Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש פיתוח לבבות דג זברה 4-ממדים (4-D). הדמיה 4-D, באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM), לוקח תמונות תלת-ממדי (3-D) לאורך זמן, לשחזר לבבות המתפתח. אנו מראים איכותית, באופן כמותי שזה גזירה מפעילה חריץ endocardial איתות במהלך הפיתוח קאמרית, המקדם trabeculation הלב.

Abstract

כוחות והמודינמיקה מנוסים על ידי השפעה הלב התפתחות הלב, במיוחד trabeculation, המהווה רשת של outgrowths הסתעפות של שריר הלב. פגמים גנטיים תוכנית החריץ איתות אשד מעורבים חדרית פגמים כגון שמאל Non-דחיסת חדרית שריר הלב או התפתחות תסמונת הלב השמאלי. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לקבוע כי trabeculation מונחה מאמץ גזירה והאיתות חריץ קשורים אחד לשני. באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, ויזואליזציה של הלב דג זברה המתפתח היה אפשרי. כתב יד זה, זה נאמד בין אם כוחות והמודינמיקה לווסת את אתחול של trabeculation דרך חריץ איתות ולהשפיע לפיכך, הפונקציה כויץ מתרחשת. עבור כמותיים להטיה מנתח הלחץ, 4-D (3-D + זמן) תמונות נרכשו במהלך מורפוגנזה לב דג זברה, מיקרוסקופיה זריחה האור-גיליון משולב עם 4-D סינכרון כבשו את התנועה חדרית. צמיגות הדם צומצם ויה gata1a- מורפולינו oligonucleotides (מו) מיקרו-הזרקת כדי להקטין גזירה, ובכך, למטה-ויסות חריץ באיתות, attenuating trabeculation. שיתוף הזרקה של mRNA Nrg1 עם gata1a מו חולץ גנים הקשורים חריץ כדי לשחזר את trabeculation. כדי לאשר גזירה מונע חריץ איתות השפעות trabeculation, התכווצות cardiomyocyte נעצר עוד יותר באמצעות tnnt2a-מו להפחתת כוחות והמודינמיקה, ובכך, מווסת למטה חריץ היעד גנים לפתח שאינם trabeculated שריר הלב. לבסוף, ועיונים דפוסי ביטוי של גנים חריץ גזירה מגיב נערך על ידי העמדת תאי אנדותל זרימה פועמת. לפיכך, מיקרוסקופ אור-גיליון 4-D חשפו כוחות והמודינמיקה שבבסיס חריץ באיתות, trabeculation עם רלוונטיות קלינית ללא דחיסה של שריר הלב.

Introduction

כוחות ביו-מכני, כגון והמודינמיקה גזירה, מעורבים באופן אינטימי מורפוגנזה הלב. בתגובה כוחות גזירה והמודינמיקה, שריר הלב הרכסים והחריצים לפתח רשת trabecular גל כמו יישור עם הכיוון של גזירה מעבר שסתום atrioventricular (AV)1. לב trabeculation יש צורך להגדיל את הפונקציה כויץ ו- מסת שריר הלב2. מוטציות בגן חריץ מסלולי איתות לגרום מומי לב מולדים בין בני אדם אחרים בעלי חוליות3. לדוגמה, gata1a4 ו- tnnt2a5 מורפולינו oligonucleotides (מו) הוכחו להפחית אריתרופויזה, בעוד אריתרופויאטין mRNA (EPO)6 ו- Isoproterenol (ISO)7 להגדיל דם אדום תאים וקצב הלב בהתאמה, ולכן קיר גזירה (WSS). יתר על כן, ErbB2 איתות, במורד הזרם של חריץ, מקדם התפשטות cardiomyocyte ובידול כדי להפיק כוח כויץ, המפעיל בתורו חריץ איתות8,9. הוא הציע שכי גזירה מושלת חריץ איתות trabeculation מונע לפיתוח חדרית. כיום, ישנם מחקרים רבים לנסות להבין עוד יותר את האירועים התכנות הגנטי שמוביל מומי לב מולדים (CHD)10,11,12, אבל מעט מאוד חוקרים כיצד כוחות מכני להשפיע על הלב ויוצרים.

כדי לחקור את הכוחות מכני לפעול לפי endocardium, תצפית קרובה במהלך תקופת התפתחותית צריך להיות מיושם. עם זאת, מאתגר כדי להשיג תמונות באיכות טובה של ויוו להכות דגימות בשל inherence של מיקרוסקופיית מסורתי13. על מנת לצפות הפיתוח לאורך זמן בתוך מדגם, חלוקתה פיזיקליות מכתים, לכן, צריך להתרחש13,14,15. למרות מיקרוסקופיה קונפוקלית נעשה שימוש נרחב כדי תמונת המבנה התלת-ממדי של דגימות14,16, הרכישה של מערכות הדמיה אלה עדיין מוגבל על ידי למהירויות סריקה איטי.

מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (LSFM) היא טכניקה דימות ייחודי המאפשר הפריט החזותי של in vivo אירועים דינמיים עם זמן עבודה במרחק13. טכניקה זו משתמשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות כדי שטיחות סעיף מדגם17. עקב תאורה של רק סדין דק של אור על הדגימה, יש ירידה הלבנת-צילום, צילום רעילות13,18. השדה גדולים של זמן ומרחק עבודה ונוף מאפשר דגימות גדולות כדי להישאר שלמים כמו שהם שבעורך13,14,17. ההגדלה נמוך מאפשר שטח גדול יותר לדימות, בזמן הארוך ומרחק עבודה מאפשר דגימות עבה ליצירת תמונה מבלי להתפשר על יחס אות לרעש. קבוצות רבות השתמשו LSFM כדי התמונה כולה עוברי17, המוח14,18, השרירים, הלב19 בין רקמות אחרות, מציג מגוון סוגי והמדגמים יכול לדימות.

למרות מחקרים קודמים הדגימו הטיה והמודינמיקה מופחת כוח מאת occluding המסילה תזרים או יצוא של הלב דג זברה, המידע הוא אך ורק איכותי. זה התוצאה החדר השלישי לא נורמלי, לולאה לב מופחתת, שסתום לקוי היווצרות20. הדימויים LSFM 4-D לתת פרספקטיבה חדשה אל הדרך שהטיה והמודינמיקה כוחות משפיעים על התפתחות רקמת הלב. כוחות אלה מכני עלול להפעיל כוח רגיש מולקולות איתות, לגרום להיווצרות הרכסים trabecular. בשל ההיבט לזמן שהוסף הדמיה 4-D, הוא מסוגל לעקוב אחר שינויים בהתפתחות בזמן אמת, אשר יכול להוביל גילויים חדשים שדלו בעבר. דג זברה היא מודל אידיאלי עבור הדמיה כי מדענים יכולים להתבונן חיה חוליות שלמה לעומת רק תא-תא אינטראקציות. חמצן יכול מפוזר גם דרך העובר כולו, אשר מאפשרת פיתוח להתרחש מבלי בהתאם למערכת כלי הדם, בניגוד בפיתוח יונקים. אף-על-פי הלב דג זברה חסר האברים ריאתי, אשר דורשים לב תאיים ארבע, יש מספר רב של גנים הלב אשר נשמרים בין דג זברה ובני21.

כתב יד זה, אנו מתארים כיצד להשתמש במיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות תמונה trabeculae המתפתח בלבבות דג זברה תחת נסיבות שונות. ראשית, הזרקה של4 או tnnt2a gata1a5 MOs שימשו התחתונה צמיגות הדם, ולכן WSS. לאחר מכן הוקלט המורפולוגיה של הלב. בקבוצה נפרדת של דגים, אנו מוגברת של WSS על ידי ניהול EPO mRNA6 או isoproterenol7 , בחן את התוצאות. בנוסף ערכנו מחקר תא במחירים שונים זרימה פועמת או מתנדנדות. אחרי הדמיה לכל קבוצה, מצאנו כי WSS חש מאת endocardium דרך חריץ באיתות יוזם trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השיטות הבאות בוצעו בהתאם הפרוטוקולים אוטה ו- UCLA IACUC. קבוצות ניסיוני אלה שימשו עם הטרנסגניים Tg(cmlc2:gfp), המוטציות לל (atrium חלש) או שיבוט (cloche) : (א) פראי-סוג (WT) שליטה, (b) gata1a מו ו- (ג) tnnt2a מו זריקות (טבלה 1).

מודל שם גנים שהשתנו גן # מושגים בסיסיים הפניה
שליטה פראי סוג אף אחד N/A
Tg(cmlc2:gfp) שרשרת אור לב צולבות הקישור חוטים שרירן Flourescence ירוקה במיוחד לידי ביטוי שריר הלב 34
קיר ירד מאמץ גזירה מוטציה חלש אטריום (לל) שרשרת heacy ספציפיים אטריום צולבות הקישור חוטים שרירן אטריום לא חוזה, קומפקטי החדר, הקיר שריר הלב עבה, לומן צר, פתיחה אטריום, 37
מוטציה cloche (שיבוט) N/A הסרה מלאה של endocardium, unaturally האטריום הגדול עם החדר הקטן, cushins לב שאינו קיים 41
gata1a מו gata1a  אנמיה מחוסר תאי דם אדומים 4
tnnt2a מו tnnt2a 39
קיר מוגברת מאמץ גזירה EPO mRNA אף אחד פוליציטמיה חמורה, עלייה במספר מחזורי כדוריות הדם, גדל צמיגות 6
Isoprotenerol אף אחד קצב לב מוגבר 7

טבלה 1: דג זברה תיאורים. הגדרות ותיאורים של דג זברה שימוש בניסויים.

1. לימוד ההתקנה

  1. להכין Nrg1 EPO mRNA לחילוץ trabeculation.
    1. להשיג את האדם Nrg1 cDNA ומגבירים מ פלסמיד התורם.
      הערה: CDNA האדם Nrg1 היה מחונן מ ויליאם טלבוט מאוניברסיטת סטנפורד.
      1. להוציא ריאגנטים הדרושות וחומרים, כלומר ה-PCR mastermix (מאוחסן ב-20 ° C) תחל (ראה טבלה 2) (מאוחסן ב-20 ° C), צלחת PCR (מאוחסן בטמפרטורת החדר), על פיפטה 20 μL (מאוחסן בטמפרטורת החדר). עיין בטבלה של חומרים עבור מוצרים לדוגמה.
        Table 2
        טבלה 2: צבעי יסוד שיבוט אנושי Nrg1 .
      2. להכין את mastermix כל פריימר להגדיר triplicate באמצעות פיפטה 20 את μL. 1 סט של triplicates, לשימוש 37.5 μL של mastermix, μL 3 של ה-DNA ללא מים, μL 4.5 של פריימר. עבור triplicates יותר, פשוט להכפיל את מספר דוגמאות.
      3. לדלל את הפתרון עובד האדם Nrg1 cDNA (20 ng/μg ריכוז) ברצועת תחל עם מים ללא ה-DNA כדי שלא יהיה 10 μL סה כ כל טוב עבור דגימה.
        הערה: ודא כי כל הפתרונות תחת שלב 1.1.1 מופץ באופן שווה. לעשות זאת על ידי ערבוב כל פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה. כדי למנוע זיהום צולב, להשתמש עצה פיפטה אחת עבור מדגם אחד בלבד.
      4. Aliquot cDNA Nrg1 עם פיפטה רב ערוצית 10 μL כדי וולס הרצוי בצלחת PCR.
      5. להוסיף 14.5 μL של mastermix cDNA ב הבארות. כיסוי דביק חלות על הצלחת ה-PCR כדי לאטום את הבארות, מקום לתוך המכונה PCR.
      6. . הפעל את המכונה PCR ולהבטיח כי המחזור מגיע לטמפרטורות המתאים על פי אנזימים תחל בשימוש.
    2. לשכפל את cDNA Nrg1 לתוך pCS2 פלסמיד+ -האתרים BamHI, EcoRI באמצעות אנזימים עודף BamHI, EcoRI כדי להבטיח cDNA הוא מאתרים בתוך כל פלסמידים.
      1. מערבבים cDNA Nrg1 עם התורם פלסמיד pCS2+, מאסטר זמינים מסחרית לערבב פתרון תחל (טבלה 2).
        הערה: אמצעי האחסון התגובה הכולל צריך להיות μL 50 עם 25 μL של מיקס מאסטר, μL 3 של צבעי בסיס, μL 1 של 20 ng/μL התורם פלסמיד עם Nrg1 cDNA.
      2. למקם את התמהיל מהשלב 1.1.2.1 המכונה PCR, קבע את הפרמטרים כדי לפגוש את המפרטים הבאים: 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C עבור s 5 או 15 ו- 72 ° C עבור s 5/kb.
      3. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ההוראות של היצרן. Elute המוצר לתוך μL 50 • תנאי המאגר.
      4. לעכל את המוצר PCR מטוהרים ו 5 μg של pCS2+ עם BamHI, EcoRI בנפרד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעי אחסון התגובה 200 μL. לטהר את העיכול וכתוצאה מכך עם ערכת מסחרי, elute 20 μL, μL 100 של טריס-HCl (pH 8.5), בהתאמה.
      5. מאתרים ומפסיקים μL 4 של Nrg1 cDNA וμl 2 של pCS2 מתעכל+ פלסמיד בתגובה 25 μL עם 1 μL של זרז ליגאז ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
        הערה: ההליך יכול להיות עצר כאן. כבר לילה הדגירה.
      6. השתמש μL 2 של הפתרון מצדו מהשלב 1.1.2.5, שינוי צורה לתוך μL 50 של e. coli חיידקים תאים מתאים שיבוט (ראה טבלה של חומרים).
    3. לאשר השינוי התרחש על ידי הקרנה ש-cdna Nrg1 שיבוטים באמצעות PCR. לבחור שיבוטים באקראי ולהוסיף את הפתרון של צבעי יסוד מסוים, פולימראז deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).
      הערה: הפקדים היו וקטור (pCS2+) עם או בלי את תותב (cDNA אנושי). לא גדול מדי של מושבה כי חיידקים מופרז יכול לעכב PCR.
      1. לבחור 8 מושבות של pCS2 שינוי, מסך+-Nrg1 שיבוטים באמצעות תחל את ה-PCR בטבלה2.
      2. תרבות אחד שיבוט עם cDNA Nrg1 כדי לבודד את pCS2+-Nrg1 פלסמיד ה-DNA. לחסן עם 100 μL של e. coli חיידקים עם pCS2+-Nrg1 פלסמיד לתוך 100 מ ל LB מדיה, והתרבות ע י ניעור (160-225 RPM) ב 37 º C.
    4. Transfect pCS2 מטוהרים+-Nrg1 פלסמיד לתוך HEK-293 תאים בצלחת 6-ובכן באמצעות ריאגנט תקנים מסחרי ההוראות של היצרן.
    5. 24 שעות לאחר תרביות תאים, lyse התאים באמצעות מאגר פירוק לרוץ דרך של ג'ל מרחביות-דף, להעביר את קרום ג'ל ו ואז כתם עם אנטי-נוגדןNrg1 22. ודא Nrg1 חלבון הביטוי תוך שימוש מערבי של כתם.
      הערה: הפקד נמצא pCS2 ריקה+ פלסמיד. ניתן להשהות כאן אם ג'ל ממברנה העברה מתרחשת בין לילה.
    6. לסנתז mRNA Nrg1 באמצעות מוצר מסחרי דומה לזה את הטבלה של חומרים ובצע הוראות היצרן.
      1. . קח 5 μL של pCS2+-DNA Nrg1 מן התרבות חיידקים מבודדים, תקציר עם NotI בתגובה 200 μL עבור 2 h ב 37 ° C כדי linearize את פלסמיד.
      2. לטהר את פלסמיד ליניארית עם ערכת מסחרי, elute, μL 20 של טריס-HCl (pH 8.5).
      3. לנהל את תמלול במבחנה עם ערכת בידוד RNA מסחרי בתגובה 20 μL באמצעות 5 μL של פלסמיד ליניארית ההוראות של היצרן.
      4. הוסף במבחנה עיבד Nrg1 כדי μL 350 מאגר פירוק RNA ולטהר ואז עם ערכת בידוד ה-RNA. Elute את הרנ א לתוך μL 60 של טריס-HCl (pH 8.5).
      5. למדוד את ריכוז ה-RNA ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    7. השלבים הבאים 1.1.6.1 - 1.1.6.5 לעיל עבור EPO cDNA mRNA הכנה אבל שיבוט cDNA לתוך פלסמיד pCS2 + EcoRI, XhoI אתרי במקום.
  2. מזריקים מורפולינו לתוך דג זברה
    1. עיצוב23 זריקות מו באמצעות כלי מקוון (טבלה של חומרים) נגד ATG רצף gata1a4 (יונקות-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) ו- tnnt2a5 (יונקות-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. הוסף gata1a tnnt2a מו בנפרד למים ללא נוקלאז כדי להפוך את הסופי ריכוזי ng 8/nL 4 ng/nL, בהתאמה. חזור עם EPO mRNA עם ריכוז סופי של 20 pg/nL. ודא כי אמצעי האחסון הסופי 1 מ"ל.
    3. להזריק 1 nL של ng/nL 8 של gata1a מו ו- 1 nL של ng/nL 4 של tnnt2a מו לתוך דג זברה נפרד עוברי ב 1 לשלב 4 תאים כדי להפחית את הקיר חדרית גזירה (WSS)24. כדי להגדיל WSS, להזריק 1 nL של 20 pg/nL של EPO mRNA6 לתוך העוברים דג זברה בשלב 1 - ל 4 תאים.
  3. מבחינה כימית לטיפול דג זברה לעכב trabeculation
    1. באמצעות פיפטה 20 מ"ל, לדלל את 10 מ"ג/מ"ל AG1478 ב דימתיל סולפוקסיד 1% ב- E3 בינוניים עד ריכוז סופי של μM 5 וחצי hpf לתוך צינור 15 מ"ל. כפקד, להתייחס לכל דג עם דימתיל סולפוקסיד 1% בלבד.
    2. להוסיף N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-בוטיל אסתר (DAPT) ב 1% דימתיל סולפוקסיד (100 μM) לבינונית E3 בצינור 15 mL כדי לעכב את חריץ איתות בגיל 40 hpf באופן דומה. כפקד, פנקו עם דימתיל סולפוקסיד 1% בלבד.

2. טכניקות הדמיה

  1. 4-D הלב LSFM הדמיה עם אלגוריתם סינכרון
    1. להשתלט תמונות דו-ממד של העובר דג שלם מרובות הלב פועם מחזורים באמצעות השלבים להלן (איור 1). ודא כי העובי אור גיליונות כ 5 μm. לקחת 500 x-y מסגרות עם מועד החשיפה של גב' 10 ערכת z-הסריקה μm 1 עבור דגימה דיגיטלית ללא אובדן נתונים על-פי עקרון הדגימה נייקוויסט25.
      1. יצירת ג'ל agarose 1% (w/v) על-ידי הוספת 1 גר' agarose 100 מ ל חימום זה עד agarose כל היא התפרקה. לטעון צינור פלסטיק קטן עם העובר, agarose באמצעות פיפטה 20 μL ואבטח אותו על הבמה.
      2. פתחו את התמונה במלונות התוכנה ולחצו על ' חי כדי לראות את התצוגה בשידור חי של המדגם. להתאים את המטרה באמצעות הידית כך המדגם יהיה בפוקוס. באופן דומה, להזיז את הבמה כך התצוגה בשידור חי של המדגם מציגה העליון של העובר.
      3. תמונות פי 500 עבור 5 s ב 10 X הגדלה באמצעות תוכנה של המיקרוסקופ26.
      4. להזיז את הבמה באמצעות המנוע בשכבה חדשה (1 μm ב ציר z) וחזור על התהליך הדמיה.
      5. חזור על הצעדים 2 שלעיל עד בלב שלם לגמרי עם תמונה.
    2. ולהבטיח את שלמות הנתונים על-ידי התעלמות תמונות מחזור הלב הראשון והאחרון. למצוא את התקופה של מחזור הלב על ידי התאמת תמונות שצולמו בנקודת זמן באותו מחזור הלב, אך בתקופות שונות. השתמש במשוואה הבאה שפותחה כדי למצוא את התקופה:
      Equation 1(1)
      כאשר D הוא הפונקציה עלות לשימוש הולם השערה תקופתי, אנימ' בתמונה שנלכדה, τ' הזמן התמונה צולמה, xm zk z-כיוון האינדקס של התמונה, הוא וקטור של מדד פיקסלים, ו- T' הוא ההשערה תקופתיים.
    3. להשתמש במשוואה הבאה כדי למצוא את משמרת יחסי בין שתי התמונות בשלבים דומים:
      Equation 2(2)
      איפה קיוk', k מציין פונקציה עלות למשמרת היחסי, R היא השכונה המרחבי אפשרי, L הוא הזמן הכולל של לכידת התמונה, x הוא z אינדקס, zk ו- פיקסלk' הן הפרוסות z-הכיוון הראשון והשני, טי שווה ו s הוא ההשערה משמרת יחסי.
    4. להמיר את משמרת יחסי shift מוחלטת לגבי התמונה הראשונה ולפתור את המשוואה הקווית באמצעות הגישה הופכי מדומים, כדי למצוא את הקשר המוחלט ליישור בסעיף הבא של תמונות כמו שתואר לעיל27.
    5. התמונות 4-D הסופי עובדו באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (טבלה של חומרים).
      1. תמונות דו-ממד הערימה תלת-ממד
        1. פתחו תמונה מסחרי בתוכנת עיבוד.
        2. לחץ על נתונים פתוח.
        3. בחר את כל התמונות ניתן לערום לתוך תלת מימד > לחץ על טען.
        4. הוסף ב voxel בגודל של 0.65 x 0.65 x 1 > לחץ על אישור.
        5. לחץ על תיבת תצוגה Multi-Planar להמחיש את תמונת תלת-ממדי.
        6. לחץ לחיצה ימנית על התיבה הכחולה slice_1.tiff > בחר תצוגה > בחר Volren.
        7. לחץ על עריכה > בחר אפשרויות > בחר לערוך Colormap.
        8. התאמת צבע בעזרת התיבות במסגרת אדומה > לחץ על אישור.
      2. המרת תלת-ממד ל- 4-D
        1. לחץ על "קובץ > פתח זמן סדרת נתונים.
        2. בחר את tiffs תלת-ממדיים שבוצעו רק > לחץ על טען.
        3. הזן voxel בגודל זהה לפני.
        4. תיבת כחול slice_1.tiff קליק ימני > בחר "תצוגה" > בחר Volren.
        5. לחץ על עריכה > בחר אפשרויות > בחר לערוך Colormap. התאמת צבע בעזרת התיבות > לחץ על אישור.
        6. פקד זמן סדרת קליק ימני > לחץ על הסרטים > לחץ על הפעל כדי לראות את הסרט.
        7. הוספת שם הקובץ, גודל המסגרת, קצב מסגרות, איכות שווה ל- 1, הקלד Monoscopic > לחץ על החל
        8. לייצא את הסרטונים. לפתוח את הוידאו בתוכנה מתאימה.

3. לרביעיית-PCR ניתוח

  1. דג זברה לב RNA בידוד לכמת חריץ ליגנדים, רצפטורים, והקצו הביטויים של גנים
    1. להקריב את דג זברה במינים אותם על מנת יתר של tricaine methylate28,29. באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל30, הלבבות דג זברה היו טוחנות ואני מוכן לבידוד RNA.
    2. לבודד את הרנ א הכולל, לסנתז את cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA ההוראות של היצרן.
    3. לעצב את תחל PCR על ליגנדים דרגה Jag1, Jag2, Dll4, קולטן Notch1bו איתות הקשורים הגנים Nrg1 ו ErbB2. ראו טבלה 3 תחל השתמשנו.
    4. להוסיף את תחל מהשלב 3.1.3 של mRNA מבודד מהשלב 3.1.2, mastermix מסחרי הצלחת ה-PCR. להפעיל את לרביעיית-PCR הטמפרטורה המתאימה והשעות לפי האנזימים בשימוש. לנרמל את התוצאות דג זברה α-אקטין.
      הערה: זה יחשב את רמות ביטוי לכל אחד של ליגנדים, רצפטורים, גנים.

4. ניסויים במבחנה האנושי אבי העורקים אנדותל תא (HAEC)

  1. מודל דינמי מאמץ גזירה
    1. תאים HAEC תרבות HAEC תרבות המדיה. ברגע מלא confluent, לחשוף את התאים כדי זרימה שכבתית וזרימה פועמת של 23 x 10-5 N בקצב של 1 הרץ במשך 24 שעות ביממה.
      1. לחמם EC מדיה/DMEM 10% FBS במים אמבטיה עבור 20 דקות.
      2. לאחזר תאים HAEC מיכל חנקן נוזלי ומניחים את המבחנה לאמבט מים עד נמס.
      3. באמצעות פיפטה 1,000 μL, להסיר תאים המופשרים ולשים אותם בצינור 15 מ"ל עם 3-5 מ של מדיה. Centrifuge הפתרון תא ב g x 53 למשך 3 דקות.
      4. האחות הפתרון מחוץ ומוסיפים מספיק מדיה עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל. להוסיף את הפתרון תא בקבוקון T75 סטרילי, קאפ. הבקבוק והפצה התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.
      5. סמן את הבקבוק עם ראשי התיבות, תאריך, סוג התא ומספר המעבר. דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, עד שהתאים confluent 80%. זכור לשנות את המדיה כל 2-3 ימים.
      6. באמצעות משאבה מסחרי, לצרף את הצנרור. הבקבוק, והגדר את הפרמטרים שהוזכרו לעיל ב שלב 4.1.131,32,33.
    2. להוסיף GI254023X 50 מ של HAEC בינוני-ריכוז הסופי של 5 μM למשך 30 דקות.
    3. עם GI254023X טרום מעורב, מעכב ADAM10 אשר מדכאת את חריץ איתות, לנהל את אותה זרימה שכבתית או זרימה פועמת ניסויים כמו 4.1.1.
    4. לכמת ליגנדים דרגה (Jag1, Jag2, ו- Dll4), דרגה היעד גנים (שעיר, וריח של ספליט [הס]) באמצעות PCR לרביעיית עבור ארבע קבוצות של דגימות HAEC (זרימה שכבתית, זרימה שכבתית + GI254023X, זרימה פועמת, זרימה פועמת + GI254023X) תיארו בעבר32.

5. הצלה וביטוי יתר של חריץ איתות

  1. להזריק 1 nL של mRNA Nrg1 מוכן-ריכוז של pg/nL 5 (מתוך שלב 1.1.6) בשלב 1 - ל 4 תאים עם gata1a מו כדי overexpress דרגה היעד גנים24.
  2. להזריק 1 nL של mRNA Nrg1 לתוך לל מוטציה בדרך דומה24.
  3. להכפיל את הריכוז של ה-mRNA Nrg1 (pg 10/nL) ולהזריק24 1 nL לתוך דג זברה להתבונן המורפולוגיה חדרית.
  4. להזריק 1 nL של pg/nL 20 של EPO mRNA6 לתוך העוברים דג זברה בשלב 1-4-לתא להגדיל hematopoiesis להגדיל WSS חדרית כאמור שמוצג24.
  5. להזריק 1 nL של 50 μM Isoproterenol7, אשר מגביר את הקצב של contractility, למדיום E3 במשך 24 שעות ביממה תוך דג זברה מתורבתים כפי שמוצג בעבר24.
  6. לבצע הדמיה LSFM 4-D עבור כל קבוצה. בצע את ההוראות המופיעות שלבים 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. כימות של קיצור החלקי ועוצמת השינוי לאורך זמן

  1. לבצע הדמיה LSFM 4-D עבור כל קבוצה ב- 50, 75 ו 100 hpf. עקוב אחר ההוראות 2.1.1-2.1.5.2.8 צעדים. מחלקים כל תמונה אז כל הצמתים 600 עבור שכפול של התנועה קיר הלב.
  2. למדוד את השינוי בקוטר של החדר במהלך diastole סיסטולה באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 3(3)
    טעינת תמונות חדרית תלת-ממדי על כל 0.1 s עם תוכנת ויזואליזציה ולמדוד אמצעי האחסון.
  3. מגרש שינוי עוצמת הקול לאורך זמן עבור כל קבוצה ניסיוני ב-75 hpf ו- 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM שימש כתב יד זה על מנת לרכוש תמונות דו-ממד ותלת -ממדיים ברזולוציה גבוהה. כפי שניתן לראות באיור 1A ו- 1B, העדשה תאורה מנחה את הגיליון אור ב המדגם. בגלל דלילות הגיליון אור, מואר רק מטוס בודד. העדשה זיהוי בניצב ממוקם על העדשה תאורה, מתמקדת המטוס מואר (איור 1B). הגיליון אור מן העדשה תאורה סורק את הדגימה משמאל לימין (איור 1C). הסריקה מאפשרת פחות הלבנת-צילום, צילום-רעילות, יש יחס אות לרעש נמוכה יותר.

LSFM היה מוחל על Tg(cmlc2a:gfp) עוברי להמחיש את כל המבנה לב34 מאת מהירה סריקה (> 30 s) עם רזולוציה voxel של 0.65 x 0.65 x 1 מיקרומטר. עקב תאורה מטוס בודד, רעשי הרקע היה מופחת באופן משמעותי (איור 1). רכסים trabecular וצווארי לתוך לומן חדרית ב-75 hpf, ורשת trabecular בבירור, הוצגה 100 hpf (איור 2 א, ב'). Gata1a מו מיקרו-הזרקת מופחת hematopoiesis, צמיגות על ידי4,90%35. צמיגות זו ירידה הקלוש והמודינמיקה מאמץ גזירה, וכתוצאה מכך חניכה מושהית וצפיפות רשת trabecular ב-75 hpf ו- 100 hpf לעומת קבוצת הביקורת (איור 2 C, D). יתר על כן, חלק ליגנדים (Dll4, Jag1, Jag2), קולטן (Notch1b), רכיבים איתות במורד הזרם (Nrg1 ו ErbB2) היו למטה מוסדר בתגובה gata1a מו הזרקה (0.05 <p , n = 5) (איור 2 K)-2,-8,-36. הזרקה משותף של gata1a מו עם 5 μM של ביטוי גנים הקשורים איתות חריץ מוסדר מעלה Nrg1 mRNA ויצירת trabecular שניצלו ב-75 hpf ו- 100 hpf (איור 2E, F, K). לפיכך, gata1a מו מופחתת כוחות והמודינמיקה שמוביל למטה-רגולציה של חריץ איתות, ואילו Nrg1 mRNA להציל מוסדר למעלה גנים הקשורים חריץ ויזם מחדש trabeculation.

כדי להוכיח עוד יותר את ההשערה כי שינוי והמודינמיקה כוחות שלנו ובכך trabeculation דרך חריץ איתות, הצגנו החשבונאי לל זה מתפתח של אטריום כויץ37. בהיעדר תזרים חדרית וכוחות והמודינמיקה בזמן סיסטולה פרפור, לל מוטציות אקספרס התחתונות mRNA הלב של חריץ איתות רכיב הגנים וזה היעד גנים לעומת שולט הנמל-trabeculated, קטן, חלש קבלנות החדרים (איור 2G, L). עם זאת, Nrg1 mRNA מיקרו-הזרקה לתוך המוטציות לל למעלה מוסדר החריץ איתות, בליווי החילוץ חלקית של רכסים trabecular, המוביל אל החדר כויץ מובהק יותר למרות (שאינו כויץ אטריום איור 2 H, L)2. בהקשר זה, המוטציות לל לאשר את היחס בין האטריום כויץ של החדר הלא-trabeculated, דבר המלמד על אפנון והמודינמיקה של trabeculation דרך חריץ איתות.

Tnnt2a מו נמסרה לעצור את התכווצות הלב על ידי עיכוב טרופונין הלב-T-38,-39. הדג המוזרק מו tnnt2a היו לגמרי ללא והשאלה WSS חדרית עקב משמעותי חריץ למטה מוסדר איתות, המוביל אל חלקה חדרית משטח ורזה קיר בהשוואה לקבוצת בקרה (איור 2I, ז) . כדי לבדוק אם WSS על endocardium היה דרישה עבור trabeculation, יש לנו גם מוטציות cloche (שיבוט) אשר endocardium ואת הציפוי אנדותל של הלב אינם מפתחים40,41. המוטציה שיבוט ואיתנה trabeculae לב והראה קטן יותר בגודל החדר, לב לא שלם לולאה (איור 2J). לפיכך, הציפוי endocardial יש צורך הגיוני והמודינמיקה גזירה להפעלת חריץ איתות (איור 2 מ'). עם זאת, כאשר הלחץ הטיה והמודינמיקה הוגדל על ידי הגדלת hematopoiesis או טיפול של isoproterenol כדי להגדיל את contractility, לא להגביר רמות ביטוי של גנים הקשורים חריץ, המורפולוגיה רשת trabecular לא השתנה (איור 3).

להפגין עוד יותר את הקשר בין מאמץ גזירה חריץ איתות, HAECs שימשו לצורך בדיקות במבחנה . זרימה פועמת היה ללחוץ על תאים confluent כדי לדמות את גזירה והמודינמיקה שנצפה על ידי תאי אנדותל. הוא הראה כי בהשוואה לסטטי תרבות, תרבות פועמת מגביר ביטוי של גנים הקשורים דרגה (איור 4). יתר על כן, טיפול עם מעכבי ADAM10 הקטינה באופן משמעותי חריץ איתות (איור 4).

הבא, אנחנו מחושבים חדרית לינוק החלקי, חלל חדרית שינוי עוצמת הקול לאורך זמן פראי-סוג, gata1a מו, AG1478, ואת אלה שניצלו על ידי קבוצות הזרקת Nrg1 50 hpf, 75 hpf, ו- 100 hpf (איור 5 א- ג) . הטיפול עם ErbB איתות מעכב, AG1478, לעכב באופן משמעותי האופטימיזציות לינוק החלקי במהלך diastole חדרית ב-100 hpf (איור 5A). Gata1a מו וטיפול AG1478 שהקטנת גודל תא חדרית בזמן התכווצות, כפי לאומדן את השינויים ב- 4-D LSFM (איור 5E, F). שתי הקבוצות פיתחו מוגברת סוף--. בהתכווצות והתרחבות של אמצעי בהשוואה להפראי-סוג. שיתוף הזרקה של mRNA Nrg1 עם gata1a מו משוחזר לינוק השבר וגם שבריר פליטה כלפי אלה סוג הפרוע.

Figure 1
איור 1 : פלורסנט אור גיליון סקירה. (א) LSFM נציג המערכת היכן ימוקם המדגם החיתוך של הגיליון אור מן העדשה תאורה (IL) ואת הנתיב זיהוי של העדשה זיהוי (DL). (B) העדשה גלילי מאחורי איל יוצר בגודל מיקרון אור הגיליון (סגול) בתוך המדגם, שזה מרגש סדין דק של המדגם. העדשה זיהוי רשומות האות פלורסנט הנפלט. (ג) סכימטי של הגיליון לייזר דק (סגול) שטיחות חלוקתה העובר דג זברה אשר נע ישר לשמאל. איור זה השתנה מ Lee ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : חדרית מורפולוגיות של מניפולציה גנטית Tg(cmlc:gfp) דג זברה עם חריץ ליגנד לקולטן, היעד גנים . (א) trabecular הרשת מוצג ב-75 hpf של דג זברה שליטה. (B) הרשת trabecular ב-100 hpf של דג זברה שליטה. (ג) הזרקה של gata1a מו בשלב 1 - ל 4 תאים הראה קצת כדי לא trabeculation ב-75 hpf. (ד) הזרקה של gata1a מו לתוך דג זברה עיכב הקמת רשת trabecular. (ה) הזרקה משותף של gata1a מו ו mRNA Nrg1 האנושי ששופץ חלקית trabeculation ב-75 hpf. (נ) הזרקה משותף של gata1a מו ו mRNA Nrg1 האנושי כמעט לגמרי שוחזר הרשת trabecular ב-100 hpf. (G) מוטציה לל ב-100 hpf מראה לא trabeculation חדרית קיר חלק. (H) הזרקה של האדם Nrg1 לתוך דג זברה מוטנטים לל ששופץ חלקית trabeculation ב-100 hpf. (I) הזרקה של tnnt2a מו הראה לא trabeculation ב-75 hpf (לא מוצג) ו- 100 hpf. (J) מוטציה שיבוט הראה לא trabeculation ב-100 hpf. (K) הזרקה של gata1a מו הקטינה באופן משמעותי את ביטוי ה-mRNA של Notch1, Nrg1, Jag2 (t-test, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). הזרקה משותף של gata1a מו ו mRNA Nrg1 האנושי גדל באופן משמעותי את הביטוי של Notch1b, Nrg1, ErbB, ו- Jag1 לעומת שליטה. (L) החשבונאי לל היה נמוך משמעותית הביטוי של גנים הקשורים דרגה (מבחן t, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). הזרקה של האדם Nrg1 הגביר את הביטוי של גנים הקשורים חריץ; Jag1 , Jag2 היו גבוהות משמעותית יותר שליטה. (ז) tnnt2a מו הזרקה, שיבוט החשבונאי הראה ביטוי נמוך משמעותית של גנים הקשורים דרגה (מבחן t, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). גודל ברים: 50 μm. הנתונים מוצגים סטיית התקן של הממוצע. איור זה השתנה מ Lee ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הגדלת WSS ב מניפולציות Tg(cmlc:gfp) דג זברה עם חריץ ליגנד, קולטן והיעד ביטוי גנים אין ויוו . הגדלת הקובץ WSS דרך ביטוי יתר של hematopoiesis עם ההזרקה של EPO(א) או תוספת של ISO (B) באמצעות הגברת קצב הלב לא גדלה trabeculation והיה רשת trabecular דומה לזה של הפקד. (ג) ההזרקה של EPO mRNA או Isoproterenol לא שינתה את הביטוי של גנים ליגנד, קולטן או היעד דרגה (מבחן t, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). איור זה השתנה מ Lee ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : תאי אנדותל בכפוף מתנדנדות או פועמת גזירה במבחנה . HAECs בכפוף גזירה פועמת של τממוצע = 30 x 10-5 N/s-הרץ 1 היו ביטויים של גנים הקשורים חריץ upregulated ו downregulated של גנים הקשורים חריץ ביטויים כאשר החומר המדכא ADAM10 הוחל (מבחן t, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). איור זה השתנה מ Lee ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : השפעת trabeculation של שבר לינוק, הוצאה החלקי. (א-ג) תוספת של AG1478 gata1a מו ירד באופן משמעותי לקיצור החלקי ב-100 hpf, אבל שיתוף הזרקה של האדם Nrg1 , gata1a מו שיפר את זה. הזרקת gata1a (ד) ו- AG1478 ירד באופן משמעותי לקיצור החלקי ב-100 hpf (מבחן t, * P < 0.05, n = 5 לעומת שליטה). הזרקה משותף של gata1a ו- Nrg1 mRNA שיפור לקיצור החלקי. (E-F) שילוב של האלגוריתם 4-D סינכרון עם LSFM הראה כי AG1478 ו- gata1a מו גברה בסוף בהתכווצות והתרחבות של אמצעי אחסון ב-75 hpf (ה) ו- 100 hpf (נ). הנתונים מוצגים סטיית התקן של הממוצע. איור זה השתנה מ Lee ואח17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דג זברה Jag1 קדימה CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
לאחור CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
דג זברה Jag2 קדימה AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
לאחור GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
דג זברה Dll4 קדימה CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
לאחור CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
דג זברה BMP10 קדימה GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
לאחור TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
דג זברה ErBb2 קדימה GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
לאחור AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
דג זברה Nrg-1 קדימה GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
לאחור CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
דג זברה Notch1b קדימה CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
לאחור GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

טבלה 3: צבעי בסיס המשמש דג זברה ההקרנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו כי הדמיה 4-D יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפתחות רשת trabecular בתגובה לשינויים בכוחות ביו-מכני. בפרט, הלחץ הטיה מנוסים על ידי תאי אנדותל יוזם את החריץ איתות אשד, אשר בתורו מקדם trabeculation. כתב יד זה, אנחנו הראו כי הזרקת gata1a מו (1) ירידה hematopoiesis, לכן הוא מופחת קיר גזירה, הזרקת tnnt2a מו (2) מעוכבים חדרית הפונקציה כויץ כדי להפחית את הקיר גזירה, ו- (3) לל מוטציות חסרה התכווצות פרפור, ואז להפחתה הכוח והמודינמיקה שהוחל הנוזלים. על-ידי הפחתת הלחץ הטיה על קירות הלב, לכמת חריץ באיתות באמצעות PCR לרביעיית ואנו נמצא כי עם WSS מופחתת, שם היה מופחת חריץ איתות. להוכיח עוד יותר את ההיפותזה שלנו, שיבוט מוטציות חסר endocardium לא יוצרים trabeculae ולאחר העמדת תאי אנדותל פועמת מאמץ גזירה עם ADAM10 הנוכחי הראה שאת מאמץ גזירה מפעילה חריץ איתות.

טכניקות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול לשמש דוגמאות תמונה תלת-ממדית14. עם זאת, טכניקה זו ואחרים יש חסרונות. לדוגמה, ההדמיה קונאפוקלית לא יכול לחדור עמוק לתוך דגימות, יש רזולוציה נמוכה צירית, איטי סריקה מהירויות19,42. בשל מגבלת עומק חדירה בתחום ההדמיה קונאפוקלית, דוגמאות קטנות, כגון דג זברה עוברי, יכול רק לדימות בשלמותו. שני הפוטונים מיקרוסקופיה קונפוקלית משפר את עומק חדירה, אבל הרזולוציה, מהירות סריקה איטית ועלות גבוהה לא רצויה זו טכניקה13. היו מחקרים המשלבים מיקרוסקופ שני הפוטונים LSFM בהצלחה18, עם זאת, החסרונות הם עדיין בולטים42.

LSFM, מצד שני, יש את לפחות הלבנת-צילום, נזק13,18,42, רכישה מהיר מהירות, עומק החדירה דומים13. בנוסף, בגלל עדשות כפול, עירור של מטוס בודד (איור 1), רעשי הרקע הוא מופחת באופן משמעותי43. עם זאת, הדגימות צריך להיות מוטבע ג'לים לשתק את הדגימה, מה שהופך את זה קשה להחיל על מודלים ויוו חוץ דג זברה14,17,19. בנוסף, ניצול של הפלורסנט מגביל את עומק החדירה עד כמה מילימטרים. למרות LSFM היא שיטה מצוינת להמחשת, זה קריטי כי זה השלים עם נתונים כמותיים. בגלל LSFM הוא רק איכותי, זה יכול להיות נתון לפרשנויות שונות. באמצעות לרביעיית-PCR, אנחנו יכולים לאשר כי הדימויים 4-D ' LFSM ' היו ייצוג נכון של האירועים המתרחשים הדגימות בשידור חי. מדי פעם בדגימות גדול יותר, פסים וצללים שיכולים להיווצר התמונות. עם זאת, תאורה דו-צדדית או mSPIM יכול להיות מנוצל כדי להפחית לכלוכים אלה42. מכיוון LSFM הוא כל כך צדדי, היכולת של לכידת ברזולוציה גבוהה ותמונות איכותיות בסך הכל הופך את העתיד של LSFM מבטיח. שהוזכר קודם לכן, LSFM יכול להיות משולב עם מערכות הדמיה אחרות עבור מוצלחת הדמיה18,42.

אנחנו הפגינו בעבר כי החלת גזירה פועמת של 23 x 10-5 N-1 הרץ במשך 24 שעות ביממה באופן משמעותי upregulates חלק איתות במבחנה(איור 4)17. עוד יותר להדגים כי כוחות גזירה להפעיל דרגה איתות על ידי מניפולציה גנטית של hematopoiesis (gata1a מו)4, התכווצות הלב (tnnt1a מו)5, פרפור התכווצות (לל מוטציה), endocardial מחיקה (שיבוט מוטציה), לוקליזציה של חריץ איתות (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). נתאר כאן את זה על-ידי הורדת הלחץ הטיה קיר בחלל, כי גנים הקשורים חריץ היו למטה מוסדר (איור 2 K, L, M). יתר על כן, הצלחנו להדגים כי Nrg1 mRNA הצליח להציל את trabeculation, שחזר חריץ איתות, ולשפר חדרית לינוק החלקי, שבריר פליטה (איור 2E, F, H, K-M, איור 5) . השיקום של תפקוד הלב הוצג על ידי הגדלת כויץ בתיווך פונקציה והמודינמיקה כוחות כי מופעל חריץ איתות (איור 2 K- מ').

אנחנו נקבע גם כי גזירה מופעל חריץ באיתות הוא תלוי endocardial. על-ידי שימוש gata1a מו, tnnt2a מו, לל מוטציה או טיפול AG1478, trabeculation היה עכבות, חריץ איתות היה למטה מוסדר ' (איור 2 K- מ'). עם זאת, Nrg1 שניצלו trabeculation והאיתות דרגה ב לל מוטציות ומתי משותפת הזריק gata1a מו (איור דו-ממדי, H, K, L). כאשר קיר גזירה (הזרקתEPO ) או חריץ איתות (10 pg/nL הזרקת Nrg1 ) הוגדל, שאין כל שינוי בקבוצה EPO במונחים של מורפולוגיה, אך מורפוגנזה ventricular נורמלי היה נוכח ב Nrg1 במינון מוגבר (איור 3).

לסיכום, אנחנו הראו כי mechanotransduction של גזירה מפעילה את החריץ איתות. על-ידי החלת 4-D LSFM, דג זברה מהונדס גנטית, פיתחנו חדש מערכת מודל המציג את זרימת הדם כמה קריטי זה במהלך התפתחות הלב שלה מורפולוגיה, contractility של פונקציה הכוללת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים ברצוננו להביע תודה ויליאם טלבוט מאוניברסיטת סטנפורד למתן את האדם Nrg1 cDNA וכדי דבורה ילון מ UCSD למתן לל מוטציות . המחברים גם רוצה תודה חן סינתיה עוזר עם רכישת התמונה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH HL118650 (טי-קיי Hsiai), HL083015 (ל Hsiai טי-קיי), HD069305 (כדי לא מחובר צ'י, טי-קיי Hsiai.), HL111437 (ל Hsiai טי-קיי, לא מחובר צ'י), HL129727 (ל Hsiai טי-קיי), T32HL007895 (כדי פקרד Sevag ר. ר), HL 134613 (ל Messerschmidt (פ')), האוניברסיטה של טקסס מערכת כוכבים מימון (לי).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 138 המטוס סלקטיבי תאורה מיקרוסקופ חריץ איתות trabeculation ספיקת הדם דג זברה פיתוח לב גזירה הלב 4-מימדי הדמיה mechanobiology הלב מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter