Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å visualisere utvikle hjerter i sebrafisk i 4-dimensjoner (4-D). 4-D tenkelig, via lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM), tar 3-dimensjonale (3D) bilder over tid å rekonstruere utvikle hjerter. Vi viser kvalitativt og kvantitativt at skjæring stress aktiverer endocardial hakk signalering under kammeret utvikling, som fremmer cardiac trabeculation.

Abstract

Hemodynamic krefter oppleves av hjertet innflytelse hjerte utvikling, spesielt trabeculation, som danner et nettverk av forgrening utvekster fra myokard. Genetisk programmet mangler i hakket signalering cascade er involvert i ventrikkel defekter som venstre ventrikkel Non-komprimering kardiomyopati eller Hypoplastic venstre hjertet syndrom. Bruker denne protokollen, kan det fastslås at skjæring stress drevet trabeculation og hakk signalene er knyttet til hverandre. Bruk lys arks fluorescens mikroskopi, var visualisering av utvikle sebrafisk hjertet mulig. I dette manuskriptet ble det vurdert om hemodynamic modulerer initiering av trabeculation via hakk signalering og dermed påvirke kontraktile funksjon oppstår. For kvalitativ og kvantitativ skjæring stress analyse, 4-D (3-D + tid) bildene ble anskaffet under sebrafisk cardiac morphogenesis, og integrert lys arks fluorescens mikroskopi med 4-D synkronisering erobret ventrikkel bevegelse. Blod viskositet ble redusert via gata1a- morpholino oligonucleotides (MO) mikro-injeksjon redusere skjæring stress, dermed ned-regulere hakk signalering og dempe trabeculation. Co injeksjon av Nrg1 mRNA med gata1a MO reddet hakk-relaterte gener for å gjenopprette trabeculation. For å bekrefte skjæring stress drevet hakk signalering påvirker trabeculation, cardiomyocyte sammentrekning arrestert videre via tnnt2a-MO å redusere hemodynamic styrker, dermed ned-regulere hakk målet gener å utvikle en ikke-trabeculated myokard. Endelig ble bekreftelse uttrykk mønstre av skjæring stress-responsive hakk gener utført ved å utsette endotelceller til pulsatile flyt. Dermed avdekket 4-D lys arks mikroskopi hemodynamic styrker underliggende hakk signalisering og trabeculation med klinisk relevans til ikke-komprimering kardiomyopati.

Introduction

Biomekaniske styrker, som hemodynamic skjæring stress, er nært forbundet med hjerte morphogenesis. Svar på hemodynamic skjær krefter utvikle hjerteinfarkt rygger og grooves i en bølge-lignende trabekulært nettverk i tråd med retningen til den skjær stresset over atrioventrikulær (AV) ventil1. CARDIAC trabeculation er nødvendig å øke kontraktile funksjon og hjerteinfarkt masse2. Mutasjoner i hakk signalnettverk trasé føre medfødt hjertefeil hos mennesker og andre virveldyr3. For eksempel har gata1a4 og tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) vist seg å redusere erythropoiesis, mens erytropoietin mRNA (EPO)6 og Isoproterenol (ISO)7 øke rødt blod celler og hjertefrekvens vegg henholdsvis, og derfor skjæring stress (WSS). Videre ErbB2 signalnettverk, nedstrøms av hakk, fremmer cardiomyocyte spredning og differensiering å generere kontraktile kraft, som igjen aktiverer hakk signalering8,9. Det anbefales at skjæring stress styrer hakk signalering drevet trabeculation for ventrikkel utvikling. Foreløpig det er mange studier som forsøker å videre forstå genetisk programmering hendelser som førte til medfødt hjerte feil (CHD)10,11,12, men lite undersøker hvordan mekaniske krefter innflytelse danner sentrum.

For å undersøke de mekaniske kreftene må opptrer på endocardium, nær observasjon i løpet av utviklingsperioden implementeres. Men er det utfordrende å få gode bilder av i vivo slo eksempler på grunn av inherence av tradisjonelle mikroskopi13. For å observere utviklingen over tid i et utvalg, må fysiske snitting og flekker, derfor oppstår13,14,15. Selv om AC confocal mikroskopi er mye brukt til bilde 3-D strukturen prøver14,16, er disse imaging systems oppkjøpet fortsatt begrenset av lav skanning fart.

Lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM) er en unik tenkelig teknikk som lar effekten av in vivo dynamiske hendelser med lang arbeider avstand13. Denne teknikken bruker en lys arks fluorescerende mikroskopi til optisk delen en eksempel17. På grunn av belysning av bare et tynt ark av lys på prøven er det en reduksjon i Foto-bleking og foto toksisitet13,18. Det store feltet og lenge arbeidsavstand gir store prøver å holde intakt som de er fotografert13,14,17. Lav forstørrelsen gir et større område å avbildes, mens langt arbeidsavstand gir tykkere prøver å bli fotografert uten akkord signal-til-støy-forhold. Mange grupper har brukt LSFM til bildet hele embryo17, hjerner14,18, muskler og hjerter19 blant andre vev, viser de ulike typene prøver som kan avbildes.

Selv om tidligere forskning viste redusert hemodynamic skjæring kraft ved å skjule sporene innstrømning eller utstrømming av sebrafisk hjertet, er informasjonen utelukkende kvalitative. Det resulterer i en unormal tredje kammeret, svekket cardiac løkker og svekket ventil formasjon20. 4-D LSFM bilder gir et nytt perspektiv inn i måten hemodynamic skjær krefter påvirker utviklingen av hjerte vev. Disse mekaniske krefter kan aktivere kraft-sensitive signalnettverk molekyler og indusere dannelsen av den trabekulært rygger. På grunn av det ekstra tidsaspektet av 4-D imaging er man i stand til å spore endringer i utviklingen i sanntid, noe som kan føre til nye avsløringer som hadde gått ubemerket tidligere. Sebrafisk er en ideell modell for imaging fordi forskere kan observere en hele vertebrate dyr versus bare celle-celle interaksjoner. Oksygen kan også diffus gjennom hele fosteret, hvilke innrømmer å skje uten avhengig av vaskulære systemet, i motsetning til i pattedyr utvikling. Selv om sebrafisk hjertet mangler lunge organer, som krever en fire-chambered hjerte, er det mange cardiac gener som er bevart mellom sebrafisk og mennesker21.

I dette manuskriptet beskriver vi hvordan du bruker lys arks fluorescens mikroskopi for å image de utvikling trabeculae i sebrafisk hjerter i ulike situasjoner. Først injeksjon gata1a4 eller tnnt2a5 MOs ble brukt til lavere blod viskositet, og derfor WSS. Morfologi av hjertet ble deretter innspilt. I en egen gruppe av fisk, vi økt i WSS ved å tilsette EPO mRNA6 eller isoproterenol7 og observerte resultatene. Vi har også gjennomført en celle studie med forskjellige pulsatile eller oscillasjon strømningshastigheter. Etter bildebehandling hver gruppe, fant vi at WSS kjente av endocardium via hakk signalering starter trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metodene nedenfor ble utført i samsvar med UTA og UCLA IACUC. Disse eksperimentelle gruppene ble brukt med transgene Tg(cmlc2:gfp), mutanter wea (svak atrium) eller n (cloche) : (a) vill-type (WT) kontroll, (b) gata1a MO og (c) tnnt2a MO injeksjoner (tabell 1).

Modell navn Modifisert gener Fenotypen Referanse
Kontroll Wild type Ingen I/T
TG(cmlc2:gfp) CARDIAC myosin lys kjeden Grønn flourescence spesielt uttrykt i myokard 34
Redusert veggen skjæring Stress Svak atrium (wea) mutant Atrium-spesifikke myosin heacy kjeden Atrium ikke avtale, kompakt ventrikkel, tykk hjerteinfarkt vegg, smale lumen, dialated atrium, 37
Cloche (n) mutant I/T Fullstendig fjerning av endocardium, unaturally stort atrium med små ventrikkel, ikke-eksisterende hjerte cushins 41
gata1a MO gata1a  Anemi mangel på røde blodlegemer 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Økt veggen skjæring Stress EPO mRNA Ingen Alvorlig polycytemi, økning i antall sirkulerende blod celler, økt viskositet 6
Isoprotenerol Ingen Økt cardiac rate 7

Tabell 1: Sebrafisk beskrivelser. Definisjoner og beskrivelser av sebrafisk forsøk.

