Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.
Abstract
Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.
Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.
Introduction
Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir in Situ Hybridisierung (ISH), häufig verwendete Protokoll in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie, für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Gewebeproben von Erwachsenen Korallen angepasst. Diese Technik ist mächtigsten auf Erwachsenen Korallen verwendet, die ein belastendes Ereignis wie Hitzestress unterzogen wurden. Doch diese Technik kann auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensphasen in Korallen verwendet werden und beschränkt sich nicht nur Wärme betonte Korallen4,6,7. Darüber hinaus kann diese Technik auf Gewebe oder Zellen von jeder riffbildende verwendet werden, solange gibt es cDNA-Sequenzinformationen.
Der Zweck dieser Methode ist, RNA-Sonden in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die bewahrt und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Diagnosetool, das für die Visualisierung von Nukleinsäuren in Erwachsenen korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt, und es ist seitdem ein beliebtes Hilfsmittel in Bereichen wie Entwicklungsbiologie und evolutionären Entwicklungsbiologie8,9,10. ISH ist auch eine kritische Methode, vor allem in nicht-Modellsysteme, wenn genomische und transkriptomischen Sequenzdaten sind verfügbar, aber räumliche gen Expressionsmuster sind unbekannt. Für die diagnostische Arbeit in nicht-Modellsystemen ist diese Technik mächtig, weil sie angeben kann, welche Zellen und Geweben ein Gen des Interesses Express und zu mehr zielgerichtete Therapieansätze8,9,10führen, 11,12. Zu guter Letzt ist diese Technik qualitativer und leistungsfähiger, wenn gepaart mit quantitativen Gen Ausdruck Daten11.
In diesem Papier skizzierte Ansatz werden von Interesse für Forscher, die bereits eine Digoxigenin (DIG) entworfen haben-mit der Bezeichnung RNA-Sonde (Sinn und Antisense-Sonden) und sind nun bereit, in Situ Hybridisierung der Sonden zu einer Probe durchführen. Um diese Methode durchzuführen, benötigt zwei Schnittserien eines Gewebes, Paraffin Korallen für jede Sonde getestet. Ein Teil wird für die Sinne-Sonde und die andere für die antisense-Sonde verwendet werden. Die Sinn-Sonde wird ein Steuerelement an unspezifischen Bindung sein. Wenn Färbung in der Sinn-Sonde beobachtet wird, ist die antisense-Sonde nicht spezifisch für die RNA von Interesse. Sonden können für jedes Gen ausgedrückt ausgelegt werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die bisher gefunden wurden, während Hitzestress in Korallen ausgedrückt werden: FBJ murinen Osteosarkom viral Oncogene Homolog B (Fos-B), Activator Protein (AP1) und Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 41 (TNFR 41)11. ISH mit DIG-Label RNA-Sonden wird vorgezogen mit radioaktiven Sonden, weil deren Handhabung viel sicherer10ist. Darüber hinaus ist diese Technik ist sehr empfindlich und kann auf eine Vielzahl von Geweben und Embryonen über Wärme-gestressten Erwachsenen Korallen13,14,15,16durchgeführt werden.
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Protocol
1. Entfernung des Paraffins
Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem Abzug.
- Wachsentfernung dünn geschnittene Paraffin-eingebetteten Folien mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin Gläser für 10 Minuten. Verwenden Sie keine Coplin Plastikdosen, wie Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin Gläser im Autoklav vor Gebrauch.
- Bereiten Sie vier sterile Coplin Gläsern mit den folgenden: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, Ethanol 70 % und 60 % Ethanol. Das Ethanol mit RNase-freies Wasser zu verdünnen.
- Die Folien zu den sterilen Coplin Behälter mit 100 % Ethanol zu übertragen und für 10 Minuten einweichen. Leeren Sie nach 10 min Coplin Glas zu, und ersetzen Sie durch neue 100 % Ethanol. Die Folien wieder für 10 Minuten einweichen.
- Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 80 % igem Ethanol für 1 min.
- Übertragen Sie die Folien auf die sterile Coplin Glas mit 70 % igem Ethanol für 1 min.
- Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 60 % Ethanol für 1 min.
2. Vorbehandlung von Folien für die Vorbereitung der RNA-Sonde Hybridisierung
- Führen Sie die folgenden Waschungen bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie Raumtemperatur Waschungen auf einem Orbitalschüttler mit langsamer Geschwindigkeit. Verwenden Sie sterile Folie Versandtaschen mit Platz für bis zu fünf Folien für das Waschen der Folien.
- Die Folien auf einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) übertragen. Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur.
- Gießen Sie 1 X PBS, und sofort behandeln Sie das Gewebe auf den Folien mit Proteinase K Sonde Durchdringung des Gewebes ermöglichen. Die Folie Mailer ca. 18 mL Proteinase K-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle 1 für die Lösungskonzentration Arbeit). Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. Nicht schütteln.
- Während die Folien Inkubation sind, bereiten Sie prehybridization Puffer (Prehybe Puffer). Legen Sie den Prehybe-Puffer in einem kochenden Wasserbad für 10 min, dann auf einem Eisbad für 5 min abkühlen lassen. Nach einem Rezept von Prehybe Puffer siehe Tabelle 1.
- Stoppen Sie Verdauung der Proteinase K Reaktion durch Ausgießen der Proteinase K-Lösung zu, und sofort 18 mL 0,2 % Glycin-PBS-Lösung für Folie Mailer. Lassen Sie die Folie-Mailer für 5 min bei Raumtemperatur sitzen.
- Gießen Sie die 0,2 % Glycin-PBS-Lösung und jede Folie Mailer fügen Sie 18 mL 2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Lösung hinzu. Waschen Sie die Folien in den 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur, mit 100-150 u/min schütteln.
3. Prehybridization von Folien in Vorbereitung für die RNA-Sonde Hybridisierung
- Während die Folien mit 2 gewaschen werden X SSC, erhalten einen neue sterile Folie Mailer und ca. 18 mL Prehybe Puffer in Folie Mailer. Legen Sie die Folie Mailer in Hybridisierung Backofen bei Hybridisierung Temperatur.
Hinweis: Die Hybridisierung Temperatur hängt von der Sonde verwendet wird, aber in der Regel reicht von 50-60 ° C. - Nach Abschluss der 2 X SSC Wäsche 2 x SSC und Ort Ausgießen der Folien in der Dia-Mailer in der Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen für 1 h.
(4) Hybridisierung der RNA-Sonde
- Während die Folien mit dem Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen Inkubation sind, bereiten Sie Hybridisierung-Sonde Lösung.
- Jede Sonde in Hybridisierung Puffer (0,5 µL der Sonde mit 24,5 µL Hybridisierung Puffer) verdünnen.
Hinweis: Das Rezept für Hybridisierung Puffer findet sich in Tabelle 1. Ein Beispiel der Sonde Vorbereitung und Konzentrationen finden im Traylor-Knowles Et al. 11. - Legen Sie die verdünnte Probe auf einem Heizblock 86-90 ° C für 12 min, dann für 1 min auf Eis abkühlen.
- Jede Sonde in Hybridisierung Puffer (0,5 µL der Sonde mit 24,5 µL Hybridisierung Puffer) verdünnen.
- Entfernen Sie den Folie Mailer aus dem Ofen Hybridisierung und entfernen Sie Folien einzeln von der Folie-Mailer mit einer sterilen Pinzette. Legen Sie die Folien flach auf ein Papiertuch und wischen Sie vorsichtig überschüssiges Prehybe Puffer um Gewebeproben. Achten Sie darauf, nicht zu die Proben zu berühren und arbeiten schnell, um zu verhindern, Trocknung von Gewebeproben.
- Umschließen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Gelten Sie 25 µL der verdünnten Probe Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Probe mit einem Kunststoff deckgläschen.
