर संसाधित किया गया ।
      1. 3-डी में 2-डी छवियां स्टैक कर रहा है
        1. एक वाणिज्यिक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर खोलें ।
        2. डेटा खोलेंक्लिक करें ।
        3. 3-डी > क्लिक लोडमें खड़ी होने के लिए सभी छवियों का चयन करें ।
        4. voxel आकार में जोड़ें ०.६५ x ०.६५ x 1 > क्लिक करें ok।
        5. 3-डी छवि को विज़ुअलाइज़ करने के लिए Multi-Planar दृश्य बॉक्स क्लिक करें ।
        6. राइट-क्लिक करें ब्लू slice_1. tiff बॉक्स > का चयन करें प्रदर्शन > Volrenचयन करें ।
        7. संपादन > विकल्प का चयन करें > संपादितकरेंक्लिक Colormap ।
        8. लाल में उल्लिखित बक्सों का उपयोग करके रंग समायोजित करें > ' ठीक ' ।
      2. 3-डी को 4-डी में कनवर्ट करना
        1. "फ़ाइल > ओपन टाइम सीरीज डेटापर क्लिक करें ।
        2. 3-डी झगड़े का चयन करें जो अभी किए गए थे > क्लिक करें लोड।
        3. पहले की तरह ही voxel आकार दर्ज करें ।
        4. राइट क्लिक करें ब्लू slice_1. tiff बॉक्स > का चयन करें "प्रदर्शन" > Volrenचयन करें ।
        5. संपादन > विकल्प का चयन करें > संपादितकरेंक्लिक Colormap । बक्सों का उपयोग करके रंग समायोजित करें > ठीकक्लिक करे ।
        6. राइट क्लिक करें समय श्रृंखला नियंत्रण > मूवी मेकर क्लिक करें > फिल्म देखने के क्रम में प्ले बटन दबाएँ.
        7. कोई फ़ाइल नाम, फ़्रेम आकार, फ़्रेम दर, गुणवत्ता 1 के बराबर जोड़ें, प्रकार Monoscopic > क्लिक करें लागू
        8. वीडियो निर्यात करें । वीडियो को किसी उपयुक्त सॉफ़्टवेयर में खोलें ।

3. qRT-पीसीआर विश्लेषण

  1. Zebrafish दिल आरएनए अलगाव पायदान लाइगैंडों, रिसेप्टर्स, और लक्ष्य ' जीन भाव को बढ़ाता है
    1. zebrafish को tricaine मिथाइलेट28,29के ओवरडोज़ के अधीन करके कुर्बान कर दें । एक पहले वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग30, zebrafish दिल और आबकारी के लिए तैयार आरएनए अलगाव थे ।
    2. कुल शाही सेना को अलग, और निर्माता के निर्देशों का पालन सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर सीडीएनए के संश्लेषित ।
    3. पायदान लाइगैंडों Jag1, Jag2, Dll4, रिसेप्टर Notch1b, और सिग्नलिंग संबंधित जीन Nrg1 और ErbB2के लिए पीसीआर प्राइमरों डिजाइन । हम इस्तेमाल प्राइमरों के लिए तालिका 3 देखें ।
    4. कदम 3.1.3 से प्राइमरों जोड़ें, 3.1.2 कदम से पृथक mRNA, और पीसीआर प्लेट के लिए एक वाणिज्यिक mastermix । उपयुक्त तापमान और समय पर इस्तेमाल किया एंजाइमों के अनुसार qRT-पीसीआर चलाते हैं । zebrafish α-actin करने के लिए परिणामों को सामान्य करें ।
      नोट: यह लाइगैंडों, रिसेप्टर्स, और जीन में से प्रत्येक के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की गणना करेगा.