1. studien oppsett

  1. Forberede Nrg1 og EPO mRNA trabeculation hjelpe.
    1. Få menneskelig Nrg1 cDNA og forsterke fra en donor plasmider.
      Merk: Den menneskelige Nrg1 cDNA var begavet fra William Talbot fra Stanford University.
      1. Ta ut nødvendig reagenser og materiell, nemlig PCR mastermix (lagret i 20 ° C), primere (se tabell 2) (lagret i 20 ° C), en PCR plate (oppbevares ved romtemperatur) og en 20 μL pipette (oppbevares ved romtemperatur). Se tabell over materialer for eksempel produkter.
        Table 2
        Tabell 2: Primere for menneskelig Nrg1 kloning.
      2. Forbered mastermix for hver innføring i tre eksemplarer bruker 20 μL pipette. 1 sett med triplicates, bruke 37,5 μL av mastermix, 3 μL DNA-fritt vann, 4,5 μL primer. For mer triplicates, bare multiplisere antall eksempler.
      3. Fortynne fungerende løsning menneskelig Nrg1 cDNA (20 ng/μg konsentrasjon) i primer stripen med DNA-fritt vann slik at det er 10 μL totalt per brønn per prøve.
        Merk: Kontroller at hver løsning under trinn 1.1.1 fordeles jevnt. Dette gjør du ved å blande hver løsning av pipettering opp og ned. For å forhindre kryss-kontaminering, bruk en pipette tips for bare en prøve.
      4. Aliquot Nrg1 cDNA med 10 μL flerkanals pipette ønsket brønner i PCR plate.
      5. Legge til 14,5 μL av mastermix cDNA i brønnene. Bruke en klebrig cover PCR platen til å forsegle brønnene og plassere i PCR maskinen.
      6. Start PCR maskinen og sikre at syklusen når riktig temperatur avhengig av enzymer og primere brukt.
    2. Klone Nrg1 cDNA i plasmider pCS2+ på BamHI og EcoRI nettsteder med overflødig enzymer BamHI og EcoRI å sikre at cDNA er samskrevet i alle plasmider.
      1. Bland Nrg1 cDNA med donor plasmider pCS2+, kommersielt tilgjengelig master bland løsning og primere (tabell 2).
        Merk: Totalt reaksjon volumet skal 50 μL med 25 μL av master mix, 3 μL primere og 1 μL 20 ng/μL donor plasmider med Nrg1 cDNA.
      2. Plasser blandingen fra trinn 1.1.2.1 i PCR maskinen og definere parameterne for å møte følgende spesifikasjoner: 98 ° C for 10 s, 55 ° C i 5 eller 15 s og 72 ° C i 5 s/kb.
      3. Rense PCR produktet bruker en rensing kit følge instruksjonene fra produsenten. Elute produktet i 50 μL av elueringsbufferen.
      4. Fordøye det rensede PCR-produktet og 5 μg av pCS2+ med BamHI og EcoRI separat på 37 ° C for 2t i et 200 μL reaksjon volum. Rens resulterende fordøyelsen med en kommersiell kit og elute i 20 μL og 100 μL Tris-HCl (pH 8.5), henholdsvis.
      5. Ligate 4 μL Nrg1 cDNA og 2 μL fordøyd pCS2+ plasmider i en 25 μL reaksjon med 1 μL ligase katalysator på 16 ° C over natten.
        Merk: Prosedyren kan stoppes her for overnatting inkubasjon.
      6. Bruke 2 μL ligation løsningen fra trinn 1.1.2.5 og transformering i 50 μL av E. coli bakterier celler egnet for kloning (se Tabell for materiale).
    3. Bekreft at transformasjonen fant sted av screening Nrg1 cDNA kloner bruker PCR. Velg kloner tilfeldig og Legg til en løsning av bestemte primere, utvalg og deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).
      Merk: Kontrollene var vektoren (pCS2+) med og uten innsatsen (human cDNA). Ikke plukke for stort for en koloni fordi overdreven bakterier kan hemme PCR.
      1. Velg 8 kolonier fra transformasjon og skjermen pCS2+-Nrg1 kloner bruker PCR primere fra tabell 2.
      2. Kultur en klone med Nrg1 cDNA å isolere pCS2+-Nrg1 plasmider DNA. Vaksinere med 100 μL E. coli bakterier med pCS2+-Nrg1 plasmider til 100 mL LB media og kultur av risting (160 225 RPM) på 37 ° C.
    4. Transfect renset pCS2+-Nrg1 plasmider i HEK-293 celler i en 6-vel plate med en kommersiell transfection reagens følge instruksjonene fra produsenten.
    5. 24 timer etter transfection, lyse cellene med en lyseringsbuffer og kjøre gjennom en SDS side gel, overføre til en gel membran og deretter flekker med anti-Nrg1 antistoff22. Kontroller Nrg1 protein uttrykk med en Western Blot.
      Merk: Kontrollen er en tom pCS2+ plasmider. Kan pauses her hvis gel membran overføring skjer over natten.
    6. Syntetisere Nrg1 mRNA bruker et kommersielt produkt lik som i Tabellen for materiale , og følg produsentens instruksjoner.
      1. Ta 5 μL av pCS2+-Nrg1 DNA fra bakterier isolert kultur og fordøye med NotI i en 200 μL reaksjon for 2t på 37 ° C til linearize plasmider.
      2. Rense den linearisert plasmider med en kommersiell kit og elute i 20 μL Tris-HCl (pH 8.5).
      3. Utføre i vitro transkripsjon med en kommersiell RNA isolering kit i en 20 μL reaksjon med 5 μL linearisert plasmider følge instruksjonene fra produsenten.
      4. Legg den i vitro transkribert Nrg1 til 350 μL RNA lyseringsbuffer og deretter rense med en RNA isolering kit. Elute RNA i 60 μL Tris-HCl (pH 8.5).
      5. Måle RNA konsentrasjonen og lagre-80 ° c for fremtidig bruk.
    7. Følge etter etter skritt 1.1.6.1 - 1.1.6.5 over for EPO cDNA og mRNA forberedelse men klone cDNA i det pCS2 + plasmider på EcoRI og XhoI områder i stedet.
  2. Sette inn Morpholino i sebrafisk
    1. Utforme23 MO injeksjoner bruke en online verktøyet (Tabell for materiale) mot ATG rekkefølgen på gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) og tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3).
    2. Legg gata1a og tnnt2a MO separat nuclease-fri vannet å gjøre de endelige konsentrasjonene av 8 ng/nL og 4 ng/nL, henholdsvis. Gjenta med EPO mRNA med en siste konsentrasjon av 20 pg/nL. Kontroller at det siste bindet er 1 mL.
    3. Injisere 1 nL 8 ng/nL av gata1a MO og 1 nL av 4 ng/nL av tnnt2a MO i separate sebrafisk embryo 1 til 4-cellers scenen å redusere ventrikkel vegg skjæring stress (WSS)24. For å øke WSS, injisere 1 nL av 20 pg/nL EPO mRNA6 i sebrafisk embryoer på 1 - 4-cellen til scenen.
  3. Kjemisk behandle sebrafisk å hemme trabeculation
    1. Ved hjelp av en 20 mL pipette, fortynne 10 mg/mL AG1478 i 1% DMSO E3 medium til en siste konsentrasjon på 5 μM til 30 hpf i en 15 mL tube. Behandle hver fisk med 1% DMSO bare som en kontroll.
    2. Legge til N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butyl ester (DAPT) i 1% DMSO (100 μM) til E3 medium i en 15 mL tube å hemme hakk signalisering på 40 hpf på en lignende måte. Som en kontroll, behandle med bare 1% DMSO.