- Legen Sie die Proben in der Folie Feuchtigkeit Kammer mit 4 x SSC + 50 % Formamid-Lösung in den Boden der Kammer.
- Sobald Sonden auf alle Folien hinzugefügt wurden, legen Sie die Folie Feuchtigkeit Kammer in der Hybridisierung Ofen für mindestens 24 Stunden bei einer Hybridisierung-Temperatur von 50-60 ° C. Die Inkubationszeit sollte variiert abhängig von der Konzentration der Sonde jedoch mindestens 24 Stunden lang.
- Nehmen Sie nach der Übernachtung Inkubation mit der verwässerte Sonden die Folie Feuchtigkeit Kammer aus der Hybridisierung Ofen.
- Entfernen Sie Deckgläsern aus einzelnen Dias, ohne dabei das Gewebe verdrängen. In einer 1000 µL Pipette 1000 µL 2 X SSC-Lösung hinzufügen und die Folie vorsichtig abwaschen.
- Legen Sie die Folie in einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 2 X SSC-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 2 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.
- Gießen Sie die 2 X SSC-Lösung. 18 mL 1 X SSC Lösung und Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur hinzugeben. Gießen Sie 1 X SSC Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 1 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.
- Gießen Sie die 1 X SSC. 18 mL 0,5 x SSC und Wäsche für 10 min bei 42 ° C ohne schütteln hinzugeben. Gießen Sie die 0,5 x SSC und ersetzen es mit 18 mL frische 0,5 X SSC. Ohne schütteln wieder für 10 min bei 42 ° C waschen.
(5) Visualisierung der RNA-Sonde
Hinweis: Für die Visualisierung der Sonde, BM lila während des Entwicklungsprozesses verwendet werden. Allerdings müssen mehrere Wäschen vor diesem Schritt Vorbereitung der Proben für das Beflecken.
- Waschen Sie die Folien mit 18 mL Puffer alkalische Phosphatase (AP-Puffer), ohne MgCl2 für 1 min. Ausgießen der AP-Puffer ohne MgCl2, und 18 mL 1 X Boehringer Mannheim blockierende Puffer mit Maleic Säure-Puffer verdünnt. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Dia-Mailer mit sanft schütteln inkubieren.
Hinweis: Der Boehringer Mannheim blockierende Puffer Maleic Acid Puffer verwendet vorgefertigte und in dem Graben waschen und Block Puffer Set gekauft (erhältlich im Handel).- Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Mehr Sperrfrist verringert das Auftreten von unspezifischen Bindung.
- Bereiten Sie die 20 mL verdünnten DIG Anti-Digoxigenin-AP-Fab-Fragmente (Anti-DIG-Antikörper = 2 µL Anti-DIG-Antikörper + 20 mL 1 x Boehringer Mannheim blockierende Puffer). Das ist genug für den Einsatz in 1 Kunststoff-Folie-Mailer. Mehr von dieser Lösung müssen bereit sein, wenn mehr als eine Folie Mailer verwendet werden soll.
- Eine neue sterile Folie Mailer der Anti-DIG-Antikörper hinzu, und übertragen Sie die Folien auf die Folie-Mailer mit der Anti-DIG Antikörperlösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h mit sanft schütteln.
- Nach der Inkubation Ausgießen des Anti-DIG-Antikörpers und waschen Sie die Folien in der Dia-Mailer mit 18 mL AP-Puffer ohne MgCl2 für 5 min mit sanft schütteln.
- Der AP-Puffer ohne MgCl2, Gießen Sie aus und 18 mL AP-Puffer. Wäsche für 5 min mit sanft schütteln. Gießen Sie nach 5 min Inkubation den AP-Puffer, ersetzen Sie es mit 18 mL frisch AP-Puffer und waschen für 5 min mit sanft schütteln.
- Gießen Sie in der Dunkelheit die AP-Puffer und 18 mL BM lila an der Folie-Mailer. Die Folien bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, Überprüfung auf lila Farbe Entwicklung jedes ½ h. Reaktionszeiten für die Visualisierung variieren basierend auf der Sonde, die entwickelt wird.
Hinweis: Anstelle von BM lila Visualisierung Entwicklungslösung erfolgen mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) und Nitro blau tetrazoliumsalz (NBT). Siehe Tabelle 1 für Anweisungen. - Vorbeischauen Sie Farbentwicklung, die Dias auf eine neue sterile Folie Mailer mit 18 mL Tris-EDTA (TE)-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zu übertragen.
- Gießen Sie die TE-Puffer und 18 mL RNase-freies Wasser auf die Folie Mailer und Wäsche für 1 min, im Dunkeln.
- Entfernen Sie die Folien aus dem Wasser, und trocknen Sie sie an den Rändern des Gewebes. Fügen Sie Glycerin Montage Medium hinzu und platzieren Sie die Deckgläsern. Speichern Sie die Folien bei 4 ° C bis Bilder aufgenommen werden können.
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Representative Results
Nach Abschluss dieses Protokolls, erfolgt die Identifikation von Zellen und Geweben, die die RNA-Sonde von Interesse zum Ausdruck bringen. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, zuvor von Traylor-Knowles Et Al. veröffentlicht 11, Sonden zeigen räumliche Ausdruck der RNA auf Erwachsenen Korallen, die Hitze-Stress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele verschiedener Färbung sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 1A ist ein Beispiel der diffusen Gewebe Färbung. Der Fleck wird durch das Gewebe, nicht nur in bestimmten Zellen gefunden. Hier ist der Ausdruck der Gegenstrang AP-1 in der Epidermis und der mündlichen Gastrodermis11 (Abb. 1A). Die Färbung ist diffus und nicht auf eine bestimmte Zelle getrennt. Für diese Art der Färbung ist es besonders kritisch, eine Sinn-Steuerelement zur gleichen Zeit auszuführen, wie einige der Ergebnisse möglicherweise aufgrund unspezifischer Färbung.
Die zweite Art der Färbung ist zellspezifische, in denen der Fleck nur in bestimmten Zelltypen gefunden wird. FosB (Abbildung 1 b) und TNFR41 (Abbildung 1) diese Art der Färbung zeigen. Beide diese Sonden waren an Gewebeproben von Erwachsenen Korallen verwendet, die eine Hitze-Stress-11ausgesetzt waren. Im Bereich Anti-Sense ist eine lila Färbung beobachtet. TNFR41 drückte sich in verschiedenen Arten von Cnidocytes, einer Familie von Zelltypen, die nur innerhalb von Nesseltieren (Abbildung 1) gefunden wird. Insbesondere Flecken es Nematocytes, die die Microbasic Mastigophore Organellen (an) zu produzieren und Spirocytes, die Spirocysts, alle gefundenen innerhalb der Epidermis des korallengewebes produzieren. Nematocytes finden sich auch in anderen Gewebeschichten der Korallen, wie z. B. die Calicodermis; durch den Schnitt auf diesem speziellen Beispiel durchgeführt, könnten diese Informationen nicht gesammelt werden. FosB auch Cnidocytes gebeizt und wurde speziell für Spirocytes und Nematocytes. Für beide diese Sonden zeigte das Sinn-Steuerelement keine Färbung, darauf hinweist, dass die Färbung für die Anti-Sense-Sonde in der Tat bestimmte war. Dies sind nur zwei Arten von repräsentativen Ergebnissen (diffuse Gewebe Färbung und zellspezifische Färbung) der befleckenden Techniken, die mit verschiedenen Arten von Sonden vorhanden sein können. Aufgrund dieser Variabilität ist es wichtig, eine Sinn-Steuerelement verwenden, um unspezifische Färbung bestimmen.
Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse der ISH, die bestimmte Zellen befleckt. (A) im ersten Bereich zeigt Sinn-Steuerung für die AP-1-Sonde, dass kleine Flecken auf der Folie vorliegt. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für AP-1, dass Färbung mit dieser Sonde diffus durch das Gewebe. Der Fleck ist spezifisch für die mündliche Gastrodermis und Epidermis. Mit dieser Art der Färbung ist es wichtig, laufen ein Sinn-Steuerelement, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beflecken spezifisch ist. (B) ein Sinn-Steuerelement für die FosB-Sonde im ersten Fenster zeigt wenig Färbung vorhanden. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für FosB Färbung speziell für die Spirocytes und Nematocytes, mit diffusen Färbung in der Epidermis und Oral Gastrodermis. (C) in der ersten Platte zeigt die Sinn-Steuerung für die TNFR 41-Sonde, dass kleine Flecken auf der Folie vorhanden ist. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für TNFR 41 spezifische Färbung innerhalb der Spirocytes, Nematocytes und Microblastic Mastigophores. Abkürzungen: Spirocytes (SP), Symbiodium (SY), Nematocyte (NE), Microbasic Mastigophores (MM), Symbiont-haltigen Gastrodermal Zellen (SU). Diese Zahl wurde mit Erlaubnis11wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Hinweis: Alle Verdünnungen sollten mit sterilen, RNase freies Wasser im Autoklaven Glaswaren erfolgen. | |||
| Prehybe Puffer (50 mL) | HINZUFÜGEN | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20 % SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL Lachs Samenzellen DNA (denaturieren bevor Sie hinzufügen) | 2 mL | ||
| RNase freies Wasser | 4,4 mL | ||
| Hinweis: Lösung kann in einem Wegwerfkameras 50 mL Röhrchen erfolgen. Lachs Sperma sollte durch Kochen auf einem Heizblock für 5 Minuten vor dem Hinzufügen zur Lösung denaturiert werden. | |||
| Hybridisierung Puffer (47 mL) | HINZUFÜGEN | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20 % SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL Lachs Samenzellen DNA (denaturieren bevor Sie hinzufügen) | 2 mL | ||
| RNase freies Wasser | 1 mL | ||
| Hinweis: Lösung kann in einem Wegwerfkameras 50 mL Röhrchen erfolgen. Lachs Sperma sollte durch Kochen auf einem Heizblock für 5 Minuten vor dem Hinzufügen zur Lösung denaturiert werden. | |||
| 10 X PBS (1,0 L) | HINZUFÜGEN | ||
| 18,6 mM NaH2PO4 | 2,56 g | ||
| 84,1 mM Na2HPO4 | 11,94 g | ||
| 1.750 mM NaCl | 102,2 g | ||
| Noten: Mischen Sie Phosphate in ca. 800 mL Wasser ein Volumen von 1,0 L. Überprüfen Sie pH. Sollte es 7,4 ± 0,4. Ansonsten stellen Sie pH auf 7,4 mit NaOH HCl. hinzufügen NaCl und Rest Wasser. Nach pH-Wert angepasste Autoklav ist. | |||
| 20 X SSC (1,0 L) | HINZUFÜGEN | ||
| 3 M NaCl | 175,3 g | ||
| 0,3 M Na-Citrat | 88,2 g | ||
| Noten: Mischen Sie in etwa 800 mL RNase freies Wasser 1,0 L Volumen bringen. Stellen Sie pH 4.5 und Autoklaven. | |||
| Alkalische Phosphatase (AP) Puffer w/o MgCl2 (50 mL) | HINZUFÜGEN | ||
| 1 M NaCl | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5,0 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 1,25 mL | ||