4. इन विट्रो ह्यूमन महाधमनी Endothelial सेल (HAEC) गडबड

  1. गतिशील कतरनी तनाव मॉडल
    1. HAEC कल्चर मीडिया के साथ कल्चर HAEC सेल । एक बार पूरी तरह से धाराप्रवाह, लामिना प्रवाह और गुणवाला प्रवाह के लिए कोशिकाओं को बेनकाब 23 x 10-5 N की दर से 24 ज के लिए 1 हर्ट्ज ।
      1. चुनाव आयोग मीडिया को गर्म/DMEM 10% 20 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में FBS ।
      2. तरल नाइट्रोजन टैंक से HAEC कोशिकाओं को पुनः प्राप्त और पानी के स्नान में पिघल तक शीशी जगह ।
      3. एक १,००० μL पिपेट का उपयोग कर, गल कोशिकाओं को हटा दें और उंहें मीडिया के 3-5 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया । 3 मिनट के लिए ५३ x g पर सेल समाधान केंद्रापसारक ।
      4. महाप्राण समाधान बंद करें और 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए पर्याप्त मीडिया जोड़ें । एक बाँझ T75 कुप्पी के लिए सेल समाधान जोड़ें, कुप्पी टोपी, और प्लेट के तल पर समान रूप से कोशिकाओं को वितरित.
      5. प्रथमाक्षर, दिनांक, कक्ष प्रकार, और गद्यांश संख्या के साथ चिह्नित करें । ३७ ° c, 5% सह2पर कुप्पी मशीन, जब तक कोशिकाओं ८०% धाराप्रवाह हैं । याद है हर 2-3 दिन मीडिया बदलने के लिए ।
      6. एक वाणिज्यिक पंप का प्रयोग, कुप्पी के लिए टयूबिंग देते हैं, और कदम में उपर्युक्त मानकों सेट शुू31,३२,३३।
    2. 30 मिनट के लिए 5 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता में HAEC मध्यम के ५० मिलीलीटर GI254023X जोड़ें ।
    3. पूर्व-मिश्रित GI254023X के साथ, एक ADAM10 अवरोध करनेवाला जो पायदान संकेत को दबा देता है, शुू में ही लामिना प्रवाह या गुणवाला प्रवाह प्रयोगों का संचालन करता है.
    4. मात्रा लाइगैंडों (Jag1, Jag2, और Dll4) और पायदान लक्ष्य जीन (भाजित के बालों और बढ़ाने [वह])qRT नमूनों के चार समूहों (HAEC प्रवाह, लामिना प्रवाह + लामिना, GI254023X प्रवाह, के लिए पीसीआर का उपयोग करते हुए गुणवाला प्रवाह + GI254023X) पहले३२वर्णित है ।

5. बचाव और पायदान संकेत की अधिक अभिव्यक्ति

  1. 5 स्नातकोत्तर/nL की एकाग्रता पर तैयार Nrg1 mRNA के 1 nL इंजेक्षन (कदम 1.1.6 से) 1-4- gata1a मो के साथ सेल चरण में क्रम में एक्सप्रेस पायदान लक्ष्य जीन24।
  2. एक समान तरीके से24 wea उत्परिवर्ती में Nrg1 mRNA के 1 nL इंजेक्षन ।
  3. Nrg1 mRNA (10 pg/nL) की एकाग्रता दोगुनी करें और zebrafish आकृति का निरीक्षण करने के लिए वेंट्रिकुलर में24 1 nL इंजेक्ट करें ।
  4. ईपीओ mRNA6 के 20 स्नातकोत्तर/nL के 1 nL इंजेक्षन 1-4 सेल स्टेज पर zebrafish भ्रूण में hematopoiesis को बढ़ाने के वेंट्रिकुलर WSS के रूप में पहले24दिखाया गया है ।
  5. ५० माइक्रोन Isoproterenol7के 1 nL इंजेक्षन, जो सिकुड़ना की दर बढ़ जाती है, के लिए E3 माध्यम के लिए 24 ज जबकि zebrafish के रूप में पहले24दिखाया संस्कृति रहे हैं.
  6. प्रत्येक समूह के लिए 4-डी LSFM इमेजिंग निष्पादित करें । 2.1.1-2.1.5.2.8 चरणों में दिए गए निर्देशों का पालन करें ।