2. imaging teknikker

  1. 4-D cardiac LSFM Imaging med synkronisering algoritme
    1. Ta 2D-bilder av hele fisken embryoet over flere hjerte slo sykluser med trinnene nedenfor (figur 1). Kontroller at lys arks tykkelsen er ca 5 μm. Ta 500 XY rammer med en eksponeringstid på 10 ms. sett z-skanning til 1 μm for lossless digital prøvetaking ifølge Nyquist prøvetaking prinsippet25.
      1. Opprette en 1% (w/v) agarose gel ved å legge 1 g av agarose til 100 mL og varme den til alle agarose er oppløst. Laste inn et lite plastrør embryoet og agarose ved hjelp av en 20 μL pipette og fest den på scenen.
      2. Åpne bildet ser programvare og klikk Live for å se live view for utvalget. Justere målet med knotten slik at prøven er i fokus. Tilsvarende flytte scenen slik at live på utvalget viser toppen av fosteret.
      3. Ta bilder 500 ganger for 5 s på 10 X forstørrelse bruker visningskroppen programvare26.
      4. Flytt scenen ved hjelp av motor på et nytt lag (1 μm i z-aksen), og gjenta dette tenkelig.
      5. Gjentagelse over 2 skritt til hele hjertet er fullt fotografert.
    2. Sikre dataintegritet ved å ignorere og kardiale syklus bildene. Finn perioden av cardiac syklusen av matchende bilder som ble tatt på samme tidspunkt i cardiac syklus, men i forskjellige perioder. Bruk denne formelen som ble utviklet for å finne perioden:
      Equation 1(1)
      der D er funksjonen kostnader brukes for montering en periode hypotese, jegm bildet, τ' tid bildet ble tatt, zk z-retningen indeksen for bildet, xm er den vektoren for pixel indeksen, og T' er periodiske hypotesen.
    3. Bruke følgende ligning for å finne det relative skiftet mellom to bilder i lignende stadier:
      Equation 2(2)
      der Qk ", k betegner en kostnad funksjon for relativ skiftet, R er mulig romlige nabolaget, L er den totale tiden for fanger bildet, x er pixel indeks, zk og zk" er den første og andre z-retningen skiver t er tid og s er den relative SKIFT.
    4. Konvertere relative skiftet til absolutt SKIFT når det gjelder det første bildet og løse formelen ved hjelp av pseudo omvendt tilnærming, finne absolutt forholdet justere avsnittet bilder som tidligere beskrevet27.
    5. Den endelige 4 D-bilder ble behandlet med bildebehandling (Tabell for materiale).
      1. 2D-bilder i 3D
        1. Åpne en kommersiell bildebehandling.
        2. Klikk Åpne.
        3. Velg alle bildene skal lagres i 3D > Klikk Last inn.
        4. Legge for voxel 0,65 x 0,65 x 1 > Klikk OK.
        5. Klikk boksen Multi-Planar Vis å visualisere 3-D bildet.
        6. Høyreklikk boksen blå slice_1.tiff > Velg Vis > Velg Volren.
        7. Klikk Rediger > valg > Velg Rediger fargekartet.
        8. Justerer fargen ved hjelp av boksene uthevet i rødt > Klikk OK.
      2. Konvertere 3D til 4-D
        1. Klikk "fil > Åpne tid seriedata.
        2. Velg de 3D TIFF som var bare gjort > Klikk Last inn.
        3. Angi samme voxel størrelse som før.
        4. Høyreklikk boksen blå slice_1.tiff > Velg "Vis" > Velg Volren.
        5. Klikk Rediger > valg > Velg Rediger fargekartet. Justerer fargen ved hjelp av boksene > Klikk OK.
        6. Høyreklikk Serien Tidskontroll > Klikk Movie maker > Trykk spill for å se filmen.
        7. Legge til et navn, rammestørrelse, bildefrekvens, kvalitet lik 1, skriver Monoscopic > Klikk på Bruk
        8. Eksportere videoen. Åpne video i en passende programvare.

3. qRT PCR analyse

  1. Sebrafisk hjerte RNA isolasjon for å kvantifisere hakk ligander, reseptorer, og målrette gener uttrykk
    1. Ofre sebrafisk av subjecting dem til en overdose av tricaine methylate28,29. Bruker en tidligere beskrevet protokollen30, ble sebrafisk hjerter excised og forberedte RNA isolasjon.
    2. Isolere den totale RNA og syntetisere cDNA ved hjelp av cDNA syntese kit følge instruksjonene fra produsenten.
    3. Utforme PCR primere for hakk ligander Jag1, Jag2, Dll4, reseptoren Notch1bog signaliserer relatert gener Nrg1 og ErbB2. Se tabell 3 primerne vi brukte.
    4. Legg primerne fra trinn 3.1.3, den isolerte mRNA fra trinn 3.1.2 og en kommersiell mastermix til PCR plate. Kjøre den qRT PCR riktig temperatur og tid etter enzymer brukes. Normalisere resultatene til sebrafisk α-utgangen.
      Merk: Dette vil beregne uttrykket nivåene for hver ligander, reseptorer og gener.