| RNase freies Wasser | 38,75 mL | ||
| Noten: Bereiten Sie einfach vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube. | |||
| Alkalische Phosphatase (AP) Puffer (100 mL) | HINZUFÜGEN | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 2,5 mL | ||
| RNase freies Wasser | 72,5 mL | ||
| Notizen: bereiten Sie nur vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube. Die Lösung trüb nach ein paar Stunden und wird nicht mehr Arbeit für die enzymatische Reaktion. | |||
| AP-Substratlösung | HINZUFÜGEN | ||
| AP-Puffer | 25 mL | ||
| NBT | 82,5 uL | ||
| BCIP | 82,5 uL | ||
| Anmerkungen: Dies kann verwendet werden, anstelle von BM lila. Bereiten Sie einfach vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube. Halten Sie diese Lösung in der Dunkelheit durch die Röhre in Folie und Vorbereitung bei schwachem Licht. | |||
| Proteinase K-Stammlösung (10 mg/mL) | HINZUFÜGEN | ||
| Proteinase K | 10 mg | ||
| RNase freies Wasser | 10 mL | ||
| Noten: Aliquoten und Store bei-20 ° C. | |||
| Proteinase K-Lösung arbeiten | HINZUFÜGEN | ||
| Proteinase K-Stammlösung | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Noten: Stellen Sie einfach vor dem Gebrauch die besten Ergebnisse erzielen. | |||
| 0,2 % Glycin-PBS-Lösung | HINZUFÜGEN | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase freies Wasser | 405 mL | ||
| Glycin | 1 g | ||
| Notizen: in autoklaviert Glasbehälter vorzubereiten. Mischen Sie bei Raumtemperatur auf einem Stirer Teller bis Glycin vollständig aufgelöst ist. | |||
| Boehringer Mannheim blockieren Puffer (30 mL) (Teil der DIG-Waschanlagen und Block-Puffer-Set) | HINZUFÜGEN | ||
| 10 x blockiert Lösung | 3 mL | ||
| 1 x Maleic Acid Puffer | 27 mL | ||
| Notizen: machen Sie nur vor dem Gebrauch die besten Ergebnisse erzielen. Blocking-Stammlösung und Maleic Acid Puffer dienten aus der "DIG-Waschanlagen und Block-Puffer-Set". | |||
| 4 X SSC – 50 % Formamid (30 mL) | HINZUFÜGEN | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50 % Formamid | 24 mL | ||
| Noten: Bereiten Sie einfach vor dem Gebrauch in 50 mL-Tube. Bereiten Sie unter Labor-Haube. | |||
| Glycerin-Montage-Medien | HINZUFÜGEN | ||
| 50 mM Tris, pH 8,4 | 80 ΜL | ||
| Glycerin | 20 ΜL | ||
Tabelle 1: Lager-Lösungen für die Durchführung von in situ Hybridisierung. Die Tabelle enthält eine Liste der verschiedenen Lager Lösungen für dieses Protokoll benötigt. Summe der Beträge sind für eine Leistung von ca. 2 Folie Mailer geschätzt. Es empfiehlt sich, passen Gesamtbeträge bezogen auf die Menge der Dias, die verarbeitet werden.
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Discussion
In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebettet wurden. Diese Methode kann leicht Proben von Organismen über Korallen übertragen werden, die auch Paraffin eingebettet wurden. Zu guter Letzt diese Methode kann in verschiedenen Lebensphasen von Korallen (z.B. Larve) oder in Zellkulturen durchgeführt werden, aber das genaue Protokoll kann abweichen, da diese Arten von Proben nicht immer Paraffin-eingebetteten5,6 .
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, einschließlich der Behandlung von Proteinase K, Hybridisierung der Sonde und Farbentwicklung der Sonde. Während der Behandlung Proteinase K ist das Timing sehr wichtig. Wenn die Behandlung länger als empfohlen wird, können Gewebe abgebaut und beschädigt werden. Darüber hinaus sollte das Anhalten der Proteinase K-Reaktion an der Vollzeit-Stelle angegeben durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, die Probe bei einer Konstanten Hybridisierung Temperatur zu halten als die Absenkung der Temperatur kann verursachen unspezifische Bindung der Sonde und Ergebnisse zu erschweren. Beim Ausschalten der Sonde zu waschen, ist es wichtig, jede Folie aus der Hybridisierung Ofen eine nehmen, anstatt alles auf einmal, um sicherzustellen, dass die Folien nicht mit der Sonde bei einer niedrigen Temperatur hybridisieren. Darüber hinaus hilft gründliches Waschen der Folien nach der Sonde Hybridisierung unspezifischen Bindung zu vermeiden. Zu guter Letzt ist Farbentwicklung der Sonde einer der kritischen noch subjektive Schritte dieses Prozesses. Die Farbentwicklung kann leicht übertrieben oder zu früh beendet. Dieser Schritt erfordert Geduld und Wachsamkeit, um sicherzustellen, dass über Färbung der Folien findet nicht statt.
Problembehandlung bei dieses Protokoll kann eine schwierige Prozess aufgrund der Anzahl der Schritte sein. Wenn das Protokoll führt zu negativen Ergebnissen, dann es am besten ist, um anhand der Sonde um sicherzustellen, dass es die Anti-Sense (und nicht der Sinn) ist Sonde. Zusätzlich, wenn die Lösungen alt sind, lohnt es sich neu zu gestalten oder sie zu ersetzen, so dass sie frisch sind, bei der Durchführung dieses Protokolls. Änderungen, wie die Längen der Hybridisierung und blockieren, können implementiert werden, erhöhen Sie die Chancen der Sonde Hybridisierung oder Verringerung der Mengen von Hintergrund und unspezifische Färbung. Aufgrund der hohen Anzahl der Schritte in diesem Protokoll ist es leicht den Überblick verlieren möglicherweise; Daher ist es wichtig, stets gut organisiert und nachverfolgen, welche Teile des Protokolls abgeschlossen haben. Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass keine Schritte übersprungen, und damals ist nicht während der Inkubationen und Waschungen geverringert. Eine gute Faustregel ist, um zu ermöglichen länger statt kürzer wäscht um sicherzustellen, dass alle Folien gründlich gereinigt werden.
Die größte Einschränkung dieser Methode ist, dass die Ergebnisse nicht quantifizierbar sind. Dies ist eine qualitative Methode, die im Konzert mit anderen Methoden wie Histologie, Transkriptom und Proteomics, sehr informativ ist. Aufgrund von Schwankungen Hybridisierung Zeiten sowie die subjektive Zeiten während der Visualisierung ist die Intensität der Färbung Quantifizierung nicht leicht erreicht. Es ist verlockend zu sagen, dass eine Sonde höher exprimiert wird, wenn es größeren Intensität zeigt, aber aufgrund der Schwankungen in diesem Protokoll (z. B. die Menge der Frist für die Farbentwicklung) Gen Ausdruck Beträge nicht ermittelt werden kann.
Diese Technik ist keine neue Methode in der Biologie; Allerdings ist es eine nicht sehr oft auf Erwachsenen Korallen durchgeführt. Die Verwendung dieser Methode auf Erwachsenen Korallen ist sehr mächtig, weil es Genexpressionsdaten ein Gewebe Anker oder eine Zelle geben Sie11. Transkriptom und Genomik sind beliebte und leistungsstarke Werkzeuge in Korallen Biologie geworden; Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf Homogenates des ganzen Tieres erfolgt. Dies macht es schwierig zu erkennen, welche Teile der Koralle die Gene von Interesse zum Ausdruck bringen, und somit schwieriger zu verstehen, die tatsächlichen Mechanismen. Durch den Einsatz von ISH zusammen mit Genexpressionsdaten lässt ein ganzheitlicherer Ansatz, wo und in welchem Umfang Gene exprimiert werden. Dies wird in das Verständnis der Mechanismen für verschiedene Stress Reaktion Wege in Erwachsenen Korallen sehr helfen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Award finanziert keine. OCE-1323652 durch die National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship und Award-no.1012629 von Burroughs Wellcome Fonds Postdoctoral Enrichment Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
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