6. आंशिक छोटा और समय के साथ मात्रा परिवर्तन के ठहराव

  1. ५०, ७५ और १०० hpf पर प्रत्येक समूह के लिए 4-डी LSFM इमेजिंग निष्पादित करें । 2.1.1-2.1.5.2.8 चरणों में निर्देशों का पालन करें । प्रत्येक छवि को विभाजित तो प्रत्येक कार्डियक वॉल गति की प्रतिकृति के लिए ६०० नोड्स है ।
  2. diastole और systole के दौरान निम्न सूत्र का उपयोग कर निलय के व्यास में परिवर्तन को मापने:
    Equation 33
    दृश्य सॉफ्टवेयर के साथ हर ०.१ एस पर 3 डी वेंट्रिकुलर छवियों लोड और मात्रा को मापने ।
  3. ७५ hpf और १०० hpf पर प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए समय के साथ मात्रा परिवर्तन प्लाट ।

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Representative Results

LSFM इस पांडुलिपि में इस्तेमाल के लिए उच्च संकल्प 2 डी और 3 डी तस्वीरें प्राप्त किया गया । के रूप में चित्रा 1a और 1bमें देखा, दीप्ति लेंस नमूना पर प्रकाश चादर का निर्देशन । हल्की चादर की अविरलता के कारण केवल एक ही विमान रोशन होता है । पता लगाने के लेंस सीधा रोशनी लेंस के लिए तैनात है और प्रबुद्ध विमान (आंकड़ा 1b) पर केंद्रित है । रोशनी लेंस से प्रकाश शीट तो सही करने के लिए बाएं से नमूना स्कैन (चित्रा 1C) । स्कैनिंग कम फोटो ब्लीचिंग, फोटो-विषाक्तता की अनुमति देता है, और एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात है ।

LSFM टीजी (cmlc2a: gfp) भ्रूण के लिए आवेदन किया गया था तेजी से स्कैनिंग (> 30 एस) ०.६५ x ०.६५ x 1 µm के एक voxel संकल्प के साथ पूरे हृदय संरचना३४ कल्पना । एक एकल विमान रोशनी के कारण, पृष्ठभूमि शोर काफी कम था (चित्रा १). Trabecular ७५ hpf में वेंट्रिकुलर लुमेन में फैला हुआ लकीरें, और एक Trabecular नेटवर्क स्पष्ट रूप से १०० hpf (चित्रा 2a, ख)में दिखाया गया था । Gata1a मो माइक्रो इंजेक्शन ९०%4,३५द्वारा hematopoiesis और चिपचिपापन कम कर दिया । यह कम चिपचिपापन तनु hemodynamic कतरनी तनाव, एक देरी दीक्षा और ७५ hpf और १०० hpf पर trabecular नेटवर्क के घनत्व में जिसके परिणामस्वरूप जब नियंत्रण समूह की तुलना में (चित्रा 2cडी) । इसके अलावा, पायदान लाइगैंडों(Dll4, Jag1, और Jag2), रिसेप्टर (Notch1b), और बहाव संकेत घटक (Nrg1 और ErbB2) नीचे थे gata1a मो के जवाब में विनियमित इंजेक्शन (p < ०.०५, n = 5) (चित्र 2k)2,8,३६. सह Nrg1 mRNA के 5 माइक्रोन के साथ gata1a मो के इंजेक्शन-विनियमित पायदान संकेतन संबंधित जीन अभिव्यक्ति और बचाया trabecular गठन पर ७५ hpf और १०० hpf (चित्रा 2E, एफ, कश्मीर) । इस प्रकार, gata1a मो hemodynamic नीचे करने के लिए अग्रणी बल कम-पायदान संकेतन के विनियमन, जबकि Nrg1 mRNA बचाव अप-विनियमित पायदान से संबंधित जीन और पुन: शुरू trabeculation ।