4. in vitro menneskelige aorta Endothelial celle (HAEC) eksperimenter

  1. Dynamisk skjæring Stress modell
    1. Kultur HAEC celler med HAEC kultur medier. Når fullt confluent, utsette cellene laminær strømning og pulsatile flyt av 23 x 10-5 N frekvensen av 1 Hz 24 h.
      1. Varm opp EF media/DMEM 10% FBS i en vann bad for 20 min.
      2. Hente HAEC celler fra flytende nitrogen tank og plasser ampullen i vannbad til smeltet.
      3. Bruke en 1000 μL pipette, fjerne tinte celler og sette dem i en 15 mL tube med 3-5 mL av media. Sentrifuge celle løsningen 53 x g i 3 minutter.
      4. Sug opp løsningen av og legge nok medier for et totalt volum på 10 mL. Legge til celle løsningen i et sterilt MT75 kolbe, cap kolbe og distribuere cellene jevnt fordelt på bunnen av platen.
      5. Merk flasken initialer, dato, celle type og passasje tall. Inkuber kolbe ved 37 ° C, 5% CO2, til celler er 80% confluent. Husk å endre media hver 2-3 dager.
      6. Bruker en kommersiell pumpe, koble slangen til kolbe, og angi parametere for ovennevnte trinn 4.1.131,32,33.
    2. Legge til GI254023X 50 mL av HAEC medium i en siste konsentrasjon på 5 μM i 30 min.
    3. Med den ferdigblandet GI254023X, en ADAM10 inhibitor som undertrykker hakk signalnettverk, utføre den samme laminær strømning eller pulsatile flyt eksperimenter som 4.1.1.
    4. Kvantifisere hakk ligander (Jag1, Jag2, og Dll4) og hakk målet gener (hårete og enhancer Split [HMS]) bruker qRT PCR for fire grupper av HAEC prøver (laminær strømning, laminær strømning + GI254023X, pulsatile flyt, pulsatile flow + GI254023X) beskrevet tidligere32.

5. hjelpe og over-uttrykk for hakk signalisering

  1. Injisere 1 nL av forberedt Nrg1 mRNA i en konsentrasjon av 5 pg/nL (fra trinn 1.1.6) på 1-4-cellen til scenen med gata1a MO for å overexpress hakk målet gener24.
  2. Injisere 1 nL av Nrg1 mRNA i wea mutant i en lignende måte24.
  3. Dobbel konsentrasjonen av Nrg1 mRNA (10 pg/nL) og injisere24 1 nL i sebrafisk å observere ventrikkel morfologi.
  4. Injisere 1 nL av 20 pg/nL EPO mRNA6 i sebrafisk embryoer på 1-4-cellen til scenen å utvide hematopoiesis for å øke ventrikkel WSS som tidligere vist24.
  5. Injisere 1 nL av 50 μM Isoproterenol7, noe som øker frekvensen av contractility, til E3 medium for 24 timer mens sebrafisk er kultivert som tidligere vist24.
  6. Utføre 4-D LSFM imaging for hver gruppe. Følg instruksjonene i trinn 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. kvantifisering av brøk forkorte og volum over tid

  1. Utføre 4-D LSFM imaging for hver gruppe på 50 og 75 100 hpf. Følg instruksjonene i trinn 2.1.1-2.1.5.2.8. Dele hvert bilde så hver har 600 noder for replikering av cardiac veggen bevegelsen.
  2. Mål endringen i diameter av ventrikkel diastolen og Systolen bruker følgende formel:
    Equation 3(3)
    Laste 3D ventrikkel bilder på hver 0,1 s med visualisering programvare og måle volumet.
  3. Plot at volumet skal endres over tid for hver forsøksgruppen på 75 hpf og 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM ble brukt i dette manuskriptet for å skaffe 2D og 3D-bilder med høy oppløsning. Som vist i figur 1A og 1B, leder belysning linsen lys arket på prøven. På grunn av thinness av lys arket lyser bare et enkelt fly. Gjenkjenning objektivet er plassert vinkelrett på belysning linsen og er fokusert på opplyst flyet (figur 1B). Lys arket på belysning objektiv skanner deretter prøven fra venstre til høyre (figur 1 c). Skanning gir mindre Foto-bleking, foto-toksisitet, og har en lavere signal-til-støy-forhold.

