Summary
Het doel van dit protocol is voor het uitvoeren van in situ hybridisatie op volwassen koraal monsters die zijn ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia's. Dit is een kwalitatieve methode gebruikt voor het visualiseren van de ruimtelijke uitdrukking van een sonde van de anti-zin RNA in paraffine-ingebedde weefsels.
Abstract
Koralen zijn belangrijke Oceaan-ongewervelde dieren die kritisch zijn voor de algehele gezondheid van de Oceaan, alsmede de gezondheid van de mens. Echter, als gevolg van menselijke invloed zoals stijgende oceaan temperaturen en de verzuring van de Oceaan, koralen zijn steeds meer bedreigd. Om deze uitdagingen aan te pakken, vooruitgang in de cel- en moleculaire biologie gebleken doorslaggevend zijn voor de diagnose van de gezondheid van koralen. Wijzigen van aantal van de technieken die vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde, kan onderzoekers kunnen behandelen en opslaan van koralen aanzienlijk verbeteren. Om aan te pakken dit, is een protocol voor in situ hybridisatie hoofdzakelijk gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie aangepast voor gebruik in volwassen koralen onder stress.
Het doel van deze methode is om te visualiseren de ruimtelijke uitdrukking van een RNA-sonde in volwassen koraal weefsel dat is ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia's. Deze methode richt zich op de verwijdering van paraffine en rehydratie van het monster, voorbehandeling van het monster te waarborgen van de permeabiliteit van de steekproef, de kruising van de pre-incubatie, kruising van de RNA-sonde en visualisatie van de RNA-sonde. Dit is een krachtige methode bij het gebruik van niet-modelorganismen om te ontdekken waar specifieke genen worden uitgedrukt, en het protocol kan gemakkelijk aangepast voor andere niet-model-organismen. De methode is echter beperkt, in die zin dat het vooral kwalitatieve, omdat de expressie intensiteit kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid tijd gebruikt tijdens de stap van visualisatie en de concentratie van de sonde. Geduld is bovendien vereist, als dit protocol kan nemen tot 5 dagen (en in veel gevallen, langere) afhankelijk van de sonde wordt gebruikt. Tot slot, niet-specifieke achtergrondkleuring is gemeenschappelijk, maar deze beperking kan worden overwonnen.
Introduction
Koralen zijn kritische ecosysteem bouwers en belangrijk is voor de biodiversiteit in de Oceaan en de gezondheid van de mens1,2,3. Ze worden bedreigd als gevolg van de klimaatverandering en andere antropogene stressoren en vele soorten koraal worden beschouwd als kritisch bedreigde. Er is dus behoefte aan een belangrijke cellulaire en moleculaire tools voor de diagnose van koralen onder stress. Ook, er is weinig begrepen over waar de genen binnen volwassen koraal weefsel, en dus weinig begrip van de functies van deze genen worden uitgedrukt. Om dit probleem te verhelpen, hebben we het in situ hybridisatie (ISH) protocol, vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie, voor gebruik op paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van volwassen koralen aangepast. Deze techniek is het meest krachtige wanneer gebruikt op volwassen koralen die een stressvolle gebeurtenis zoals blootstelling aan hittestress hebben ondergaan. Echter, deze techniek kan worden gebruikt op een breed scala van weefsels en levensfasen in koralen en is niet beperkt tot alleen warmte-benadrukt koralen4,6,7. Deze techniek kan bovendien worden gebruikt op weefsels of cellen van een metazoan, zolang er cDNA opeenvolgingsinformatie beschikbaar is.
Het doel van deze methode is om te visualiseren van RNA sondes binnen volwassen koraal weefsel dat is bewaard gebleven en ingebed in paraffine en gesegmenteerd in dia's. Deze methode is een krachtig diagnostisch hulpprogramma waarmee voor de visualisatie van nucleïnezuren binnen volwassen koraal weefsel. In eerste instantie deze methode werd ontwikkeld voor medische diagnostiek, en het is sindsdien een populaire tool op gebieden zoals ontwikkelingsbiologie en evolutionaire ontwikkelingsbiologie8,9,10. ISH is ook een kritische methode, met name in de niet-modelsystemen, wanneer genomic en transcriptomic sequencedata zijn beschikbaar maar ruimtelijke gen expressiepatronen zijn onbekend. Voor diagnostische werk in niet-modelsystemen is deze techniek krachtig omdat het aangeven kunt welke cellen en weefsels express een gen van belang en tot meer gerichte therapeutische benaderingen8,9,10leiden kunnen, 11,12. Tot slot, deze techniek is kwalitatieve en krachtiger wanneer in paren gerangschikt met kwantitatieve gen expressie gegevens11.
De in dit document geschetste benadering zal van belang zijn voor onderzoekers die reeds een heksenkruid (DIG) ontworpen-label RNA sonde (zowel de betekenis en antisense sondes) en zijn nu klaar om uit te voeren in situ hybridisatie van de sondes op een steekproef. Voor het uitvoeren van deze methode, zal twee seriële secties van een paraffine koraal weefsel nodig zijn voor elke sonde wordt getest. Één sectie zal worden gebruikt voor de zin sonde en de andere voor de antisense sonde. De sonde zin zullen een besturingselement aan niet-specifieke binding. Als de kleuring wordt waargenomen in de sonde zin, vervolgens is de antisense sonde niet specifiek voor het RNA van belang. Sondes kunnen worden ontworpen voor elk gen uitgedrukt. In dit protocol, verschillende voorbeelden worden gebruikt die eerder werden gevonden tijdens hittestress in koralen worden uitgedrukt: FBJ lymfkliertest Osteosarcoom virale oncogen homolog B (Fos-B), Activator eiwit (AP1), en Tumor necrose factor receptor (TNFR 41) – 4111. ISH met behulp van de DIG-geëtiketteerden RNA sondes heeft de voorkeur boven het gebruik van radioactieve sondes, omdat de behandeling veel veiliger10 is. Bovendien, deze techniek is zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd op een breed scala van weefsels en de embryo's dan warmte-benadrukt volwassen koralen13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. verwijdering van paraffine
Let op: Voer de volgende stappen uit onder een zuurkast.
- Dewax de dun-gesegmenteerd paraffine-ingebedde dia's met 100% xyleen onder de motorkap in glazen potten van de Coplin gedurende 10 minuten. Gebruik geen plastic potten van de Coplin, zoals xyleen plastic smelt. Het steriliseren van de potten van de Coplin in een autoclaaf vóór gebruik.
- Bereiden van vier steriele glazen potten van de Coplin met devolgende: 100% ethanol, 80% ethanol, ethanol 70% en 60% ethanol. Verdun de ethanol met RNase-gratis water.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 100% ethanol en geniet ze gedurende 10 minuten. Na 10 min, de glazen Coplin pot leeg en vervangen door nieuwe 100% ethanol. Geniet van de dia's weer voor 10 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 80% ethanol voor 1 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 70% ethanol voor 1 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 60% ethanol voor 1 min.
2. voorbehandeling van dia's voor bereiding van RNA sonde hybridisatie
- Voer de volgende wast bij kamertemperatuur, tenzij anders is bepaald. Kamer temperatuur wast op een roteerschudapparaat op een langzame snelheid uitvoeren. Steriele dia mailers met ruimte voor maximaal vijf dia's voor het wassen van de dia's gebruiken
- De dia's overbrengen in een steriele dia mailer met 18 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Giet af de PBS 1 x, en het weefsel onmiddellijk te behandelen op de dia's met proteïnase K om sonde penetratie van het weefsel. Ongeveer 18 mL proteïnase K-oplossing toevoegen aan de dia-mailer (Zie tabel 1 voor concentratie voorraadoplossing werken). Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Niet schudden.
- Terwijl de dia's aan het broeden zijn, bereiden de prehybridization buffer (Prehybe Buffer). Plaats de Prehybe Buffer in een kokend waterbad voor 10 min, dan koel op een ijsbad gedurende 5 minuten. Voor een recept van de Buffer van de Prehybe, Zie tabel 1.
- Stoppen van vertering van het proteïnase K-reactie door gieten de proteïnase K-oplossing, en 18 mL van 0,2% glycine-PBS-oplossing onmiddellijk vergroten met de dia-mailer. Laat de dia mailer zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Giet de 0,2% glycine-PBS oplossing en 2 x zoute Natriumcitraat (SSC) oplossing 18 mL toevoegen aan elke dia mailer. Wassen van de dia's in de 2 x SSC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, met het schudden van 100-150 toeren per minuut.
3. prehybridization van dia's in voorbereiding voor RNA sonde hybridisatie
- Terwijl de dia's worden gewassen met 2 x SSC, krijgen een nieuwe steriele dia-mailer en ongeveer 18 mL Prehybe Buffer in de dia-mailer. Plaats de dia mailer in de oven van de kruising bij kruising temperatuur.
Opmerking: De temperatuur van de kruising zal afhangen van de sonde wordt gebruikt maar meestal varieert van 50-60 ° C. - Zodra de 2 x SSC-wash wordt voltooid, het uitgieten van de 2 x SSC, en plaats de dia's binnen de dia mailer in de Buffer van de Prehybe in de kruising oven gedurende 1 uur.
4. de kruising van de RNA-sonde
- Terwijl de dia's worden aan het broeden met de Buffer van de Prehybe in de oven hybridisatie, bereiden hybridisatie-sonde oplossing.
- Verdun elk sonde in kruising buffer (0,5 µL van sonde met 24,5 µL van hybridisatie buffer).
Opmerking: Het recept voor hybridisatie buffer is gevonden in tabel 1. Een voorbeeld van sonde voorbereiding en concentraties kan worden gevonden in Traylor-Knowles et al. 11. - Plaats de verdunde sonde op een 86-90 ° C warmte blok voor 12 min en vervolgens afkoelen voor 1 min op ijs.
- Verdun elk sonde in kruising buffer (0,5 µL van sonde met 24,5 µL van hybridisatie buffer).
- Verwijder de mailer dia uit de kruising oven en dia's afzonderlijk te verwijderen uit de dia mailer steriel pincet gebruiken. De dia's leggen plat op een papieren handdoek, en zorgvuldig veeg overtollige Prehybe Buffer rond de weefselmonsters. Wees voorzichtig niet te raken van de monsters, en werken snel om te voorkomen dat het drogen van de weefselmonsters.
- Omcirkelen het weefsel met een pen van PAP. Breng 25 µL van verdunde sonde oplossing met een pipet en dekking van het monster met een kunststof dekglaasje aan.
- Leg de monsters in de dia vocht zaal met 4 x SSC + 50% formamide-oplossing in de bodem van de kamer.
- Zodra sondes zijn toegevoegd aan alle dia's, plaatst u de dia vocht zaal in de kruising oven gedurende ten minste 24 uur bij een temperatuur van de kruising van 50-60 ° C. De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de concentratie van de sonde, maar moet gedurende ten minste 24 uur.
- Na overnachting incubatie met de verdunde sondes, de dia vocht zaal van de kruising oven te verwijderen.
- Coverslips uit elk van de dia's, voorzichtig om niet te verplaatsen van het weefsel te verwijderen. Voeg 1000 µL van 2 x SSC-oplossing in een 1000 µL Pipet, en zachtjes de dia afwassen.
- Plaats de dia in een steriele dia mailer met 18 mL 2 x SSC oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en vervangen met 18 mL vers 2 x SSC. Herhaal de incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Giet de 2 x SSC-oplossing. Voeg 18 mL 1 x SSC oplossing en wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet de 1 x SSC-oplossing en vervangen met 18 mL vers 1 x SSC. Herhaal de incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Giet de 1 x SSC. Voeg 18 mL 0,5 x SSC en wassen gedurende 10 minuten bij 42 ° C zonder schudden. Giet de 0,5 x SSC en vervangen met 18 mL verse 0,5 x SSC. Weer wassen gedurende 10 minuten bij 42 ° C zonder schudden.
5. visualisatie van de RNA-sonde
Opmerking: Voor het visualiseren van de sonde, BM paars zal worden gebruikt tijdens het ontwikkelingsproces. Voor deze stap zijn echter meerdere wasbeurten nodig ter voorbereiding van de monsters van de kleuring.
- De dia's met 18 mL alkalische fosfatase buffer (AP-buffer) wassen zonder MgCl2 voor 1 min. de AP-Buffer zonder MgCl2uitstorten, en voeg 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer verdund met maleïnezuur buffer. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur in een dia mailer met zacht schudden.
Opmerking: De Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer en maleïnezuur buffer gebruikt waren premade en gekocht in de DIG Wash en blok Buffer ingesteld (beschikbaar commercieel).- Als alternatief, incubatie 's nachts bij 4 ° C kan worden uitgevoerd. Een langer blokkeringstermijn zal het verminderen van de verschijning van niet-specifieke binding.
- Voorbereiden van de 20 mL van de verdunde DIG anti-heksenkruid-AP Fab-fragmenten (anti-DIG antilichaam = 2 µL van anti-DIG antilichaam + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer). Dit is genoeg voor gebruik in 1 kunststof dia mailer. Meer van deze oplossing moet worden bereid als meer dan één dia mailer wordt gebruikt.
- Het anti-DIG antilichaam toevoegen aan een nieuwe steriele dia-mailer en overbrengen van de dia's naar de dia mailer met de anti-DIG antilichaam-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur met zacht schudden.
- Na incubatie, uitstorten van het anti-DIG antilichaam en wassen van de dia's in de dia-mailer met 18 mL AP-Buffer zonder MgCl2 voor 5 min met zacht schudden.
- De AP-Buffer zonder MgCl2, uitstorten, en voeg 18 mL AP-Buffer. Wassen voor 5 min met zacht schudden. Na de incubatie van 5 min, giet af de AP-Buffer, 18 mL verse AP-Buffer te vervangen en wassen voor 5 min met zacht schudden.
- In het donker, uitstorten van de AP-Buffer en 18 mL BM paarse toevoegen aan de dia-mailer. Incubeer de dia's bij kamertemperatuur in het donker, controleren op paarse kleur ontwikkeling die elke ½ h. reactietijden voor visualisatie zal variëren op basis van de sonde die wordt ontwikkeld.
Opmerking: In plaats van BM paarse visualization, oplossing van de gegevensbestandontwikkeling kan worden gemaakt met behulp van 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BVIE) en nitro blauwe tetrazolium (NBT). Zie tabel 1 voor instructies. - Stop kleur ontwikkeling door de dia's naar een nieuwe steriele dia mailer met 18 mL Tris-EDTA (TE) buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
- Giet af de buffer TE en 18 mL RNase-gratis water toevoegen aan de dia mailer en wassen voor 1 min, in het donker.
- De dia's te verwijderen uit het water en droog ze rond de randen van het weefsel. Voegen glycerol montage van drager en de coverslips te plaatsen. De dia's bij 4 ° C worden opgeslagen totdat de foto's zijn klaar om te worden genomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het voltooien van dit protocol, zal identificatie van cellen en weefsels die zijn uiting van de RNA-sonde van belang worden bereikt. De representatieve resultaten voor dit protocol zijn voor AP-1, FosB en TNFR41. Deze resultaten, eerder gepubliceerd door Traylor-Knowles et al. 11, Toon ruimtelijke uitdrukking van RNA sondes op volwassen koralen die werden blootgesteld aan hittestress. Twee voorbeelden van verschillende typen van de kleuring worden gepresenteerd in Figuur 1. Figuur 1A is een voorbeeld van diffuse weefsel kleuring. De vlek soort komt verspreid over het weefsel, niet alleen in specifieke cellen. Hier, is de uitdrukking van anti-zin AP-1 verspreid de epidermis en de mondelinge gastrodermis11 (figuur 1A). De kleuring is diffuus en niet gescheiden naar één bepaalde celtype. Voor dit soort vlekken is het met name cruciaal voor een zin-besturingselement uit te voeren op hetzelfde moment, zoals enkele van de resultaten veroorzaakt door niet-specifieke kleuring worden kan.
Het tweede type van kleuring is cel-specifieke, waarin de vlek alleen te in bepaalde celtypen vinden is. Zowel FosB (figuur 1B) en TNFR41 (Figuur 1 c) tonen van dit soort vlekken. Beide van deze sondes werden gebruikt op weefselmonsters van volwassen koralen die waren blootgesteld aan een hitte-stress11. In het deelvenster anti-zin wordt purple kleuring waargenomen. TNFR41 kwam tot uitdrukking in verschillende soorten Cnidocyten, een familie van celtypes, die alleen te binnen de neteldieren (Figuur 1 vinden is). In het bijzonder het gekleurd nematocytes die het organel mastigophore microbasic (nematocysts produceren) en spirocytes die spirocysts, alle gevonden binnen de epidermis van koraal weefsel te produceren. Nematocytes zijn ook gevonden in andere lagen weefsel van het koraal, zoals de calicodermis; Als gevolg van de afdelen uitgevoerd op dit specifieke voorbeeld, kan deze informatie echter niet worden verzameld. FosB ook gekleurd Cnidocyten en was specifiek voor zowel spirocytes als nematocytes. Voor beide van deze sondes toonde het gevoel controle geen vlekken, die aangeeft dat de kleuring voor de anti-zin-sonde inderdaad specifiek was. Dit zijn slechts twee soorten van representatieve resultaten (diffuus weefsel kleuring en cel-specifieke kleuring) van de kleuring technieken die mogelijk aanwezig zijn met verschillende soorten sondes. Als gevolg van deze variabiliteit is het van cruciaal belang een zin-besturingselement gebruiken om niet-specifieke kleuring.
Figuur 1: representatief resultaat van ISH dat bepaalde cellen gekleurd. (A) in het eerste deelvenster blijkt gevoel controle voor de AP-1 sonde dat weinig vlekken op de dia aanwezig. In het tweede deelvenster blijkt de anti-zin sonde voor AP-1 dat kleuring met deze sonde diffuus in het weefsel. De vlek is specifiek voor de mondelinge gastrodermis en de opperhuid. Met dit soort vlekken is het cruciaal voor een besturingselement zin om ervoor te zorgen dat de waargenomen kleuring specifiek is uit te voeren. (B) een controle van de zin voor de FosB sonde in het eerste deelvenster toont weinig vlekken aanwezig. In het tweede deelvenster, de anti-zin-sonde voor FosB shows kleuring specifiek voor de spirocytes en de nematocytes, met diffuse vlekken in de opperhuid en mondelinge gastrodermis. (C) in het eerste deelvenster blijkt het besturingselement van de zin voor de TNFR 41 sonde dat weinig vlekken op de dia aanwezig. In het tweede deelvenster toont de sonde van de anti-gevoel voor TNFR 41 specifieke kleuring binnen de spirocytes, nematocytes en microblastic mastigophores. Afkortingen: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), symbiont-bevattende gastrodermal cel (SU). Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Opmerking: Alle verdunnen moeten met steriel, RNase gratis water in gesteriliseerde met autoclaaf glaswerk gebeuren. | |||
| Prehybe Buffer (50 mL) | TOEVOEGEN | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparine | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL zalm sperma DNA (denatureren alvorens toe te voegen) | 2 mL | ||
| RNase gratis water | 4.4 mL | ||
| Opmerking: Oplossing kan worden gemaakt in een tube disposible 50 mL. Zalm sperma moet worden gedenatureerd door te koken op een warmte-blok 5 minuten voordat u aan een oplossing toevoegt. | |||
| Hybridisatie Buffer (47 mL) | TOEVOEGEN | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparine | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL zalm sperma DNA (denatureren alvorens toe te voegen) | 2 mL | ||
| RNase gratis water | 1 mL | ||
| Opmerking: Oplossing kan worden gemaakt in een tube disposible 50 mL. Zalm sperma moet worden gedenatureerd door te koken op een warmte-blok 5 minuten voordat u aan een oplossing toevoegt. | |||
| 10 X PBS (1,0 L) | TOEVOEGEN | ||
| 18,6 mM NaH2PO4 | 2.56 g | ||
| 84,1 mM nb2HPO4 | 11.94 g | ||
| 1.750 mM NaCl | 102.2 g | ||
| Notities: Meng fosfaten in ongeveer 800 mL water voor een volume van 1,0 L. Controleer de pH. 7.4 ± 0.4 zou moeten zijn. Anders Breng pH op 7.4 met NaOH HCl. toevoegen NaCl en rest van water. Nadat de pH aangepast autoclaaf is. | |||
| 20 X SSC (1,0 L) | TOEVOEGEN | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0,3 M nb citraat | 88,2 g | ||
| Notities: Meng ongeveer 800 mL RNase gratis water om een volume van 1,0 L. Breng de pH op 4.5 en autoclaaf. | |||
| Alkalische fosfatase (AP) buffer w/o MgCl2 (50 mL) | TOEVOEGEN | ||
| 1 M NaCl | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5,0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1,25 mL | ||
| RNase gratis water | 38.75 mL | ||
| Notities: Bereiden net vóór gebruik in een tube van 50 mL. | |||
| Alkalische fosfatase (AP) buffer (100 mL) | TOEVOEGEN | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 mL | ||
| RNase gratis water | 72,5 mL | ||
| Notities: bereiden van net vóór gebruik in een tube van 50 mL. De oplossing zal worden bewolkt na een paar uur en zal niet langer werkzaamheden voor de enzymatische reactie. | |||
| AP substraat oplossing | TOEVOEGEN | ||
| AP Buffer | 25 mL | ||
| NBT | 82,5 uL | ||
| BVIE | 82,5 uL | ||
| Toelichting: dit kan worden gebruikt in plaats van BM paars. Bereiden net vóór gebruik in een tube van 50 mL. Bewaar deze oplossing in het donker door die buis in folie en voorbereiding bij weinig licht. | |||
| Proteïnase K-stockoplossing (10 mg/mL) | TOEVOEGEN | ||
| Proteïnase K | 10 mg | ||
| RNase gratis water | 10 mL | ||
| Notities: Aliquot en winkel bij-20 ° C. | |||
| Proteïnase K-werkoplossing | TOEVOEGEN | ||
| Proteïnase K-stockoplossing | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Notities: Maak gewoon voorafgaand aan gebruik voor de beste resultaten. | |||
| 0,2% glycine-PBS oplossing | TOEVOEGEN | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase gratis Water | 405 mL | ||
| Glycine | 1 g | ||
| Notities: bereiden in gesteriliseerde met autoclaaf glas container. Meng bij kamertemperatuur op een plaat van stirer tot glycine is volledig opgelost. | |||
| Boehringer-Mannheim blokkeren Buffer (30 mL) (deel van de DIG-Wash en blok Buffer) | TOEVOEGEN | ||
| 10 x het blokkeren van de oplossing | 3 mL | ||
| 1 x maleïnezuur buffer | 27 mL | ||
| Notities: maken enkel voorafgaand aan gebruik voor de beste resultaten. Stockoplossing blokkeren en maleïnezuur buffer werden gebruikt van de "DIG Wash en blok-Buffer Set". | |||
| 4 X SSC — 50% formamide (30 mL) | TOEVOEGEN | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50% formamide | 24 mL | ||
| Notities: Net vóór gebruik in tube 50 mL voor te bereiden. Bereiden onder laboratorium motorkap. | |||
| Glycerol montage Media | TOEVOEGEN | ||
| 50 mM Tris, pH 8.4 | 80 ΜL | ||
| Glycerol | 20 ΜL | ||
Tabel 1: Stock oplossingen voor het uitvoeren van in situ hybridisatie. De tabel bevat een lijst van de verschillende voorraadoplossingen nodig voor dit protocol. Totale bedragen worden geschat voor prestaties van ongeveer 2 dia mailers. Het wordt geadviseerd om de totale bedragen die zijn gebaseerd op het aantal dia's dat wordt verwerkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit protocol beschreven methode is gewijzigd van eerdere werkzaamheden in medisch en evolutionaire developmental onderzoek8,9,10,12,17. Dit protocol is gericht op de nuances van een in situ -hybridisatie met een DIG-geëtiketteerden RNA anti-zin-sonde op volwassen koralen, die zijn bewaard en ingebed in paraffine. Deze methode kan gemakkelijk worden overgedragen aan monsters van organismen dan koralen die ook paraffine-ingebedde zijn. Tot slot, deze methode kan worden uitgevoerd tijdens de verschillende levensfasen van koralen (b.v., larve) of binnen celculturen, maar het exacte protocol kan verschillen omdat deze soorten monsters niet altijd paraffine-ingebedde5,6 zijn .
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol, met inbegrip van het proteïnase K-behandeling, kruising van de sonde, en ontwikkeling van de kleur van de sonde. Tijdens de behandeling van het proteïnase K is timing heel belangrijk. Als de behandeling langer dan voorgesteld is, kunnen weefsels worden aangetast en beschadigd. Daarnaast moet het stoppen van het proteïnase K-reactie op het punt van de full-time opgegeven worden uitgevoerd. Het is ook cruciaal om te houden van het monster bij een constante hybridisatie temperatuur, als het verlagen van de temperatuur kan leiden tot niet-specifieke binding van de sonde en compliceren resultaten. Bij het wassen van de sonde, is het belangrijk om elke dia uit de kruising oven een op een tijd, in plaats van allemaal tegelijk, om ervoor te zorgen dat de dia's doen niet te vermengen met de sonde bij een lage temperatuur. Grondig wassen van de dia's na de kruising van de sonde zal ook helpen voorkomen dat niet-specifieke binding. Tot slot, kleur ontwikkeling van de sonde is één van de meest kritische nog subjectieve stappen van dit proces. De ontwikkeling van de kleur kan eenvoudig worden overdreven of te vroeg gestopt. Deze stap vereist geduld en waakzaamheid om ervoor te zorgen dat overdreven kleuring van de dia's niet beschadigd.
Oplossen van problemen met dit protocol kan een ontmoedigend proces als gevolg van het aantal stappen betrokken worden. Als het protocol negatieve resultaten oplevert, dan is het het beste om te beginnen met de behandeling van de sonde om ervoor te zorgen dat er de anti-gevoel (en niet het gevoel) sonde. Bovendien, als de oplossingen oude zijn, loont remaking of het vervangen van hen zodat ze vers bij de uitvoering van dit protocol. Wijzigingen, zoals de lengtes van hybridisatie en blokkeren, kunnen worden uitgevoerd om de kansen van de kruising van de sonde of vermindering van de hoeveelheid achtergrond en niet-specifieke kleuring te vergroten. Vanwege het hoge aantal stappen in dit protocol, kan het gemakkelijk zijn om verliezen; Daarom is het belangrijk om te verblijven georganiseerd en bijhouden welke onderdelen van het protocol is voldaan. Bovendien is het essentieel om ervoor te zorgen dat geen stappen worden overgeslagen, en die tijd niet tijdens de incubations en wast bezuinigen is. Een goede vuistregel is om voor langer dan kortere wast om ervoor te zorgen dat alle dia's grondig worden schoongemaakt.
De grootste beperking van deze methode is dat de resultaten niet kwantificeerbaar zijn. Dit is een kwalitatieve methode die, in overleg met andere methoden zoals histologie, transcriptomics en proteomics, zeer informatief is. Als gevolg van schommelingen van de kruising tijden evenals de subjectieve tijden tijdens de visualisatie, het kwantificeren van de intensiteit van de kleuring niet gemakkelijk worden verricht. Het is verleidelijk om te zeggen dat een sonde meer hoogst wordt uitgedrukt als het toont grotere intensiteit, maar wegens de verschillen in dit protocol bevat (zoals de hoeveelheid tijd toegestaan voor de ontwikkeling van de kleur), gen expressie bedragen kunnen niet worden bepaald.
Deze techniek is niet een nieuwe methode in de biologie; het is echter een niet heel vaak op volwassen koralen uitgevoerd. Het gebruik van deze methode op volwassen koralen is zeer krachtig omdat het verankert gen expressie gegevens aan een weefsel of een cel typ11. Transcriptomics en genomics geworden populaire en krachtige tools in koraal biologie; deze methoden zijn echter over het algemeen gedaan op homogenates van het hele dier. Dit maakt het uitdagend om te identificeren welke delen van het koraal zijn het uitdrukken van de genen van belang, en dus moeilijker te begrijpen de werkelijke mechanismen. Door het gebruik van ISH samen met gen expressie gegevens, kan een meer holistische benadering waar en in welke mate de genen worden uitgedrukt worden bereikt. Dit zal enorm helpen in het begrip van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor verschillende stress reactie trajecten in volwassen koralen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door award geen. OCE-1323652 door de National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship en award no.1012629 vanuit de Burroughs Wellcome Fonds postdoctorale verrijking programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