आदेश में आगे हमारी परिकल्पना है कि बदलते hemodynamic बलों और इस प्रकार trabeculation संकेतन पायदान के माध्यम से साबित करने के लिए, हम wea उत्परिवर्ती कि एक गैर सिकुड़ा atrium३७विकसित की शुरुआत की । अलिंद systole के दौरान वेंट्रिकुलर बहिर्वाह और hemodynamic बलों के अभाव में, wea म्यूटेंट एक्सप्रेस निचले कार्डियक mRNA स्तर के संकेत घटक जीन और लक्ष्य जीन नियंत्रण की तुलना में, और बंदरगाह गैर trabeculated, छोटे और कमजोर करार निलय (चित्रा 2जी, एल). हालांकि, Nrg1 mRNA माइक्रो wea म्यूटेंट में इंजेक्शन अप-संकेतन मार्ग, विनियमित trabecular लकीरें के आंशिक बचाव के साथ, एक गैर के बावजूद एक अधिक स्पष्ट सिकुड़ा निलय के लिए अग्रणी-सिकुड़ा atrium ( चित्रा 2H, एल)2. इस संदर्भ में, wea म्यूटेंट पुष्टि गैर सिकुड़ा atrium और एक गैर trabeculated निलय के बीच संबंध, पायदान संकेतन के माध्यम से hemodynamic के trabeculation मॉडुलन स्कोरिंग ।

Tnnt2a मो हृदय ट्रोपोनिन टी३८,३९बाधा द्वारा हृदय संकुचन बंद करने के लिए दिया गया था । tnnt2a मो इंजेक्शन मछली संचलन के पूरी तरह से रहित थे और वेंट्रिकुलर महत्वपूर्ण नीचे के कारण WSS-विनियमित पायदान संकेतन, एक चिकनी वेंट्रिकुलर सतह और पतली दीवार के लिए अग्रणी जब नियंत्रण समूह की तुलना में (चित्रा 2I, एम) . जांच करने के लिए कि endocardium पर WSS trabeculation के लिए एक आवश्यकता थी, हम भी cloche (clo) म्यूटेंट है जिसके लिए endocardium और दिल के endothelial अस्तर४०,४१विकसित नहीं है । clo उत्परिवर्ती कार्डियक trabeculae विकसित करने में विफल रहा है और दिखाया छोटे आकार निलय और अधूरा कार्डियक लूप (चित्रा 2J). इस प्रकार, endocardial अस्तर के लिए आवश्यक है hemodynamic कतरनी तनाव भावना को सक्रिय पायदान संकेतन (आंकड़ा 2 एम)। हालांकि, जब hemodynamic कतरनी तनाव बढ़ hematopoiesis या isoproterenol के उपचार सिकुड़ना बढ़ाने के लिए, पायदान से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि नहीं किया था, और trabecular नेटवर्क आकृतिक परिवर्तन नहीं किया (चित्रा 3)।

आगे कतरनी तनाव और पायदान संकेतन के बीच संबंध का प्रदर्शन करने के लिए, HAECs इन विट्रो परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया गया । endothelial कोशिकाओं द्वारा मनाया hemodynamic कतरनी तनाव अनुकरण करने के लिए एक गुणवाला प्रवाह धाराप्रवाह कोशिकाओं पर लागू किया गया था । यह दिखाया गया है कि स्थैतिक संस्कृति की तुलना में, गुणवाला संस्कृति पायदान की अभिव्यक्ति बढ़-संबंधित जीन (चित्रा 4)। इसके अलावा, ADAM10 अवरोधक के साथ उपचार काफी कम पायदान संकेत (चित्रा 4)।