LSFM er brukt på Tg(cmlc2a:gfp) embryo visualisere hele hjerte strukturen34 ved rask skanning (> 30 s) med voxel oppløsning av 0,65 x 0,65 x 1 µm. på grunn av en enkelt flyet belysning, bakgrunnsstøy var betydelig redusert (Figur 1). Trabekulært rygger utsparinger stakk i ventrikkel lumen på 75 hpf, og et trabekulært nettverk tydelig ble vist på 100 hpf (figur 2A, B). Gata1a MO mikro-injeksjon redusert hematopoiesis og viskositet med 90%4,35. Denne redusert viskositet dempes hemodynamic skjæring stress, resulterer i en forsinket initiering og tetthet av trabekulært nettverk på 75 hpf og 100 hpf sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2 C, D). Videre hakk ligander (Dll4, Jag1og Jag2), reseptor (Notch1b), og nedstrøms signalnettverk komponenter (Nrg1 og ErbB2) var ned-regulert svar på gata1a MO injeksjon (p < 0,05, n = 5) (figur 2 K)2,8,36. Co injeksjon av gata1a MO med 5 μM Nrg1 mRNA opp-regulert hakk signalering-relaterte genuttrykk og reddet trabekulært formasjon på 75 hpf og 100 hpf (figur 2E, F, K). Dermed gata1a MO redusert hemodynamic styrker fører til ned-regulering av hakk signalnettverk, mens Nrg1 mRNA redde opp-regulert hakk-relaterte gener og re startet trabeculation.

For å ytterligere bevise vår hypotese som endrer hemodynamic styrker og dermed trabeculation via hakk signalnettverk, vi introdusert wea mutant utvikler som en ikke-kontraktile atrium37. I fravær av ventrikkel tilsig og hemodynamic styrker under atrial Systolen, wea mutanter express lavere cardiac mRNA nivåer av hakk signalering komponent gener og målet gener sammenlignet med kontroller og havn ikke-trabeculated, liten og svakt avtalen ventriklene (figur 2 g, L). Men regulert Nrg1 mRNA mikro-injeksjon i wea mutanter opp-hakket signalveien, ledsaget av delvis redning av trabekulært rygger, fører til en mer markert kontraktile ventrikkel til tross for en ikke-kontraktile atrium ( Figur 2 H, L)2. I denne sammenheng bekreftet wea mutanter forholdet mellom ikke-kontraktile atrium og en ikke-trabeculated ventrikkel, understreker hemodynamic modulering av trabeculation via hakk signalering.

Tnnt2a MO ble levert for å stoppe cardiac sammentrekning begrenser cardiac troponin T38,39. Tnnt2a MO-injisert fisken var helt blottet for sirkulasjon og ventrikkel WSS på grunn av betydelig ned-regulert hakk signalnettverk, som fører til en glatt ventrikkel overflate og tynn vegg sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2I, M) . For å undersøke om WSS på endocardium var en forutsetning for trabeculation, har vi også cloche (n) mutanter som endocardium og endothelial bekledningen av hjertet ikke utvikle40,41. N mutant mislyktes å utvikle hjerte trabeculae og viste mindre størrelse ventrikkel og ufullstendig cardiac looping (figur 2J). Dermed er endocardial fôr nødvendig å mening hemodynamic skjæring stress å aktivere hakk signalering (figur 2 M). Men når hemodynamic skjær stress ble økt ved å øke hematopoiesis eller behandling av isoproterenol å øke contractility, uttrykk nivåene av hakk-relaterte gener økte ikke, og trabekulært nettverk morfologi endre ikke (Figur 3).

For å ytterligere vise forholdet mellom skjæring stress og hakk signalering, ble HAECs brukt i vitro tester. En pulsatile flyt ble utøvet på confluent celler å simulere hemodynamic skjær stress observert av endotelceller. Det vises at sammenlignet med statisk kultur, pulsatile kultur øker uttrykk for hakk-relaterte gener (Figur 4). Videre redusert behandling med den ADAM10 inhibitor betydelig hakk signalering (Figur 4).

Neste, vi beregnet ventrikkel brøk forkorte og ventrikkel hulrom endring i volum over tid for det vill-type, gata1a MO, AG1478, og de reddet av Nrg1 injeksjon grupper på 50 hpf, 75 hpf, og 100 hpf (figur 5A- C) . Behandling med ErbB signalering inhibitor, AG1478, betydelig forsinket og redusert brøk forkorte under ventrikkel diastolen 100 hpf (figur 5A). Både gata1a MO og AG1478 behandling redusert ventrikkel kammer størrelse under kontraksjon, som vurdert av endringene i 4-D LSFM (figur 5E, F). Begge grupper utviklet en økt slutten-systolisk og -diastolisk volum sammenlignet med vill-type. Co injeksjon av Nrg1 mRNA med gata1a MO gjenopprettet både brøk forkorte og utstøting brøkdel mot wild-type.

