Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.
Abstract
אלמוגים הם אוקיינוס חשוב חסרי חוליות קריטית לבריאות הכללית של האוקיינוס, כמו גם בריאות האדם. עם זאת, בשל בהשפעה האנושית כגון עליית הטמפרטורות התחמצות, אלמוגים הם יותר ויותר תחת איום. כדי להתמודד עם האתגרים הללו, ההתקדמות התא וביולוגיה מולקולרית הוכיחו להיות חיונית לאבחון הבריאות של אלמוגים. שינוי כמה מן הטכניקות הנפוצות ברפואה האנושית יכולה לשפר באופן ניכר של חוקרים היכולת לטפל ולשמור אלמוגים. כדי לטפל בבעיה זו, עבור בחיי עיר הכלאה בעיקר בשימוש ברפואה האנושית וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית פרוטוקול כבר מותאם לשימוש באלמוגים למבוגרים תחת לחץ.
מטרת שיטה זו היא להמחיש את הביטוי המרחבי של בדיקה RNA ברקמת האלמוג למבוגרים יש כבר מוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. שיטה זו מתמקדת הסרת פרפין, התייבשות של המדגם, רעלני לדוגמה כדי להבטיח חדירות של המדגם, הכלאה קדם דגירה, הכלאה של המכשיר RNA, הפריט החזותי של המכשיר RNA. זוהי שיטה חזקה בעת שימוש אורגניזמים שאינם-דגם לגלות שבו באים לידי ביטוי גנים ספציפיים, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות עבור אורגניזמים אחרים שאינם-מודל. עם זאת, השיטה זו מוגבלת כי זהו בעיקר איכותיים, כי עוצמת הביטוי יכול להשתנות בהתאם כמות הזמן בשימוש במהלך השלב חזותי וריכוז של המכשיר. יתר על כן, סבלנות נדרשת, כמו פרוטוקול זה יכול לקחת עד 5 ימים (וגם במקרים רבים, ארוכים יותר) בהתאם המכשיר בשימוש. לבסוף, צביעת הרקע שאינם ספציפיים שכיחה, אך ניתן להתגבר על מגבלה זו.
Introduction
האלמוגים הם בוני המערכת האקולוגית קריטי וחשוב עבור מגוון ביולוגי האוקיינוס ובריאות האדם-1,-2,-3. הם תחת איום בשל שינויי האקלים ואת שאר גורמי אנתרופוגניים, אלמוג מינים רבים נחשבים בסכנת הכחדה חמורה. לפיכך, יש צורך בכלים תאית ומולקולרית לאבחן אלמוגים תחת לחץ משמעותי. בנוסף, יש קצת מובנת על שבו גנים מבוטאים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים, ולכן מעט הבנה של הפונקציות של גנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו הסתגלו בחיי עיר הכלאה (איש) הפרוטוקול, נפוץ האנושי רפואה וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, לשימוש על דגימות רקמה פרפין-מוטבע של אלמוגים למבוגרים. טכניקה זו היא עוצמתי ביותר כאשר משתמשים באלמוגים מבוגרים שעברו אירוע מלחיץ כגון חשיפה עומס חום. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של רקמות, שלבי החיים באלמוגים, אינה מוגבלת רק אלמוגים הדגיש חום4,6,7. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו על רקמות או תאים של כל metazoan כל עוד יש cDNA רצף מידע זמין.
מטרת שיטה זו היא להמחיש RNA הגששים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים יש כבר נשמר, המוטבעות פרפין, למחלקה על שקופיות. שיטה זו היא כלי אבחון רב עוצמה המאפשר הפריט החזותי של חומצות גרעין בתוך רקמת האלמוג למבוגרים. בתחילה שיטה זו פותחה עבור אבחון רפואי, זה ומאז הפך להיות כלי פופולרי בתחומים כגון ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית8,9,10. איש גם שיטה קריטי, במיוחד במערכות שאינן-דגם, כאשר גנומית, transcriptomic רצף נתונים זמינים אך דפוסי ביטוי מרחבי הגן אינם ידועים. לעבודה האבחון במערכות שאינן-דגם, טכניקה זו היא חזקה כי זה יכול לציין אילו תאים ורקמות אקספרס הגן עניין והוא יכול להוביל יותר ממוקד גישות טיפוליות8,9,10, 11,12. לבסוף, טכניקה זו היא חזקה יותר כאשר יחד עם נתונים של ביטוי כמותי ג'ין11וכמותיים.