अगले, हम गणना वेंट्रिकुलर आंशिक छोटा, और वेंट्रिकुलर गुहा समय के साथ मात्रा में जंगली प्रकार के लिए परिवर्तन, gata1a मो, AG1478, और उन ५० Nrg1, ७५ hpf पर hpf इंजेक्शन समूहों द्वारा बचाया, और १०० hpf (आंकड़ा 5 ए-सी) . ErbB संकेत अवरोधक, AG1478 के साथ उपचार, काफी देरी और कम आंशिक १०० hpf (चित्रा 5)पर वेंट्रिकुलर diastole के दौरान छोटा । दोनों gata1a मो और AG1478 उपचार संकुचन के दौरान वेंट्रिकुलर चैंबर आकार कम, के रूप में 4 में परिवर्तन द्वारा मूल्यांकन-डी LSFM (चित्रा 5E, एफ)। दोनों समूहों के एक वृद्धि की अंत सिस्टोलिक और-डायस्टोलिक मात्रा जब जंगली प्रकार की तुलना में विकसित की है । सह Nrg1 mRNA के gata1a मो के साथ इंजेक्शन दोनों आंशिक छोटा बहाल, और जंगली प्रकार के उन की ओर बेदखली अंश ।

Figure 1
चित्रा 1 : फ्लोरोसेंट प्रकाश शीट सिंहावलोकन । (क) प्रतिनिधि LSFM प्रणाली जहां नमूना रोशनी लेंस (आईएल) से प्रकाश चादर के चौराहे में रखा गया है और पता लगाना लेंस (डीएल) का पता लगाने के रास्ते । (ख) आईएल के पीछे बेलनाकार लेंस नमूना है, जो नमूने की एक पतली चादर उत्तेजित के भीतर माइक्रोन-आकार प्रकाश शीट (बैंगनी) बनाता है । पता लगाने के लेंस उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत रिकॉर्ड । (ग) पतली लेजर शीट की एक योजनाबद्ध (बैंगनी) ऑप्टिकली zebrafish भ्रूण जो सही करने के लिए छोड़ दिया जाता है अनुभाग । यह आंकड़ा ली एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : आनुवंशिक रूप से हेर वेंट्रिकुलर morphologies टीजी (cmlc: gfp) पायदान Ligand, रिसेप्टर, और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के साथ zebrafish । (क) trabecular नेटवर्क को नियंत्रण zebrafish के ७५ hpf पर दिखाया गया है. (ख) नियंत्रण zebrafish के १०० hpf पर trabecular नेटवर्क । (ग) gata1a मो के 1-4 सेल स्टेज पर इंजेक्शन ७५ hpf पर कोई trabeculation के लिए थोड़ा दिखाई दिया । (घ) zebrafish में gata1a मो के इंजेक्शन trabecular नेटवर्क गठन में देरी हुई थी. (ङ) gata1a मो और मानव Nrg1 mRNA की सह इंजेक्शन ७५ hpf पर आंशिक रूप से बहाल trabeculation. (च) gata1a मो और मानव Nrg1 के सह-इंजेक्शन mRNA लगभग पूरी तरह से १०० hpf पर trabecular नेटवर्क बहाल । (छ) wea उत्परिवर्ती १०० hpf पर कोई trabeculation और एक चिकनी वेंट्रिकुलर दीवार से पता चलता है । (ज) wea उत्परिवर्ती zebrafish में मानव Nrg1 के इंजेक्शन आंशिक रूप से १०० hpf पर बहाल trabeculation । (I) tnnt2a मो का इंजेक्शन ७५ hpf पर कोई trabeculation दिखाया (नहीं दिखाया गया) और १०० hpf. (ञ) clo उत्परिवर्ती १०० hpf में कोई trabeculation नहीं दिखाया । (K) gata1a मो के इंजेक्शन काफी कम mRNA अभिव्यक्ति की Notch1, Nrg1, और Jag2 (t-test, * P < ०.०५, n = 5 बनाम नियंत्रण) । gata1a मो और मानव Nrg1 mRNA के सह इंजेक्शन काफी Notch1b, Nrg1, ErbB, और नियंत्रण की तुलना में Jag1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई । (एल) wea उत्परिवर्ती पायदान से संबंधित जीन की काफी कम अभिव्यक्ति थी (टी परीक्षण, * P < ०.०५, n = 5 बनाम नियंत्रण) । मानव Nrg1 के इंजेक्शन से पायदान संबंधी जीनों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई; Jag1 और Jag2 नियंत्रण से काफी अधिक थे. (एम) tnnt2a मो इंजेक्शन और clo उत्परिवर्ती पायदान से संबंधित जीन की एक काफी कम अभिव्यक्ति दिखाया (टी परीक्षण, * P < ०.०५, n = 5 बनाम नियंत्रण) । स्केल बार्स: ५० माइक्रोन । डेटा को माध्य मानक विचलन के रूप में दिखाया जाता है. यह आंकड़ा ली एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : बढ़ा WSS में हेरफेर टीजी (cmlc: gfp) पायदान ligand, रिसेप्टर और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के साथ zebrafish वीवो में . ईपीओके इंजेक्शन(ए) या आईएसओ के अलावा (ख) में वृद्धि हृदय की दर के माध्यम से अधिक hematopoiesis की अभिव्यक्ति के माध्यम से WSS बढ़ती trabeculation वृद्धि नहीं हुई और एक trabecular नियंत्रण के समान नेटवर्क था । (ग) ईपीओ mRNA या Isoproterenol के इंजेक्शन पायदान ligand, रिसेप्टर या लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं किया (टी परीक्षण, * P < ०.०५, n = 5 बनाम नियंत्रण). यह आंकड़ा ली एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Endothelial कोशिकाओं थरथरानवाला या गुणवाला कतरनी तनाव के अधीन इन विट्रो में . HAECs के गुणवाला कतरनी तनाव के अधीन τऔसत = 30 x 10-5 n/s पर 1 हर्ट्ज पायदान से संबंधित जीन के भाव और downregulated के पायदान से संबंधित जीन के भाव को विनियमित था जब ADAM10 अवरोधक लागू किया गया था (टी परीक्षण, * P < ०.०५, N = 5 बनाम नियंत्रण) । यह आंकड़ा ली एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : आंशिक छोटा और बेदखली अंश के trabeculation का प्रभाव । (A-C) AG1478 और gata1a मो के अलावा काफी १०० hpf में आंशिक छोटा कमी आई है, लेकिन मानव Nrg1 और gata1a मो के सह इंजेक्शन यह सुधार हुआ । (घ) gata1a इंजेक्शन और AG1478 १०० hpf (t-test, * P < ०.०५, n = 5 बनाम नियंत्रण) में आंशिक छोटा करने में काफी कमी आई । gata1a और Nrg1 mRNA के सह इंजेक्शन आंशिक छोटा सुधार । (E-F) LSFM के साथ 4-डी तुल्यकालन एल्गोरिथ्म घालमेल से पता चला कि AG1478 और gata1a मो अंत सिस्टोलिक और डायस्टोलिक मात्रा ७५ hpf (E) और १०० hpf (एफ)में वृद्धि हुई थी । डेटा को माध्य मानक विचलन के रूप में दिखाया जाता है. यह आंकड़ा ली एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Zebrafish Jag1 आगे CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
पिछड़े CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafish Jag2 आगे AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
पिछड़े GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafish Dll4 आगे CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
पिछड़े CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafish BMP10 आगे GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
पिछड़े TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafish ErBb2 आगे GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
पिछड़े AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafish Nrg-1 आगे GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
पिछड़े CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafish Notch1b आगे CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
पिछड़े GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

तालिका 3: Zebrafish स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल प्राइमरों ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमें पता चला है कि 4-डी इमेजिंग के लिए यांत्रिक बलों में परिवर्तन के जवाब में एक trabecular नेटवर्क के विकास को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, कतरनी तनाव endothelial कोशिकाओं द्वारा अनुभवी पायदान संकेतन झरना है, जो बारी में trabeculation को बढ़ावा देता है शुरू करता है । इस पांडुलिपि में, हमें पता चला है कि (1) gata1a मो इंजेक्शन hematopoiesis कमी आई है और इसलिए यह दीवार कतरनी तनाव कम हो, (2) tnnt2a मो इंजेक्शन बाधित वेंट्रिकुलर सिकुड़ा समारोह दीवार कतरनी तनाव को कम करने के लिए, और (3) wea म्यूटेंट अलिंद संकुचन, जो तब निलय के लिए लागू hemodynamic बल में कमी आई । हृदय की दीवारों पर कतरनी तनाव को कम करके, हम qRT-पीसीआर के माध्यम संकेतन पायदान quantified और पाया कि कम WSS के साथ, वहां पायदान संकेतन कम था । आगे हमारी परिकल्पना साबित करने के लिए, clo म्यूटेंट कि कमी endocardium trabeculae फार्म का नहीं था, और endothelial के साथ गुणवाला कतरनी तनाव के लिए कोशिकाओं के अधीन उपस्थित दिखाया है कि कतरनी तनाव पायदान संकेत सक्रिय करता है ।

इस तरह के फोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में अंय इमेजिंग तकनीक 3 डी14में छवि नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इस तकनीक और दूसरों में कई कमियां हैं । उदाहरण के लिए, फोकल इमेजिंग गहराई से नमूनों में घुसना नहीं कर सकता, कम अक्षीय रिज़ॉल्यूशन है, और धीमी स्कैनिंग गति19,४२। क्योंकि फोकल इमेजिंग में प्रवेश गहराई सीमा के, छोटे नमूनों, zebrafish भ्रूण के रूप में, केवल अपनी संपूर्णता में imaged किया जा सकता है । दो-फोटॉन फोकल माइक्रोस्कोपी पैठ गहराई में सुधार, लेकिन संकल्प, धीमी गति स्कैनिंग, और उच्च लागत इस तकनीक13अवांछनीय बनाते हैं । वहां अध्ययन है कि दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी और LSFM सफलतापूर्वक18गठबंधन किया गया है, हालांकि, कमियां अभी भी प्रमुख४२हैं ।

LSFM, दूसरी ओर, कम से फोटो ब्लीचिंग और नुकसान13,18,४२, तेजी से अधिग्रहण की गति, और इसी तरह पैठ गहराई13है । इसके अतिरिक्त, दोहरी लेंस और एक एकल विमान (चित्रा 1)के उत्तेजना की वजह से, पृष्ठभूमि शोर काफी४३कम है । हालांकि, नमूनों को zebrafish14,17,19के अलावा vivo मॉडल में लागू करने के लिए कठिन बनाता है जो नमूना, स्थिर करने के लिए जैल में एंबेडेड करने की आवश्यकता है । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग कुछ मिलीमीटर के लिए गहराई पैठ सीमा । भले ही LSFM दृश्य के लिए एक महान विधि है, यह महत्वपूर्ण है कि यह मात्रात्मक डेटा के साथ पूरक है । क्योंकि LSFM केवल गुणात्मक है, यह विभिंन व्याख्याओं के अधीन किया जा सकता है । qRT-पीसीआर का उपयोग करके, हम पुष्टि कर सकते है कि LFSM 4-डी छवियों रहते नमूनों में होने वाली घटनाओं का सही प्रतिनिधित्व किया गया । बड़े नमूनों में कभी-कभार, धारियों और छाया छवियों में फार्म कर सकते हैं । हालांकि, दोहरे पक्षीय रोशनी या mSPIM इन कलाकृतियों४२को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । क्योंकि LSFM बहुत बहुमुखी है, उच्च संकल्प और समग्र बेहतर गुणवत्ता छवियों पर कब्जा करने की अपनी क्षमता LSFM के भविष्य का वादा करता है । पहले उल्लेख किया है, LSFM सफल इमेजिंग18,४२के लिए अंय इमेजिंग प्रणालियों के साथ जोड़ा जा सकता है ।

हम पहले से प्रदर्शन किया है कि 23 x 10-5 N के एक गुणवाला कतरनी तनाव 24 ज के लिए 1 हर्ट्ज पर काफी हद तक को विनियमित इन विट्रो मेंसंकेतन(चित्रा 4)17। हम आगे का प्रदर्शन किया है कि कतरनी बलों hematopoiesis (gata1a मो)4, हृदय संकुचन (tnnt1a मो)5, अलिंद संकुचन (wea उत्परिवर्ती), endocardial के आनुवंशिक हेरफेर द्वारा संकेतन पायदान सक्रिय विलोपन (clo उत्परिवर्ती), और पायदान संकेतन के स्थानीयकरण (टीजी [flk: mCherry; tp1: gfp]) । हम यहां वर्णन है कि निलय में दीवार कतरनी तनाव कम करके, कि पायदान से संबंधित जीन नीचे थे विनियमित (चित्रा 2k, एल, एम)। इसके अलावा, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि Nrg1 mRNA trabeculation को बचाने के लिए सक्षम था, पायदान संकेतन बहाल, और वेंट्रिकुलर आंशिक छोटा और बेदखली अंश (चित्रा 2E, एफ, एच, K-M, चित्रा 5) में सुधार . कार्डियक फंक्शन की बहाली सिकुड़ा समारोह में वृद्धि द्वारा दिखाया गया था-मध्यस्थता hemodynamic बलों है कि सक्रिय पायदान संकेतन (चित्रा 2k-एम).

हम यह भी निर्धारित किया है कि कतरनी तनाव सक्रिय पायदान संकेत endocardial निर्भर है । gata1a मो, tnnt2a मो, wea उत्परिवर्ती या AG1478 उपचार का उपयोग करके, trabeculation बाधित किया गया था और पायदान संकेतन नीचे विनियमित (चित्रा 2k-एम)था. हालांकि, Nrg1 बचाया trabeculation और पायदान wea म्यूटेंट में संकेतन और जब सह gata1a मो के साथ इंजेक्शन (2 डी चित्रा, एच, कश्मीर, एल)। जब दीवार कतरनी तनाव (ईपीओ इंजेक्शन) या पायदान संकेतन (10 स्नातकोत्तर/nL Nrg1 इंजेक्शन) वृद्धि हुई थी, आकृति विज्ञान के मामले में ईपीओ समूह में कोई परिवर्तन नहीं था, लेकिन असामान्य वेंट्रिकुलर morphogenesis Nrg1 में मौजूद था बढ़ी हुई खुराक (चित्रा 3)।

अंत में, हमें पता चला है कि कतरनी तनाव के mechanotransduction पायदान संकेतन मार्ग सक्रिय हो जाता है । 4-डी LSFM और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर zebrafish लागू करके, हम एक नया मॉडल प्रणाली है कि कैसे महत्वपूर्ण रक्त प्रवाह अपनी आकृति विज्ञान, सिकुड़ना, और समग्र समारोह के लिए हृदय विकास के दौरान है से पता चलता है विकसित की है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक मानव प्रदान करने के लिए स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय से विलियम टालबोट के प्रति कृतज्ञता व्यक्त करना चाहते हैं Nrg1 सीडीएनए प्रदान करने के लिए UCSD से दबोरा Yelon करने के लिए और wea म्यूटेंट । लेखक भी छवि अधिग्रहण के साथ मदद करने के लिए सिंथिया चेन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस अध्ययन को पलाश NIH HL118650 (to तपन Hsiai) द्वारा समर्थित किया गया था, HL083015 (ते तपन Hsiai), HD069305 (ते नेकां ची व तपन Hsiai.), HL111437 (ते तपन Hsiai व नेकां ची), HL129727 (ते तपन Hsiai), T32HL007895 (ते विद्यालयाजवळ. सेवग पैकार्ड), एचएल १३४६१३ (ते वि. Messerschmidt) व टेक्सास विश्वविद्यालय प्रणाली सितारे वित्त पोषण (जे ली के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विकासशील Zebrafish दिल पर कतरनी तनाव मॉडुलन के प्रभाव के 4 आयामी छवियों पर कब्जा करने के लिए
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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