Figure 1
Figur 1 : Fluorescerende lys ark oversikt. (A) representant LSFM systemet der utvalget er plassert i skjæringspunktet mellom lys arket på belysning objektiv (IL) og oppdagelsen banen til gjenkjenning objektivet (DL). (B) sylindriske linsen bak IL oppretter mikron-størrelse lett arket (lilla) i prøven, som interesserer et tynt ark av prøven. Gjenkjenning linsen registrerer slippes ut fluorescerende signalet. (C) en skjematisk av tynne laser arket (lilla) optisk snitting sebrafisk embryoet som flytter høyre til venstre. Dette tallet er endret fra Lee et al17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Ventrikulær morphologies av genetisk manipulerte TG(cmlc:gfp) sebrafisk med hakk Ligand, reseptor og målet genuttrykk. (A) trabekulært nettverket vises på 75 hpf av kontroll sebrafisk. (B) trabekulært nettverket på 100 hpf av kontroll sebrafisk. (C) injeksjon av gata1a MO på 1 - 4-cellen til scenen viste liten eller ingen trabeculation på 75 hpf. (D) injeksjon av gata1a MO i sebrafisk hadde forsinket trabekulært nettverk formasjon. (E) co injeksjon av gata1a MO og menneskelig Nrg1 mRNA delvis restaurert trabeculation på 75 hpf. (F) co injeksjon av gata1a MO og menneskelig Nrg1 mRNA nesten fullstendig restaurert trabekulært nettverket på 100 hpf. (G) wea mutant 100 hpf viser ingen trabeculation og en glatt ventrikkel vegg. (H) injeksjon av menneskelig Nrg1 i wea mutant sebrafisk delvis restaurert trabeculation 100 hpf. (I) injeksjon av tnnt2a MO viste ingen trabeculation på 75 hpf (vises ikke) og 100 hpf. (J) n mutant viste ingen trabeculation på 100 hpf. (K) injeksjon av gata1a MO betydelig redusert mRNA uttrykk for Notch1, Nrg1, og Jag2 (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Co injeksjon av gata1a MO og menneskelig Nrg1 mRNA betydelig økt uttrykk for Notch1b, Nrg1, ErbB, og Jag1 forhold til kontroll. (L) wea mutant hadde betydelig lavere uttrykket av hakk-relaterte gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Injeksjon av menneskelig Nrg1 økt uttrykk for hakk-relaterte gener; Jag1 og Jag2 var betydelig høyere enn kontroll. (M) tnnt2a MO injeksjon og clo mutant viste et betydelig lavere uttrykk for hakk-relaterte gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Skalere barer: 50 μm. Dataene vises som mener standardavviket. Dette tallet er endret fra Lee et al17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Øke WSS i manipulert TG(cmlc:gfp) sebrafisk med hakk ligand, reseptor og target genuttrykk i vivo . Økende WSS via over-uttrykk for hematopoiesis med injeksjon av EPO(A) eller tillegg av ISO (B) via øke hjertefrekvensen økte ikke trabeculation og hadde et trabekulært nettverk ligner på kontrollen. (C) injeksjon av EPO mRNA eller Isoproterenol ikke endre uttrykket av hakk ligand, reseptor eller mål gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Dette tallet er endret fra Lee et al17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Endotelceller underlagt oscillasjon eller pulsatile skjæring stress i vitro . HAECs kan pulsatile skjær stress τgjennomsnittlig = 30 x 10-5 N/s ved 1 Hz hadde upregulated hakk-relaterte genet uttrykk og downregulated av hakk-relaterte genet uttrykk når den ADAM10 inhibitor ble brukt (t-test, * P < 0,05, n = 5 VS kontroll). Dette tallet er endret fra Lee et al17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Effekten av trabeculation brøk forkorte og utstøting brøkdel. (A-C) AG1478 og gata1a MO betydelig redusert brøk forkorte 100 hpf, men co injeksjon av menneskelig Nrg1 og gata1a MO bedre it. (D) gata1a injeksjon og AG1478 betydelig redusert brøk forkorte 100 hpf (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontroll). Co injeksjon av gata1a og Nrg1 mRNA forbedret brøk forkorte. (E-F) Integrere 4-D synkronisering algoritmen med LSFM viste at AG1478 og gata1a MO hadde økt slutten systolisk og diastolisk volumer på 75 hpf (E) og 100 hpf (F). Dataene vises som mener standardavviket. Dette tallet er endret fra Lee et al17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sebrafisk Jag1 Fremover CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Bakover CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Sebrafisk Jag2 Fremover AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Bakover GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Sebrafisk Dll4 Fremover CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Bakover CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Sebrafisk BMP10 Fremover GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Bakover TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Sebrafisk ErBb2 Fremover GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Bakover AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Sebrafisk Nrg-1 Fremover GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Bakover CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Sebrafisk Notch1b Fremover CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Bakover GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabell 3: Primere brukt sebrafisk screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen, har vi vist at 4-D bildebehandling kan brukes til å spore utviklingen av et trabekulært nettverk svar på endringer i biomekaniske styrker. Spesielt starter skjær stress erfarne av endotelceller hakket signalering cascade, som igjen fremmer trabeculation. I dette manuskriptet har vi vist at (1) gata1a MO injeksjon redusert hematopoiesis og derfor det redusert veggen skjæring stress, (2) tnnt2a MO injeksjon hemmet ventrikulær kontraktile funksjonen for å redusere veggen skjæring stress, og (3) wea mutanter manglet atrial kontraksjon, som deretter redusert hemodynamic kraften til ventrikkel. Ved å redusere skjæring stress på cardiac veggene, vi kvantifisert hakk signalene via qRT PCR og fant at med redusert WSS, det var redusert hakk signalering. For å ytterligere bevise vår hypotese, tranen mutanter som manglet endocardium form ikke trabeculae, og utsette endotelceller til pulsatile skjæring stress med ADAM10 stede viste at skjæring stress aktiverer hakk signalering.

De andre Bildeteknikker som AC confocal mikroskopi kan brukes til bilde eksempler i 3D14. Men har denne teknikken og andre mange ulempene. For eksempel AC confocal avbilding trenge ikke dypt inn i prøvene, har lav aksial oppløsning og langsom skanning hastigheter19,42. På grunn av dybdegrense for penetrasjon i AC confocal bildebehandling, kan bare små utvalgene, for eksempel sebrafisk embryoer, avbildes i sin helhet. To-fotonet AC confocal mikroskopi forbedrer gjennomtrenging dyp, men oppløsning, langsom skannehastighet og høye kostnader gjør denne teknikken uønskede13. Det har vært studier som kombinerer to-fotonet mikroskopi og LSFM er18, men ulempene er fortsatt fremtredende42.

LSFM, derimot, har minst Foto-bleking og skade13,18,42, rask oppkjøpet hastighet og lignende gjennomtrenging dyp13. Dessuten to linser og magnetisering av et enkelt fly (figur 1)er bakgrunnsstøy vesentlig redusert43. Prøvene må imidlertid å gels å nakkens prøven, som gjør det vanskelig å bruke i vivo modeller enn sebrafisk14,17,19. Utnyttelse av fluorescerende lys begrenser også, dybden penetrasjon til noen få millimeter. Selv om LSFM er en flott metode for visualisering, er det avgjørende at det er supplert med kvantitative data. LSFM er bare kvalitative, kan det være gjenstand for ulike tolkninger. Bruker qRT PCR, kan vi bekrefte at LFSM 4-D bildene var en riktig representasjon av hendelser som forekommer i live prøvene. Noen ganger i større prøver, kan striper og skygger danne i bildene. Imidlertid kan tosidig belysning eller mSPIM benyttes for å redusere disse gjenstander42. LSFM er så allsidig, gjør dens evnen å fange høy oppløsning og generelt bedre bildekvalitet fremtidens LSFM lovende. Nevnt tidligere, kan LSFM kombineres med annet tenkelig systemer for vellykket tenkelig18,42.

Vi viste tidligere som bruker en pulsatile skjæring stress av 23 x 10-5 N ved 1 Hz 24 h vesentlig upregulates hakk signalnettverk i vitro(Figur 4)17. Vi ytterligere demonstrert at skjær krefter aktivere hakk signalering av genetisk manipulering av hematopoiesis (gata1a MO)4, hjerte sammentrekning (tnnt1a MO)5, atrial kontraksjon (wea mutant), endocardial sletting (n mutant) og lokalisering av hakk signalering (vs [flk:mCherry; tp1:gfp]). Vi beskriver her som ved å senke veggen skjær stress i ventrikkel, at hakk-relaterte gener var ned-regulert (figur 2 K, L, M). Videre, vi klarte å demonstrere at Nrg1 mRNA var i stand til å redde trabeculation, hakk signalering og forbedre ventrikkel brøk forkorte og utstøting brøkdel (figur 2E, F, H, K-M, figur 5) . Restaurering av hjertefunksjon ble vist ved økningen kontraktile funksjonen-mediert hemodynamic styrker som aktivert hakk signalering (Figur 2 K- M).

Vi har også bestemt at skjæring stress-aktivert hakk signalene er endocardial avhengige. Ved hjelp av gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutant eller AG1478 behandling, trabeculation var hemmet og hakk signalering var ned-regulert (Figur 2 K- M). Men Nrg1 reddet trabeculation og hakk signalering i wea mutanter og når co injisert med gata1a MO (figur 2D, H, K, L). Når veggen skjæring stress (EPO injeksjon) eller hakk signalering (10 pg/nL Nrg1 injeksjon) ble økt, var det ingen endring i gruppen EPO i morfologi, men var unormale ventrikulær morphogenesis i Nrg1 økt dose (Figur 3).

I konklusjonen, har vi vist at mechanotransduction av skjæring stress aktiverer hakket signalveien. Ved å bruke 4-D LSFM og genmodifiserte sebrafisk, vi utviklet en ny modellsystem som viser hvordan kritiske blodstrøm er under hjerte utvikling til morfologi, contractility og overordnet funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til William Talbot fra Stanford University for å gi menneskelige Nrg1 cDNA og Deborah Yelon fra UCSD for å gi den Wea mutanter. Forfatterne vil også gjerne takke Cynthia Chen for å hjelpe med bildeopptak. Denne studien ble støttet av tilskudd NIH HL118650 (til T.K. Hsiai), HL083015 (til T.K. Hsiai), HD069305 (til NC Chi og T.K. Hsiai.), HL111437 (til T.K. Hsiai og NC Chi), HL129727 (til T.K. Hsiai), T32HL007895 (til R.R. Sevag Packard), HL 134613 (å V. Messerschmidt) og Universitetet i Texas System stjerner finansiering (til J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Bioteknologi problemet 138 selektiv flyet belysning mikroskopi hakk signalering trabeculation hemodynamics sebrafisk hjerte utvikling skjæring stress 4-dimensjonale hjertet bildebehandling mechanobiology hjertet lys ark fluorescens mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter