Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera utveckla hjärtan i zebrafiskar i 4 dimensioner (4 D). 4-D imaging, via ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM), tar 3-dimensionell (3D) bilder över tid, att rekonstruera utveckla hjärtan. Vi visar kvalitativt och kvantitativt att shear stress aktiverar endokardiella Notch signalering under avdelningen utveckling, vilket främjar hjärt trabeculation.

Abstract

De hemodynamiska krafter som upplevs av hjärtat påverkan hjärt utveckling, särskilt trabeculation, som bildar ett nätverk av förgrenade utväxter från hjärtmuskeln. Genetiska programmet defekter i skåran signalering kaskad är involverade i ventrikulär defekter såsom vänster ventrikulära Non-Compaction kardiomyopati eller hypoplastiska vänster hjärta syndrom. Användning av detta protokoll, kan det fastställas att skjuvspänningen driven trabeculation och Notch signalering är relaterade till varandra. Använda ljus-ark fluorescensmikroskopi, var visualisering av utveckla zebrafiskar hjärtat möjligt. I detta manuskript, bedömdes det huruvida hemodynamiska krafter modulera inledandet av trabeculation via Notch signalering och således påverka kontraktila funktion uppstår. För kvalitativa och kvantitativa shear stressanalys, 4 D (3-D + tid) bilder förvärvades under zebrafiskar hjärt morfogenes, och integrerad ljus ark fluorescensmikroskopi med 4-D synkronisering erövrade den ventrikulära rörelsen. Blodets viskositet sänktes via gata1a- morpholino oligonukleotider (MO) mikro-injektion för att minska skjuvspänning, därmed, down-reglerande Notch signalering och förmildrande trabeculation. Samtidig injektion av Nrg1 mRNA med gata1a MO räddade Notch-relaterade gener för att återställa trabeculation. För att bekräfta skjuvspänningen driven Notch signalering påverkar trabeculation, hjärtmuskelcellen kontraktion greps ytterligare via tnnt2a-MO att minska hemodynamiska krafter, därmed, down-reglerande Notch målgener att utveckla en icke-trabeculated hjärtmuskeln. Slutligen genomfördes styrkande av uttrycksmönster skjuvspänning-lyhörd Notch gener genom att utsätta endotelceller till pulserande flöde. Således, 4-D ljus ark microscopyen avtäckt hemodynamiska krafter underliggande Notch signalering och trabeculation med klinisk relevans till non-compaction kardiomyopati.

Introduction

Biomekaniska krafter, såsom hemodynamiska skjuvspänning, är intimt involverade i hjärt morfogenes. Svar på hemodynamiska skeva styrkor utvecklas myokardiell åsar och fåror i en vågliknande trabekulära nätverket i linje med riktningen av skjuvspänningen över atrioventrikulärt (AV) ventil1. Hjärt trabeculation är nödvändigt att öka kontraktila funktion och hjärtinfarkt massa2. Mutationer i Notch signalering vägar resulterar i kongenitala hjärtfel hos människor och andra ryggradsdjur3. Till exempel har gata1a4 och tnnt2a5 morpholino oligonukleotider (MO) visat sig minska erytropoes, medan erytropoietin mRNA (EPO)6 och Isoproterenol (ISO)7 ökar röda blodkroppar celler och puls vägg respektive, och därför skjuvspänning (WSS). Dessutom ErbB2 signalering, nedströms av Notch, främjar hjärtmuskelcellen proliferation och differentiering att generera kontraktila kraft, som i sin tur aktiverar Notch signalering8,9. Det föreslås att shear stress styr Notch signalering drivna trabeculation för ventrikulär utveckling. För närvarande, det finns många studier som försöker ytterligare förstå genetisk programmering händelserna som ledde till kongenitala defekter (CHD)10,11,12, men mycket lite undersöker hur mekaniska krafter påverkan bildar hjärtat.

För att undersöka de mekaniska styrkorna behöver agera på endocardium, noggrann observation under perioden utvecklingsmässiga genomföras. Det är dock svårt att få bra kvalitetsbilder av i vivo slog prover på grund av tillhörighet traditionella mikroskopi13. För att följa utvecklingen över tid inom ett prov, måste fysiska snittning och färgning, därför uppstå13,14,15. Även om konfokalmikroskopi används ofta till bild 3D-strukturen för prover14,16, begränsas fortfarande dessa bildsystem förvärv av långsam skanning hastigheter.

Ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM) är en unik imaging teknik som möjliggör visualisering av i vivo dynamiska händelser med långa arbeta avstånd13. Denna teknik använder en ljus ark fluorescerande mikroskopi optiskt avsnitt en prov17. På grund av belysning av endast ett tunt lager av ljus på prov finns det en minskning av foto-blekning och foto toxicitet13,18. Stora området Visa och långa arbetsavstånd möjliggör stora prover bo intakt eftersom de är avbildad13,14,17. Den låg förstoringen möjliggör ett större område avbildas, medan långt arbetsavstånd möjliggör tjockare prover som avbildas utan att kompromissa med det signal-brus-förhållandet. Många grupper har använt LSFM till bilden hela embryon17, brains14,18, muskler och hjärtan19 bland andra vävnader, visar de olika typerna av prover som kan avbildas.