הגישה המתוארים במאמר זה יהיה עניין החוקרים כבר עיצבו את digoxigenin (מחדירים)-הנקרא RNA בדיקה (הגיוני והן antisense הגששים) והם עכשיו מוכן לבצע בחיי עיר הכלאה של הגששים מדגם. כדי לבצע בשיטה זו, יהיה צורך שני מקטעי רקמה פרפין אלמוג טורי עבור כל בדיקה הנבדקת. מקטע אחד ישמש עבור המכשיר הגיוני והשני עבור המכשיר antisense. החללית הגיוני יהיה פקד כדי לציין מחייב שאינם ספציפיים. אם צביעת הוא ציין את הגשוש הגיוני, ואז המכשיר antisense אינה ספציפית הרנ א עניין. הגששים יכולים מיועד לכל הגן בא לידי ביטוי. פרוטוקול זה, מספר דוגמאות משמשים שנמצאו קודם לכן לבוא לידי ביטוי במהלך עומס חום באלמוגים: FBJ אוסטאוסרקומה מאתר אונקוגן ויראלי homolog B (פוס-B), מפעיל חלבון (AP1), גידול נקרוזה מקדם קולטן 41 (TNFR 41)11. איש באמצעות התווית על-ידי החפירה RNA הגששים היא עדיפה על שימוש רדיואקטיבי הגששים כי הטיפול הוא הרבה יותר בטוח10. בנוסף, טכניקה זו היא רגישה מאוד, ניתן לבצע מגוון רחב של רקמות העוברים מעבר חום הדגיש אלמוגים למבוגרים13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הסרת פרפין
שים לב: בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume.
- Dewax דק-למחלקה פרפין-מוטבע השקופיות. עם 100% קסילן מתחת למכסה המנוע בצנצנות זכוכית Coplin למשך 10 דקות. אל תשתמש/י צנצנות פלסטיק Coplin, כפי קסילן נמס פלסטיק. לעקר את הצנצנות Coplin ב החיטוי לפני השימוש.
- הכינו ארבע צנצנות זכוכית סטריליים Coplin את הפעולות הבאות: אתנול 100%, 80% אתנול, אתנול 70% ו-60% אתנול. לדלל האתנול עם RNase ללא מים.
- להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 100% אתנול, להשרות אותם למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לרוקן את צנצנת הזכוכית Coplin והחלף חדש 100% אתנול. משרים את השקופיות שוב למשך 10 דקות.
- להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 80% אתנול עבור 1 דקות.
- להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם אתנול 70% עבור 1 דקות.
- להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 60% אתנול עבור 1 דקות.
2. רעלני של שקופיות עבור הכנה של RNA בדיקה הכלאה
- לבצע את מנקי הבאים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. מבצע בטמפרטורת החדר-מנקי תפקודי לב / נשימה במהירות איטית. להשתמש את פרסומי שקופית סטרילי עם חדר עבור שקופיות עד חמישה לשטיפת מכוניות של השקופיות.
- להעביר את השקופיות למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). לרחוץ למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- יוצקים את מגניב 1 x, ולטפל באופן מיידי הרקמה בשקופיות עם proteinase K כדי לאפשר חדירה בדיקה של הרקמה. להוסיף כ 18 מ של proteinase K פתרון מיילר שקופית (ראה טבלה 1 לעבודה פתרון ריכוז). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אל תלחץ.
- בזמן, השקופיות הן המקננת להכין מאגר prehybridization (מאגר Prehybe). למקם את המאגר Prehybe באמבט מים רותחים למשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב על אמבטיית קרח למשך 5 דקות. לקבלת מתכון של מאגר Prehybe, ראה טבלה 1.
- העיכול של התגובה proteinase K שמוציא את הפתרון proteinase K, ולקבל מיד להוסיף 18 מ של 0.2% גליצין-PBS פתרון מיילר שקופיות. תן את מיילר שקופית לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- שופכים את הפתרון גליצין-PBS 0.2% ולהוסיף mL 18 בפתרון נתרן מלוחים ציטראט (האס) 2 x מיילר כל שקופית. לשטוף את השקופיות 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם רועדת במהירות של 100-150 סל ד.
3. prehybridization של שקופיות לקראת בדיקה RNA הכלאה
- בזמן שהשקופיות להיות נשטפים עם 2 x SSC, להשיג למבוטחים סטרילי שקופית חדשה ולשים כ 18 מ של מאגר Prehybe לתוך מיילר שקופיות. מקם את מיילר שקופיות לתוך התנור הכלאה בטמפרטורת הכלאה.
הערה: הטמפרטורה הכלאה תלויות המכשיר בשימוש אבל בדרך כלל נע בין 50-60 מעלות צלזיוס. - עם סיום לשטוף את x SSC 2, שופכים את 2 x האס, והמקום השקופיות בתוך מיילר שקופית במאגר Prehybe בתנור הכלאה לשעה.
4. הכלאה של המכשיר RNA
- בעוד השקופיות הן המקננת עם המאגר Prehybe בתנור הכלאה, להכין פתרון הכלאה-בדיקה.
- לדלל כל בדיקה במאגר הכלאה (0.5 µL של בדיקה עם µL 24.5 הכלאה מאגר).
הערה: המתכון הכלאה המאגר נמצא בטבלה 1. דוגמה של ריכוז והכנה של המכשיר ניתן למצוא טריילור-נואלס. et al. 11. - למקם את המכשיר מדולל בבלוק חום 86-90 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ואז להתקרר למשך 1 דקות על קרח.
- לדלל כל בדיקה במאגר הכלאה (0.5 µL של בדיקה עם µL 24.5 הכלאה מאגר).
- להסיר את מיילר שקופית מהתנור הכלאה ולהסיר באופן אינדיבידואלי שקופיות מיילר שקופיות באמצעות פינצטה סטרילי. להניח את השקופיות על מגבת נייר, בזהירות. תנגב את מאגר עודף Prehybe סביב דגימות רקמה. להיזהר לא לגעת הדגימות, ועבודה במהירות כדי למנוע התייבשות דגימות רקמה.
- להקיף את הרקמה עם עט PAP. להחיל µL 25 בפתרון בדיקה מדולל עם פיפטה ולכסות את הדגימה עם coverslip פלסטיק.
- מקם את הדגימות בבית הבליעה לחות שקופיות עם 4 x האס + 50% פתרון formamide בחלק התחתון של החדר.
- ברגע הגששים נוספו כל השקופיות, מקום תא לחות שקופיות לתוך התנור הכלאה לפחות 24 שעות בטמפרטורה הכלאה של 50-60 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה יכולה להשתנות בהתאם הריכוז של המכשיר, אבל צריך להיות מינימום של 24 שעות.
- לאחר דגירה לילה עם הגששים מדולל, להסיר תא לחות שקופית מהתנור הכלאה.
- הסר כל אחת מהשקופיות, נזהר לא לעקור את רקמת coverslips. פיפטה µL 1000, להוסיף 1000 µL של פתרון x SSC 2, בעדינות לשטוף את השקופית.
- מקם את השקופית למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ של x SSC 2, לפתרון 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר 2 טריים x SSC. חזור על הדגירה שוב עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- יוצקים את הפתרון x SSC 2. להוסיף 18 מ של 1 x SSC פתרון ושטוף במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון x SSC 1 ולהחליף אותו עם 18 מ ל 1 טרי x SSC. חזור על הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- שופכים את 1 x SSC. להוסיף מ 18 ל 0.5 x האס ושטוף במשך 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד. שופכים את 0.5 x האס והחלף אותו עם 18 מ של 0.5 טרי x SSC. לשטוף שוב 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד.
5. ויזואליזציה של המכשיר RNA
הערה: המדגימה את החללית, מוניטור סגול ייעשה שימוש בתהליך הפיתוח. עם זאת, לפני שלב זה, מספר שוטף נדרשים להכין את הדגימות מכתים.
- לשטוף את השקופיות 18 מ ל מאגר phosphatase אלקליין (AP-מאגר) ללא MgCl2 ב 1 מינימלית שופכים AP-למאגר מבלי MgCl2, ולהוסיף mL 18 1 x Boehringer-מנהיים חסימה מאגר מדולל עם חומצה maleic מאגר. תקופת דגירה של פחות שעה בטמפרטורת החדר למבוטחים שקופיות עם טלטול עדין.
הערה: מאגר חסימה Boehringer-מנהיים ומאגר חומצה maleic השתמשו היו premade ורכש החפירה לשטוף, להגדיר מאגר בלוק (זמין מסחרית).- לחלופין, ניתן לבצע הדגירה למשך הלילה ב 4 ° C. תקופה עוד חסימה יעמעם את המראה של איגוד שאינם ספציפיים.
- להכין mL 20 של קטעים Fab anti-digoxigenin-AP החפירה מדולל (נוגדן אנטי החפירה = 2 µL של נוגדן אנטי החפירה + 20 מ ל 1 x מאגר חסימה Boehringer-מנהיים). זה מספיק לשימוש במיילר פלסטיק שקופית 1 יותר של פתרון זה חייב להיות מוכן אם אחד או יותר מיילר שקופית כדי לשמש.
- מוסיפים נוגדן אנטי החפירה למבוטחים סטרילי שקופית חדשה, להעביר את השקופיות מיילר שקופיות עם הפתרון נוגדן אנטי החפירה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות עם טלטול עדין.
- לאחר דגירה, שופכים הנוגדן אנטי החפירה ולשטוף את השקופיות ב מיילר שקופית 18 מ ל AP-מאגר ללא MgCl2 עבור חמש דקות עם טלטול עדין.
- שופכים את AP-המאגר ללא MgCl2, ולהוסיף מ 18 ל AP-Buffer. רחץ במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לאחר 5 דקות הדגירה, יוצקים את המאגר AP, להחליף אותו עם 18 מ ל AP טריים-מאגר, לשטוף במשך חמש דקות עם טלטול עדין.
- בחושך, שופכים את AP-המאגר ולהוסיף 18 מ של מוניטור סגול מיילר שקופיות. דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר בחושך, בדיקת לפיתוח צבע סגול שכל זמני התגובה ה ½ להמחשת ישתנו בהתבסס על החללית זה מפותח.
הערה: במקום מוניטור סגול ויזואליזציה, פיתוח פתרון יכול להתבצע באמצעות 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ו- tetrazolium ניטרו כחול (NBT). לקבלת הוראות, ראה טבלה 1 . - לעצור התפתחות צבע על ידי העברת השקופיות למבוטחים סטרילי שקופית חדשה עם mL 18 טריס-EDTA (TE) המאגר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
- יוצקים את המאגר טה ולהוסיף 18 מיליליטר מים נטולי RNase מיילר שקופיות ו בשביל 1 דקות, בחושך.
- הסר את השקופיות מן המים, לייבש אותם בקצוות של הרקמה. להוסיף גליצרול הרכבה בינונית ומניחים על coverslips. אחסן את השקופיות ב 4 ° C עד תמונות מוכן לקחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר השלמת פרוטוקול זה, זיהוי של תאים ורקמות כי הם ביטוי החללית RNA עניין תושג. התוצאות נציג עבור פרוטוקול זה מיועדות AP-1, FosB ו- TNFR41. התוצאות, שפורסמו קודם לכן על ידי טריילור-נואלס. et al. 11, הצג ביטוי מרחבי של RNA רגשים על אלמוגים למבוגרים זה נחשפו עומס חום. שתי דוגמאות מסוגים שונים מכתימים מוצגים באיור1. איור 1A היא דוגמה של צביעת רקמות ' מאטום לשקוף '. הכתם נמצא בכל הרקמות, לא רק בתוך תאים ספציפיים. . הנה, הביטוי של אנטי-תחושה AP-1 הוא נמצא בכל רחבי האפידרמיס ואת ה גסטרודרמיס אוראלי11 (איור 1 א'). ההכתמה הוא מפוזר, לא שביל לסוג תאים מסוים אחד. עבור סוג זה של צביעת, זה קריטי במיוחד להפעלת פקד הגיוני באותו זמן, כמו חלק התוצאות יכול להיות בגלל שאינם ספציפיים מכתים.
הסוג השני של צביעת הוא תא ספציפי, שבו הכתם נמצא רק סוגי תאים ספציפיים. FosB (איור 1B) והן TNFR41 (איור 1C) להראות מסוג זה מכתים. שני רגשים אלו שימשו על דגימות רקמה של אלמוגים למבוגרים זה שהיה חשוף של מתח חום11. בחלונית ' חוש אנטי ', צביעת סגול הוא ציין. TNFR41 היה בא לידי ביטוי בסוגים שונים של cnidocytes, משפחה של סוגי תאים זה נמצא רק בתוך cnidarians (איור 1). באופן ספציפי, זה מוכתם nematocytes המייצרים את אברון mastigophore microbasic (nematocysts), spirocytes לייצר spirocysts, מצאו כל בתוך האפידרמיס של רקמת האלמוג. Nematocytes מצויים גם שאר השכבות רקמות של האלמוג, כגון calicodermis; עם זאת, בשל לבצע דגימה מסוימת זו חלוקתה, המידע הזה לא ניתן לאסוף. FosB גם צבעונית cnidocytes והיה מסוים הן spirocytes והן nematocytes. שני הצדדים של רגשים אלו הפקד הגיוני הראתה לא מכתים, המציין כי ההכתמה עבור המכשיר אנטי-תחושה היה אכן ספציפיים. אלו רק שני סוגים של תוצאות נציג (צביעת רקמות ' מאטום לשקוף ', צביעת תאים ספציפיים) של טכניקות צביעת שעשויות להיות עם סוגים שונים של הגששים. עקב ההשתנות, חשוב להשתמש בפקד הגיוני לקבוע שאינם ספציפיים מכתים.
איור 1: התוצאה נציג של איש זה מוכתם תאים ספציפיים. (א) בחלונית ' הראשונה, הגיוני שליטה על החללית AP-1 מראה כתמים קטנים היא מתנה בתוך השקופית. בחלונית ' השני, החללית אנטי-תחושה AP-1 מראה מכתים עם המכשיר הזה היא מפוזר ברחבי הרקמה. הכתם הוא ספציפי גסטרודרמיס שבעל-פה, האפידרמיס. עם סוג זה של צביעת, חיוני להפעלת פקד הגיוני כדי להבטיח ההכתמה שנצפה ספציפיים. (ב) פקד הגיוני עבור המכשיר FosB שבלוח הראשון מראה קטנה מכתים הנוכחי. בחלונית ' השני, החללית תחושה אנטי להופעות FosB מכתים ספציפי אל spirocytes ואל nematocytes, עם מפוזר מכתים בכל רחבי גסטרודרמיס האפידרמיס, אורלי. (ג) בחלונית ' הראשון, הפקד הגיוני עבור המכשיר TNFR 41 מראה כי צביעת קטן קיים על השקופית. בחלונית ' השני, רגש אנטי-תחושה TNFR 41 מראה מסוים מכתים בתוך spirocytes, nematocytes, microblastic mastigophores. קיצורים: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (מ מ), המכילים ונאבו תא gastrodermal (סו). איור זה שוחזר עם הרשאה11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הערה: כל דילולים צריך להיעשות עם מים ללא תשלום RNase סטרילי, בלוק זכוכית. | |||
| מאגר Prehybe (50 מ"ל) | להוסיף | ||
| Formamide | 25 מ | ||
| X 20 האס (pH 4.5) | מ"ל | ||
| הפארין 20 מ"ג/מ"ל | 0.1 מ"ל | ||
| 50 X Denhardts | 5 מ | ||
| 20% Tween-20 | 0.5 mL | ||
| 20% מרחביות | 0.5 mL | ||
| 10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון DNA (denature לפני הוספת) | 2 מ | ||
| מים חינם RNase | 4.4 מ | ||
| הערה: הפתרון יכול להיות עשוי צינור disposible 50 מ. צריך להיות שפגע בסימני זרע סלמון על ידי הרתחה על גוש חום למשך 5 דקות לפני הוספת פתרון. | |||
| הכלאה מאגר (47 מ) | להוסיף | ||
| Formamide | 25 מ | ||
| X 20 האס (pH 4.5) | מ"ל | ||
| הפארין 20 מ"ג/מ"ל | 0.1 מ"ל | ||
| 50 X Denhardts | 5 מ | ||
| 20% Tween-20 | 0.5 mL | ||
| 20% מרחביות | 0.5 mL | ||
| 10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון DNA (denature לפני הוספת) | 2 מ | ||
| מים חינם RNase | 1 מ"ל | ||
| הערה: הפתרון יכול להיות עשוי צינור disposible 50 מ. צריך להיות שפגע בסימני זרע סלמון על ידי הרתחה על גוש חום למשך 5 דקות לפני הוספת פתרון. | |||
| X 10 PBS (1.0 L) | להוסיף | ||
| 18.6 מ"מ NaH2PO4 | 2.56 g | ||
| מ מ 84.1 נה2HPO4 | 11.94 g | ||
| 1,750 מ מ NaCl | 102.2 g | ||
| הערות: מערבבים פוספטים כ- 800 מ ל מים עבור אמצעי אחסון 1.0 L. בדוק את ה-pH. זה צריך להיות 7.4 ± 0.4. אחרת להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH של HCl. מוסיפים NaCl ואת שאר המים. לאחר ה-pH הוא אוטוקלב מנוכי עונתיות. | |||
| X 20 האס (1.0 L) | להוסיף | ||
| NaCl 3 מ' | 175.3 g | ||
| 0.3 M נה ציטראט | 88.2 g | ||
| הערות: מערבבים כ 800 מ ל מים חינם RNase להביא אל אמצעי אחסון 1.0 L. להתאים את ה-pH 4.5 ו אוטוקלב. | |||
| מאגר אלקליין פוספטאז (AP) ללא MgCl2 (50 מ"ל) | להוסיף | ||
| NaCl 1 מ' | 5.0 mL | ||
| 1 מ' טריס, pH 9.5 | 5.0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1.25 mL | ||
| מים חינם RNase | 38.75 mL | ||
| הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ. | |||
| אלקליין פוספטאז (AP) מאגר (100 מ"ל) | להוסיף | ||
| NaCl 1 מ' | 10.0 mL | ||
| MgCl 1 מ'2 | 5 מ | ||
| 1 מ' טריס, pH 9.5 | 10 מ | ||
| 20% Tween-20 | 2.5 מ | ||
| מים חינם RNase | 72.5 mL | ||
| הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ ל. הפתרון הפך מעונן אחרי כמה שעות, כבר לא יעבוד עבור התגובה אנזימטיות. | |||
| פתרון AP המצע | להוסיף | ||
| מאגר AP | 25 מ | ||
| NBT | 82.5 uL | ||
| BCIP | 82.5 uL | ||
| הערות: ניתן להשתמש במקום מוניטור סגול. להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ. שמור פתרון זה בחושך על ידי כיסוי התחתית בנייר, והכנת באור נמוך. | |||
| פתרון מניות proteinase K (10 mg/mL) | להוסיף | ||
| Proteinase K | 10 מ ג | ||
| מים חינם RNase | 10 מ | ||
| הערות: Aliquot וחנות ב-20 ° C. | |||
| Proteinase K עובד פתרון | להוסיף | ||
| פתרון מניות proteinase K | 90 ul | ||
| 1 X PBS | מ ל 18 | ||
| הערות: לעשות רק לפני השימוש לקבלת התוצאות הטובות ביותר. | |||
| 0.2 פתרון גליצין-PBS % | להוסיף | ||
| 10 X PBS | 45 מ | ||
| מים חינם RNase | 405 mL | ||
| גליצין | 1 g | ||
| הערות: להכין במיכל זכוכית בלוק. מערבבים בטמפרטורת החדר על צלחת stirer עד התפרקה לחלוטין גליצין. | |||
| מאגר חסימת Boehringer-מנהיים (30 מ"ל) (חלק החפירה לשטוף ואת ערכת מאגר בלוק) | להוסיף | ||
| 10 x חסימת פתרון | 3 מ | ||
| 1 x חומצה maleic מאגר | 27 mL | ||
| הערות: להפוך רק לפני השימוש לקבלת התוצאות הטובות ביותר. פתרון חסימת מלאי חומצה maleic מאגר שימשו מ "לשטוף את החפירה של רחוב-מאגר קבע". | |||
| האס X 4 – 50% formamide (30 מ ל) | להוסיף | ||
| 20 X האס | 6 מ | ||
| 50% formamide | מ ל 24 | ||
| הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ. הכינו מתחת מעבדה המנוע. | |||
| גליצרול הרכבה מדיה | להוסיף | ||
| 50 מ מ טריס, pH 8.4 | 80 ΜL | ||
| גליצרול | 20 ΜL | ||
טבלה 1: מלאי פתרונות עבור ביצוע בחיי עיר הכלאה. הטבלה היא רשימה של פתרונות מניות שונים הדרושים עבור פרוטוקול זה. סכומים כוללים מוערך לביצועים כ- 2 את פרסומי שקופיות. מומלץ להתאים סכומים כוללים מבוסס על הסכום של שקופיות המעובדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה השתנה מהעבודה הקודמת מחקר התפתחותי רפואי ואבולוציוני8,9,10,12,17. פרוטוקול זה מתמקד הניואנסים של הכלאה בחיי עיר גשש אנטי-תחושה RNA התווית על-ידי לחפור על מבוגרים אלמוגים, אשר נשמר, נעוץ פרפין. בשיטה זו ניתן להעביר בקלות את דגימות של אורגניזמים מעבר אלמוגים זה היו גם פרפין-מוטבע. לבסוף, שיטה זו יכולה להתבצע בשלבים חיים שונים של אלמוגים (למשל, פגית) או בתוך תרביות תאים, אולם פרוטוקול מדויק עשויות להיות שונות מאז סוגים אלה של דגימות אינם תמיד פרפין-מוטבע5,6 .
ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה, לרבות הטיפול proteinase K, הכלאה של המכשיר, ופיתוח צבע של המכשיר. במהלך הטיפול proteinase K, התזמון חשוב מאוד. אם הטיפול הוא יותר הציע, רקמות ניתן להיות מושפל, פגום. בנוסף, לעצור התגובה proteinase K צריכה להתבצע בנקודה במשרה מלאה הקבועה. חשוב גם לשמור את הדגימה בטמפרטורה קבועה הכלאה, כמו ירידה בטמפרטורה יכול לגרום מחייב שאינם ספציפיים של המכשיר, לסבך את התוצאות. כשהם רוחצים את החללית, חשוב לקחת כל שקופית מהתנור הכלאה אחת בכל פעם, במקום כל בבת אחת, כדי להבטיח השקופיות לא hybridize עם החללית בטמפרטורה נמוכה. כמו כן, שטיפה של השקופיות לאחר בדיקה הכלאה תסייע למנוע מחייב שאינם ספציפיים. לבסוף, צבע פיתוח של המכשיר הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר אך סובייקטיבית של תהליך זה. פיתוח צבע יכול להיות בקלות יתר על המידה או עצר מוקדם מדי. שלב זה דורש סבלנות, דריכות על מנת להבטיח את צביעת יתר של השקופיות אינו מתרחש.
פתרון בעיות בפרוטוקול זה יכול להיות תהליך מרתיע עקב מספר השלבים המעורבים. אם הפרוטוקול מניב תוצאות שליליות, אז עדיף להתחיל על-ידי בדיקת המכשיר כדי לוודא כי זה החוש אנטי (וגם לא התחושה) בדיקה. בנוסף, אם הפתרונות הישן, זה שווה חידושה או החלפתם ולכן הם טריים בעת ביצוע פרוטוקול זה. ניתן ליישם שינויים, כגון אורך הכלאה וחסימת, כדי להגדיל את הסיכוי של בדיקה הכלאה או הפחתת כמויות של רקע שאינם ספציפיים מכתים. בשל המספר הגבוה של השלבים של פרוטוקול זה, זה עשוי להיות קל לאבד; לכן, חשוב להישאר מאורגן ולעקוב אחר אילו חלקים של הפרוטוקול הושלמו. בנוסף, חיוני כדי להבטיח כי תדלג על שלבים לא, הזמן הזה הוא לא צמצם במהלך incubations, שוטף. כלל אצבע טוב נועד לאפשר יותר זמן מאשר שוטף קצר יותר כדי להבטיח כי כל השקופיות מנוקים ביסודיות.
המגבלה הגדולה ביותר של שיטה זו הוא כי התוצאות אינן לכימות. זוהי שיטה איכותי זה, ביחד עם שיטות אחרות כגון כפפות, transcriptomics פרוטאומיקס, מאוד אינפורמטיבי. בשל הבדלים הכלאה פעמים, כמו גם את הזמנים סובייקטיבית במהלך ויזואליזציה, לכימות עוצמת ההכתמה היא לא מושגת בקלות. . זה מפתה לומר כי בדיקה מתבטא גבוהה יותר אם זה מראה בעוצמה גדולה יותר, אך בגלל הוריאציות במאגר זה פרוטוקול (כגון משך הזמן המותר לפיתוח צבע), לא ניתן לקבוע סכומים ביטוי גנים.
טכניקה זו אינה שיטה חדשה בביולוגיה; עם זאת, זהו אחד לא מתבצע לעיתים קרובות על אלמוגים למבוגרים. השימוש בשיטה זו על אלמוגים למבוגרים חזק מאוד כי זה עוגנים נתונים ביטוי גנים טישו או תא הקלד11. Transcriptomics, גנומיקה הפכו כלי פופולרי וחזק בביולוגיה אלמוג; עם זאת, שיטות אלה נעשים בדרך כלל על homogenates של כל החיות. דבר זה הופך מאתגרת כדי לזהות אילו חלקים של האלמוגים הם ביטוי הגנים של עניין, ובכך יותר מאתגר להבין את המנגנונים בפועל. באמצעות איש יחד עם נתוני ביטוי גנים, יכולה להיות מושגת בצורה הוליסטית כדי ואיפה באיזו מידה באים לידי ביטוי של גנים. זה יעזור מאוד בהבנת המנגנונים אחראי מתח שונה מסלולים התגובה באלמוגים למבוגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי פרס אין. OCE-1323652 דרך no.1012629 הלאומי למדע קרן האוקיינוס המדע בתר ופרס מתוכנית בורוז Wellcome קרן פוסט-דוקטורט העשרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