Även om tidigare forskning visat minskad hemodynamiska tvärkraften av occluding inflöde eller utflöde spåren av zebrafisk hjärtat, är informationen enbart kvalitativa. Det resulterar i en onormal tredje avdelningen, minskad hjärt looping och nedsatt ventil bildandet20. 4-D LSFM bilderna ge ett nytt perspektiv i det sättet den hemodynamiska skjuvning krafter påverkar utvecklingen av hjärtvävnad. Dessa mekaniska krafter kan aktivera kraft-känsliga signalmolekyler och inducera bildandet av trabekulärt åsar. På grund av den extra tidsaspekten av 4 D imaging är en kompetent att spåra förändringar i utvecklingen i realtid, vilket kan leda till nya uppenbarelser som hade gått obemärkt förbi tidigare. Zebrafiskar är en idealmodell för imaging eftersom forskare kan observera ett hela vertebrate djur kontra endast cell-cell interaktioner. Syre kan också diffunderar genom hela embryot, som möjliggör utveckling sker utan beroende på kärlsystemet, till skillnad från däggdjur utveckling. Även om zebrafiskar hjärtat saknar pulmonell organ, som kräver ett fyrkamrat hjärta, finns det ett stort antal hjärt gener som bevaras mellan zebrafiskar och människor21.

I detta manuskript beskriver vi hur du använder ljus ark fluorescensmikroskopi till bild utveckla trabekelantal i zebrafiskar hjärtan under olika omständigheter. Injektion av gata1a4 eller tnnt2a5 användes först, MOs till lägre blodet viskositet och därför WSS. Morfologi av hjärtat spelades sedan. I en separat grupp av fisk, vi ökade WSS genom att administrera EPO mRNA6 eller isoproterenol7 och observerade resultaten. Vi har också genomfört en cell studie med olika pulserande eller oscillerande flöden. Efter imaging varje grupp, hittade vi att WSS kände av endocardium via Notch signalering initierar trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Följande metoder har utförts i enlighet med UTA och UCLA IACUC protokoll. Dessa experimentella grupper användes med transgena Tg(cmlc2:gfp), wea (svag atrium) eller clo (cloche) mutanter: a vildtyp (WT) kontroll, (b) gata1a MO och (c) tnnt2a MO injektioner (tabell 1).

Modell Namn Modifierade gener Fenotyp Referens
Kontroll Vildtyp Ingen EJ TILLÄMPLIGT
TG(cmlc2:GFP) Cardiac myosin ljusslinga Gröna våglängdsområde specifikt uttryckt i myokardiet 34
Minskad vägg skjuvspänning Svag atrium (wea) mutant Atrium-specifika myosin heacy kedja Atriet kan inte kontrakt, kompakt ventrikeln, tjock mur som hjärtinfarkt, smala lumen, vidgade atrium, 37
Cloche (clo) mutant EJ TILLÄMPLIGT Fullständig borttagning av endocardium, unaturally stora atrium med små ventrikeln, obefintlig hjärt cushins 41
gata1a MO gata1a  Anemi av brist på röda blodkroppar 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Ökad vägg skjuvspänning EPO mRNA Ingen Svår polycytemi, ökning av antalet cirkulerande blodkroppar, ökad viskositet 6
Isoprotenerol Ingen Ökad hjärt frekvens 7

Tabell 1: Zebrafiskar beskrivningar. Definitioner och beskrivningar av zebrafiskar som används i experiment.

1. studera Setup

  1. Förbered Nrg1 och EPO mRNA för trabeculation räddning.
    1. Få mänskliga Nrg1 cDNA och förstärka från en donator plasmid.
      Obs: Den mänskliga Nrg1 cDNA var begåvad från William Talbot från Stanford University.
      1. Ta ut nödvändigt reagens och material, nämligen PCR mastermix (lagras i-20 ° C), grundfärger (se tabell 2) (lagras i-20 ° C), en PCR-plattan (som lagras i rumstemperatur) och 20 μL pipett (rumstemperatur). Se tabell över material för exempel produkter.
        Table 2
        Tabell 2: Primers för kloning av Nrg1 .
      2. Förbereda mastermix för varje primer i tre exemplar med 20 μL pipetten. För 1 uppsättning exemplar, använda 37,5 μL av mastermix, 3 μL av DNA-fritt vatten, 4,5 μL av primer. För fler exemplar, helt enkelt multiplicera antalet prover.
      3. Späd arbetslösning mänskliga Nrg1 cDNA (20 ng/μg koncentration) i primer remsan med DNA-fritt vatten så att det finns 10 μL totalt per brunn per prov.
        Obs: Se till att varje lösning under steg 1.1.1 fördelas jämnt. Gör detta genom att blanda varje lösning genom pipettering upp och ner. För att förhindra korskontaminering, Använd en pipettspetsen för endast ett urval.
      4. Alikvot den Nrg1 cDNA med 10 μL Multi-Channel pipetten till önskad brunnar i PCR-plattan.
      5. Lägga till 14,5 μL av mastermix till cDNA i brunnarna. Gäller en klibbig cover PCR-plattan att täta brunnarna, och placera i PCR-maskinen.
      6. Starta PCR-maskinen och se till att cykeln når temperaturer enligt enzymer och primers används.
    2. Klona den Nrg1 cDNA in de plasmiden pCS2+ på den BamHI och Mina platser med överskott enzymerna BamHI och mina för att säkerställa cDNA är sammanskrivna i alla plasmider.
      1. Blanda den Nrg1 cDNA med givaren plasmid pCS2+, kommersiellt tillgängliga master blanda lösning och primers (tabell 2).
        Obs: Den totala reaktionsvolym bör vara 50 μL med 25 μL av master mix, 3 μL av primers och 1 μL av 20 ng/μl donator plasmid med Nrg1 cDNA.
      2. Placera i mixen från steg 1.1.2.1 i PCR-maskinen och ställa in parametrar för att uppfylla följande specifikationer: 98 ° C för 10 s, 55 ° C för 5 eller 15 s och 72 ° C i 5 s/kb.
      3. Rena PCR-produkten med hjälp av en rening kit följa tillverkarens instruktioner. Eluera produkten till 50 μL av eluering buffert.
      4. Smälta renat PCR-produkten och 5 μg av pCS2+ med BamHI och mina separat vid 37 ° C i 2 h i en 200 μl reaktionsvolym. Rena resulterande rötning med ett kommersiella kit och eluera i 20 μL och 100 μL av Tris-HCl (pH 8,5), respektive.
      5. Ligera 4 μL av Nrg1 cDNA och 2 μL av den smält pCS2+ plasmid i en 25 μL reaktion med 1 μL av en ligase katalysator på 16 ° C över natten.
        Obs: Förfarandet kan vara stannade här över natten inkubation.
      6. Använda 2 μL av ligering lösningen från steg 1.1.2.5 och transformering till 50 μL av E. coli bakterieceller lämplig för kloning (se Tabell för material).
    3. Bekräfta att omvandlingen skedde genom screening av Nrg1 cDNA kloner med PCR. Välja kloner på måfå och lägga till en lösning av specifika primers, polymeras och deoxyribonucleotide trifosfater (dNTP).
      Obs: Kontrollerna var vektorn (pCS2+) med och utan insatsen (human cDNA). Plocka inte för stor av en koloni eftersom överdriven bakterier kan hämma PCR.
      1. Plocka 8 kolonier från den omvandling och skärmen pCS2+-Nrg1 kloner använder PCR primers från tabell 2.
      2. Kultur en klon med Nrg1 cDNA att isolera pCS2+-Nrg1 plasmid DNA. Inokulera med 100 μL av E. coli -bakterier med pCS2+-Nrg1 plasmid i 100 mL LB media och kultur genom att skaka (160-225 RPM) vid 37 ° C.
    4. Transfect renat pCS2+-Nrg1 plasmid i HEK-293 celler i en 6-well platta med en kommersiell transfection reagens följa tillverkarens instruktioner.
    5. 24 h efter transfection, lyse celler använder en lyseringsbuffert och kör genom en SDS-PAGE gel, överföra till ett gel membran och sedan fläcken med anti-Nrg1 antikropp22. Verifiera Nrg1 proteinuttryck använder en Western Blot.
      Obs: Kontrollen är en tom pCS2+ plasmid. Kan pausas här om gel membranet överlåtelsen sker över natten.
    6. Syntetisera Nrg1 mRNA använder en kommersiell produkt som liknar den i Tabellen för material och följ tillverkarens anvisningar.
      1. Ta 5 μL av pCS2+-Nrg1 DNA från bakterier som isolerats kultur och sammanfattad med NotI i en 200 μL reaktion för 2 h vid 37 ° C till linjär Plasmiden.
      2. Rena den linearized plasmiden med ett kommersiella kit och eluera i 20 μL av Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Föra in vitro- transkription med en kommersiell RNA isolering kit i en 20 μL reaktion med 5 μL av det linearized plasmid följa tillverkarens instruktioner.
      4. Lägg till den i vitro transkriberat Nrg1 till 350 μL lyseringsbuffert RNA och sedan rena med ett RNA isolering kit. Eluera RNA in 60 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Mätning av RNA-koncentrationen och förvaras vid-80 ° C för framtida bruk.
    7. Följ steg 1.1.6.1 - 1.1.6.5 ovan för EPO cDNA och mRNA förberedelse men klon cDNA in pCS2 + plasmiden på mina och XhoI platser istället.
  2. Injicera zebrafiskar Morpholino
    1. Design23 MO injektionerna använder ett online-verktyg (Tabell för material) mot ATG sekvensen av gata1a4 (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) och tnnt2a5 (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Lägga till gata1a och tnnt2a MO separat till nuclease-fritt vatten för att göra slutliga koncentrationerna av 8 ng/nL och 4 ng/nL, respektive. Upprepa med EPO mRNA med en slutlig koncentration på 20 pg/nL. Säkerställa att den slutliga volymen är 1 mL.
    3. Injicera 1 nL 8 ng/nL av gata1a MO och 1 nL för de 4 ng/nL av tnnt2a MO i separata zebrafiskar embryon på 1 till 4-cells scenen att minska ventrikulära vägg skjuvspänning (WSS)24. För att öka WSS, injicera 1 nL 20 pg/nl EPO mRNA6 in zebrafiskar embryon i 1 - till 4-cellstadie.
  3. Kemiskt behandla zebrafiskar för att hämma trabeculation
    1. Med pipett 20 mL Späd 10 mg/mL AG1478 i 1% DMSO i E3 medium till en slutkoncentration på 5 μM 30 hpf i en 15 mL tub. Behandla varje fisk med 1% DMSO endast som en kontroll.
    2. Lägg till N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butyl ester (du) i 1% DMSO (100 μM) till E3 medium i en 15 mL tub att hämma Notch signalering vid 40 hpf på ett liknande sätt. Som en kontroll, behandla med endast 1% DMSO.

2. imaging tekniker

  1. 4-D hjärt LSFM Imaging med synkronisering algoritm
    1. Ta 2D-bilder av hela fisk embryot över flera hjärt slå cykler med hjälp av stegen nedan (figur 1). Se till att de ljus-plåtens tjockleken ca 5 μm. Ta 500 x-y ramar med en exponeringstid på 10 ms. Set z-skanning till 1 μm för förlustfri digital provtagning enligt Nyquist provtagning princip25.
      1. Skapa en 1% (w/v) agarosgel genom att lägga 1 g av agaros till 100 mL och värme det tills alla agaros är upplöst. Läsa in ett litet plaströr med embryot och agaros med 20 μL pipett och säkra den på scenen.
      2. Öppna den bild betraktande mjukvaran och klicka på Live för att se live-vyn av provet. Justera syftet med vredet så att provet är i fokus. På samma sätt flytta scenen så att den levande provet visar upp i embryot.
      3. Ta bilder 500 gånger för 5 s vid 10 X förstoring med mikroskopets programvara26.
      4. Flytta scenen med motorn till ett nytt lager (1 μm i z-axeln) och upprepa förfarandet imaging.
      5. Upprepa ovanstående 2 steg tills hela hjärtat är fullt avbildas.
    2. Säkerställa dataintegritet genom att bortse från de första och sista hjärt cykel bilderna. Hitta perioden av hjärt cykeln genom att matcha bilder som togs vid samma tidpunkt i hjärt cykeln, men i olika perioder. Använd följande ekvation som utvecklades för att hitta perioden:
      Equation 1(1)
      där D är den kostnaden funktion som används för att montera en period hypotes, jagm den tagna bilden, τ' den tid som bilden fångades, zk z-riktning index för bilden, xm är den vektor av pixel indexet, och T' är periodiska hypotesen.
    3. Använd följande ekvation för att hitta relativa skiftet mellan två bilder i liknande stadier:
      Equation 2(2)
      där Qk', k betecknar en kostnad funktion för det relativa skiftet, R är möjligt rumsliga grannskapet, L är den totala tiden för erövrare imagen, x är pixel index, zk och zk' är de första och andra z-riktning skivorna, t är tid och s är relativa Skift hypotesen.
    4. Konvertera det relativa skiftet till absoluta Skift med avseende på första bilden och lösa den linjära ekvation med använder pseudo omvända tillvägagångssättet, hitta absolut förhållande till justera nästa avsnitt av bilder som tidigare beskrivits27.
    5. Final 4-D bilderna bearbetades med hjälp av programvara bildbehandling (Tabell för material).
      1. Stapla 2D-bilder i 3D
        1. Öppna en kommersiell bildbehandlingsprogram.
        2. Klicka på Öppna Data.
        3. Välj alla bilder för att staplas i 3-D > klicka Load.
        4. Lägg till i voxel storlek 0,65 x 0,65 x 1 > Klicka på OK.
        5. Klicka på rutan Multi-Planar för att visualisera 3D-bilden.
        6. Högerklicka på rutan blå slice_1.tiff > Välj Visa > Välj Volren.
        7. Klicka på Redigera > Välj alternativ > Välj Redigera färgkarta.
        8. Justera färgen med rutorna rödmarkerade > Klicka på OK.
      2. Konvertera 3D till 4 D
        1. Klicka på ”filen > Öppna tidsseriedata.
        2. Välj 3D-TIFF som gjorts bara > klicka Load.
        3. Ange samma voxel storlek som innan.
        4. Högerklicka på rutan blå slice_1.tiff > Välj ”Visa” > Välj Volren.
        5. Klicka på Redigera > Välj alternativ > Välj Redigera färgkarta. Justera färgen med rutorna > Klicka på OK.
        6. Högerklicka på Serien tidsstyrning > Klicka på Movie maker > Tryck på knappen spela för att se filmen.
        7. Lägga till ett filnamn, storlek, bildhastighet, kvalitet lika med 1, skriver monoskopiska > Klicka på Verkställ
        8. Exportera video. Öppna filmen i en lämplig programvara.

3. qRT-PCR-analys

  1. Zebrafiskar hjärta RNA isolering för att kvantifiera Notch ligander, receptorer, och rikta gener uttryck
    1. Offra zebrafisk genom att utsätta dem för en överdos av tricaine methylate28,29. Använda en tidigare beskrivna protokoll30, var zebrafiskar hjärtan utskurna och förberett för RNA isolering.
    2. Isolera den total-RNA och syntetisera det cDNA som med hjälp av cDNA syntes kit följa tillverkarens instruktioner.
    3. Utforma PCR primers för de Notch liganderna Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1boch signalering relaterade gener Nrg1 och ErbB2. Se tabell 3 för primers vi använt.
    4. Lägga till primers från steg 3.1.3, isolerade mRNA från steg 3.1.2 och en kommersiell mastermix till PCR-plattan. Kör qRT-PCR vid temperaturer och tider enligt de enzymer som används. Normalisera resultaten till zebrafiskar α-aktin.
      Obs: Detta kommer att beräkna uttrycksnivåerna för var och en av ligander, receptorer och gener.

4. in vitro mänskliga aorta Endothelial cellen (HAEC) experiment

  1. Dynamiska Shear Stress modell
    1. Kultur HAEC celler med HAEC kultur media. När fullt konfluenta, utsätta celler till laminärt flöde och pulserande flöde av 23 x 10-5 N uppgå till 1 Hz för 24 h.
      1. Värm upp EG media/DMEM 10% FBS i ett vatten bad i 20 min.
      2. Hämta HAEC celler från flytande kväve tank och placera injektionsflaskan i vattenbad tills smält.
      3. Med 1 000 μL pipett bort de upptinade cellerna och Lägg dem i en 15 mL tub med 3-5 mL av media. Centrifugera cell lösningen vid 53 x g i 3 min.
      4. Aspirera lösningen bort och lägga till tillräckligt media för en total volym på 10 mL. Lägga till cell lösningen i en steril T75-kolv, cap kolven och distribuera cellerna jämnt på undersidan av plattan.
      5. Markera kolven med initialer, datum, celltyp, och passage. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, kolven tills cellerna är 80% konfluenta. Kom ihåg att ändra media varje 2-3 dagar.
      6. Använda en kommersiell pump, Fäst slangen till kolven och ange de parametrar som nämns ovan i steg 4.1.131,32,33.
    2. Lägga till GI254023X till 50 mL HAEC medium med en slutlig koncentration på 5 μM för 30 min.
    3. Med den färdigblandade GI254023X, en ADAM10-hämmare som undertrycker Notch signalering, genomföra den samma laminärt flöde eller pulserande flöde experiment som i 4.1.1.
    4. Kvantifiera Notch ligander (Jag1, Jag2, och Dll4) och Notch målgener (hårig och förstärkare av split [Hes]) med qRT-PCR för fyra grupper av HAEC prover (laminärt flöde, laminär + GI254023X, pulserande flöde, pulserande flöde + GI254023X) beskrev tidigare32.

5. räddning och över uttryck för Notch signalering

  1. Injicera 1 nL av beredda Nrg1 mRNA vid en koncentration på 5 pg nL (från steg 1.1.6) på 1 - till 4-cell scenen med den gata1a MO för att överuttrycka Notch mål gener24.
  2. Injicera 1 nL av Nrg1 mRNA in wea mutant i en liknande väg24.
  3. Dubbla koncentrationen av Nrg1 mRNA (10 pg nL) och injicera24 1 nL i zebrafiskar att iaktta ventrikulära morfologi.
  4. Injicera 1 nL för de 20 pg/nL EPO mRNA6 in zebrafiskar embryon i 1 - till 4-cellstadie att öka blodbildning för att öka ventrikulära WSS som tidigare visat24.
  5. Injicera 1 nL 50 μM Isoproterenol7, vilket ökar graden av kontraktilitet, till E3 medium för 24 h medan zebrafiskar odlas som tidigare visat24.
  6. Utföra 4 D LSFM avbildning för varje grupp. Följ instruktionerna i steg 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. kvantifiering av fraktionerad förkorta och volym förändring över tid

  1. Utföra 4 D LSFM avbildning för varje grupp på 50, 75 och 100 hpf. Följ instruktionerna i steg 2.1.1-2.1.5.2.8. Dela varje bild så alla har 600 noder för replikering av hjärt vägg rörelse.
  2. Mäta förändringen i diameter av ventrikeln under diastole och systole med följande formel:
    Equation 3(3)
    Ladda 3D-ventrikulära bilder på varje 0,1 s med visualiseringsprogram och mäta volymen.
  3. Rita volymförändringen över tiden för varje experimentella gruppen 75 hpf och 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM användes i detta manuskript för att förvärva högupplösta 2D och 3D-bilder. Som kan ses i figur 1A och 1B, styr belysning linsen bladet ljus på provet. På grund av tunna bladet ljus belyses endast ett enda plan. Upptäckt linsen är placerad vinkelrätt mot objektivets belysning och är inriktad på belysta planet (figur 1B). Bladet ljus från belysning linsen söker sedan provet från vänster till höger (figur 1 c). Skanningen kan mindre foto-blekning, Foto-toxicitet, och har en lägre signal-brus-förhållande.

LSFM tillämpades Tg(cmlc2a:gfp) embryon att visualisera det hela hjärta struktur34 av snabb skanning (> 30 s) med en voxel upplösning på 0,65 x 0,65 x 1 µm. på grund av en enda plan belysning, bakgrundsljud var signifikant minskad (Figur 1). Trabekulära åsar stack till ventrikulära lumen på 75 hpf och en trabekulära nätverket tydligt visades på 100 hpf (figur 2A, B). Gata1a MO mikro-injektion minskad blodbildning och viskositet med 90%4,35. Detta minskad viskositet försvagade hemodynamiska skjuvspänning, vilket resulterar i en fördröjd initiering och täthet av trabekulära nätverket på 75 hpf och 100 hpf jämfört med kontrollgruppen (figur 2 C, D). Dessutom Notch ligander (Dll4 Jag1och Jag2), receptor (Notch1b) och nedströms signalering komponenter (Nrg1 och ErbB2) var ned-reglerade som svar på gata1a MO injektion (p < 0,05, n = 5) (figur 2 K)2,8,36. Samtidig injektion av gata1a MO med 5 μM Nrg1 mRNA uppreglerat Notch signalering-relaterade genuttryck och räddade trabekulärt bildandet på 75 hpf och 100 hpf (figur 2E, F, K). Således gata1a MO reducerade hemodynamiska krafter leder till down-förordning av Notch signalering, medan Nrg1 mRNA rädda uppreglerat Notch-relaterade gener och åter initierade trabeculation.

För att ytterligare bevisa våra hypotesen att ändra hemodynamiska krafter och thus trabeculation via Notch signalering, introducerade vi wea mutant framkallar som en icke-kontraktila atrium37. I avsaknad av ventrikulära inflöde och hemodynamiska krafter under förmaksflimmer systole, wea mutanter express lägre hjärt mRNA nivåer av Notch signalering komponent gener och målgener jämfört med kontroller, och hyser icke-trabeculated, små och svagt upphandlande ventriklarna (figur 2 g, L). Dock uppreglerat Nrg1 mRNA mikro-injektion i wea mutanter skåran signalering utbildningsavsnitt, åtföljs av partiell räddningsaktionen av trabekulärt åsar, leder till en mer uttalad kontraktila ventrikeln trots en icke-kontraktila atrium ( Figur 2 H, L)2. I detta sammanhang bekräftas wea mutanter förhållandet mellan icke-kontraktila atrium och en icke-trabeculated ventrikeln, betonar de hemodynamiska moduleringen av trabeculation via Notch signalering.

Tnnt2a MO levererades för att stoppa hjärtats sammandragning av hämmande hjärt troponin T38,39. Tnnt2a MO-injiceras fisken var helt saknar cirkulation och ventrikulära WSS på grund av betydande down-reglerade Notch signalering, vilket leder till en slät ventrikulära yta och tunn vägg jämfört med kontrollgruppen (figur 2I, M) . För att undersöka om WSS på endocardium var ett krav för trabeculation, har vi även cloche (clo) mutanter som endocardium och endotel slemhinnan i hjärtat inte utvecklar40,41. Clo mutant lyckats utveckla hjärt trabekelantal och visade mindre storlek ventrikeln och ofullständig hjärt looping (figur 2J). Således behövs den endokardiella fodret känsla hemodynamiska skjuvspänningen att aktivera Notch signalering (figur 2 M). Men när hemodynamiska skjuvspänningen ökade med ökande blodbildning eller behandling av isoproterenol att öka kontraktilitet, uttrycksnivåerna av Notch-relaterade gener ökade inte, och trabekulära nätverket morfologi förändrades inte (Figur 3).

För att ytterligare demonstrera förhållandet mellan skjuvspänning och Notch signalering, användes HAECs för in vitro- tester. Ett pulserande flöde utövades på konfluenta celler att simulera hemodynamiska skjuvspänningen observeras av endotelceller. Det är visat att jämfört med statisk kultur, pulserande kultur ökar uttrycket av Notch-relaterade gener (figur 4). Dessutom signifikant behandling med ADAM10-hämmaren Notch signalering (figur 4).

Nästa, vi beräknas ventrikulära fraktionerad förkortning och ventrikulära kaviteten förändring i volym över tid för vildtyp, gata1a MO, AG1478, och de som räddas av Nrg1 injektion grupper på 50 hpf, 75 hpf och 100 hpf (figur 5A- C) . Behandling med ErbB signalering hämmare, AG1478, avsevärt fördröjd och minskad fraktionerad förkortning under ventrikulär diastole 100 hpf (figur 5A). Både gata1a MO och AG1478 behandling minskad ventrikulär kammare storlek under kontraktion, enligt bedömning av förändringar i 4 D LSFM (figur 5E, F). Båda grupperna utvecklat en ökad slutet-systoliskt-diastoliskt volym jämfört med vildtyp. Samtidig injektion av Nrg1 mRNA med gata1a MO återställas både fraktionerad förkortning och ejektionsfraktion mot dem av wild typ.

Figure 1
Figur 1 : Fluorescerande ljus blad översikt. (A) representant LSFM system där provet placeras i korsningen av bladet ljus från belysning linsen (IL) och upptäckt sökvägen för upptäckt linsen (DL). (B) den cylindriska linsen bakom IL skapar micron stora ljus arket (lila) i provet, som retar en tunn plåt av provet. Objektivets upptäckt poster utsända fluorescerande signalen. (C) en schematisk av tunn laser arket (lila) optiskt snittning zebrafiskar embryot som flyttar höger till vänster. Denna siffra har ändrats från Lee et al17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Ventrikulära morfologier av genetiskt manipulerade TG(cmlc:GFP) zebrafiskar med Notch Ligand, receptor och målet genuttryck. (A) det trabekulära nätverket visas på 75 hpf av kontroll zebrafiskar. (B) det trabekulära nätverket på 100 hpf av kontroll zebrafiskar. (C) injektion av gata1a MO i 1 - till 4-cellstadie visade lite att ingen trabeculation på 75 hpf. (D) injektion av gata1a MO i zebrafiskar hade försenat trabekulära nätverket bildas. (E) samtidig injektion av gata1a MO och mänskliga Nrg1 mRNA delvis återställd trabeculation på 75 hpf. (F) samtidig injektion av gata1a MO och mänskliga Nrg1 mRNA nästan helt återställd trabekulära nätverket på 100 hpf. (G) wea mutant på 100 hpf visar ingen trabeculation och en slät ventrikulära vägg. (H) injektion av mänskliga Nrg1 i wea mutant zebrafiskar delvis återställd trabeculation vid 100 hpf. (I) injektion av tnnt2a MO visade ingen trabeculation på 75 hpf (visas inte) och 100 hpf. (J) CLO mutant visade ingen trabeculation vid 100 hpf. (K) injektion av den gata1a MO reducerade signifikant mRNA uttryck av Notch1, Nrg1, och Jag2 (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Samtidig injektion av gata1a MO och mänskliga Nrg1 mRNA ökade signifikant uttryck för Notch1b, Nrg1, ErbB, och Jag1 jämfört med kontrollgruppen. (L) wea mutant hade betydligt lägre uttrycket av Notch-relaterade gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Injektion av humant Nrg1 ökade uttrycket av Notch-relaterade gener; Jag1 och Jag2 var betydligt högre än kontroll. (M) tnnt2a MO injektion och clo mutant visade en signifikant lägre uttryck av Notch-relaterade gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Skala barer: 50 μm. Data visas som den genomsnittliga standardavvikelsen. Denna siffra har ändrats från Lee et al17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Öka WSS i manipulerade TG(cmlc:GFP) zebrafiskar med Notch ligand, receptor och target genuttryck i vivo . Ökande WSS via över uttryck för blodbildning med injektion av EPO(A) eller tillägg av ISO (B) via öka hjärtfrekvensen ökade inte trabeculation och hade en trabekulära nätverket liknar kontrollen. (C) injektion av EPO mRNA eller Isoproterenol förändrades inte uttrycket av Notch ligand, receptor eller mål gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Denna siffra har ändrats från Lee et al17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Endotelceller föremål oscillerande eller pulserande shear stress in vitro- . HAECs omfattas av pulserande skjuvspänningen τgenomsnittliga = 30 x 10-5 n/s på 1 Hz hade uppreglerad Notch-relaterade genuttryck och nedreglerade Notch-relaterad gen uttryck när den ADAM10-hämmaren applicerades (t-test, * P < 0,05, n = 5 kontra kontroll). Denna siffra har ändrats från Lee et al17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Effekten av trabeculation av fraktionerad förkortning och utmatning bråkdel. (A-C) Tillägg av AG1478 och gata1a MO minskade signifikant fraktionerad förkortning på 100 hpf, men samtidig injektion av mänskliga Nrg1 och gata1a MO förbättrat den. (D) gata1a injektion och AG1478 minskade signifikant fraktionerad förkortning på 100 hpf (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Samtidig injektion av gata1a och Nrg1 mRNA förbättrade fraktionerad förkortning. (E-F) Att integrera algoritmen som 4 D synkronisering med LSFM visade att AG1478 och gata1a MO hade ökat slutet systoliskt och diastoliskt volymer på 75 hpf (E) och 100 hpf (F). Data visas som den genomsnittliga standardavvikelsen. Denna siffra har ändrats från Lee et al17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Zebrafiskar Jag1 Framåt CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Bakåt CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafiskar Jag2 Framåt AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Bakåt GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafiskar Dll4 Framåt CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Bakåt CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafiskar BMP10 Framåt GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Bakåt TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafiskar ErBb2 Framåt GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Bakåt AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafiskar Nrg-1 Framåt GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Bakåt CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafiskar Notch1b Framåt CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Bakåt GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabell 3: Primers används för zebrafiskar screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll, har vi visat att 4 D imaging kan användas för att spåra utvecklingen av en trabekulära nätverket som svar på förändringar i biomekaniska krafter. I synnerhet initierar skjuvspänningen erfarna av endotelceller skåran signalering kaskad, som i sin tur främjar trabeculation. I detta manuskript, har vi visat att (1) gata1a MO injektion minskad blodbildning och därför det förminskade vägg skjuvspänning, (2) tnnt2a MO injektion hämmade kontraktila kammarfunktion för att minska vägg skjuvspänning, och (3) wea mutanter saknade förmaksflimmer kontraktion, som sedan minskade hemodynamiska kraft som appliceras till ventrikeln. Genom att minska skjuvspänningen på hjärtats väggar, vi kvantifieras de Notch signalering via qRT-PCR och fann att med reducerad WSS, det var minskad Notch signalering. För att ytterligare bevisa vår hypotes, clo mutanter som saknade endocardium utgjorde inte trabekelantal och att utsätta endotelceller till pulserande skjuvspänningen med ADAM10 närvarande visade att shear stress aktiverar Notch signalering.

De andra avbildningstekniker såsom konfokalmikroskopi kan användas till bild prover i 3D-14. Men har denna teknik och andra många nackdelar. Till exempel de confocal imaging inte kan tränga djupt in prover, har låga axiella upplösning och långsam scanning hastighet19,42. På grund av gränsen djup penetration i confocal imaging, kan små prover, såsom zebrafisk embryon, endast avbildas i sin helhet. Två-foton konfokalmikroskopi förbättrar genomträngningsdjupet, men upplösning, långsam avsökningen fart och höga kostnader gör denna teknik oönskade13. Det har gjorts studier som kombinerar två-foton mikroskopi och LSFM framgångsrikt18, men nackdelarna är fortfarande framstående42.

LSFM, däremot, har minst foto-blekning och skada13,18,42, snabb förvärv hastighet och liknande penetration djup13. Dessutom, på grund av dubbla linser och excitation av ett enda plan (figur 1)är bakgrundsljud avsevärt reducerat43. Proverna måste dock vara inbäddade i geler att immobilisera urvalet, vilket gör det svårt att tillämpa i vivo modeller än zebrafisk14,17,19. Utnyttjande av fluorescerande ljuset begränsar också, djup penetration till några millimeter. Även om LSFM är en bra metod för visualisering, är det viktigt att det kompletteras med kvantitativa data. Eftersom LSFM bara är kvalitativa, kan det vara föremål för olika tolkningar. Med qRT-PCR, kunde vi bekräfta att LFSM 4 D bilderna var en korrekt återgivning av de händelser som inträffar i de levande proverna. Ibland i större prover, kan ränder och skuggor bilda i bilder. Dock kan dubbelsidiga belysning eller mSPIM utnyttjas för att minska dessa artefakter42. Eftersom LSFM är så mångsidig, gör dess förmåga att fånga hög upplösning och överlag bättre bilder framtidens LSFM lovande. Tidigare nämnts kan LSFM kombineras med andra bildgivande system för framgångsrika imaging18,42.

Vi visat tidigare att tillämpa en pulserande skjuvspänning av 23 x 10-5 N vid 1 Hz för 24 h väsentligen uppreglerar Notch signalering i vitro(figur 4)17. Vi har vidare visat att skeva styrkor aktivera Notch signalering genom genetisk manipulation av blodbildning (gata1a MO)4, hjärtats sammandragning (tnnt1a MO)5, förmaksflimmer kontraktion (wea mutant), endokardiella borttagning (clo -muterat) och lokalisering av Notch signalering (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Vi beskriver här som genom att sänka vägg skjuvspänningen i ventrikeln, att Notch-relaterade gener var ned-reglerade (figur 2 K, L, M). Dessutom kunde vi visa att Nrg1 mRNA kunde rädda trabeculation, återställa Notch signalering och förbättra ventrikulär fraktionerad förkortning och ejektionsfraktion (figur 2E, F, H, K-M, figur 5) . Restaurering av hjärtfunktionen visades av ökningen av kontraktila funktion-medierad hemodynamiska krafter som aktiveras Notch signalering (Figur 2 K- M).

Vi har också konstaterat att den skjuvspänning-aktiverat Notch signalering är endokardiella beroende. Med hjälp av gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutant eller AG1478 behandling, trabeculation hämmades och Notch signalering var ned-reglerade (Figur 2 K- M). Dock Nrg1 räddade trabeculation och Notch signalering i wea mutanter och när Co injiceras med gata1a MO (figur 2D, H, K, L). När väggen skjuvspänning (EPO injektion) eller Notch signalering (10 pg nL Nrg1 injektion) ökades, fanns ingen förändring i gruppen EPO i form av morfologi, men onormalt ventrikulära morfogenes var närvarande i Nrg1 ökad dos (figur 3).

Sammanfattningsvis har vi visat att mechanotransduction av shear stress aktiverar skåran signalering utbildningsavsnitt. Genom att tillämpa 4-D LSFM och genmanipulerade zebrafiskar, vi utvecklat en ny modellsystem som visar hur kritiskt blodflödet är under hjärt utveckling till dess morfologi, kontraktilitet och övergripande funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill uttrycka tacksamhet till William Talbot från Stanford University för att ge mänskliga Nrg1 cDNA och Deborah Yelon från UCSD för att tillhandahålla den WEA mutanter. Författarna vill även tacka Cynthia Chen för att hjälpa med bild förvärv. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (att T.K. Hsiai), HL083015 (att T.K. Hsiai), HD069305 (till NC Chi och T.K. Hsiai.), HL111437 (att T.K. Hsiai och NC Chi), HL129727 (att T.K. Hsiai), T32HL007895 (att R.R. Sevag Packard), HL 134613 (till V. Messerschmidt) och Universitet av Texas System stjärnor finansiering (till J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Bioteknik fråga 138 selektiv plan belysning mikroskopi Notch signalering trabeculation hemodynamik zebrafiskar hjärt utveckling skjuvspänning 4-dimensionell hjärta avbildning Mekanobiologi hjärtat lätta blad fluorescensmikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter