Summary
Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.
Abstract
Mercan genel okyanus sağlığı hem de insan sağlığı için önemlidir önemli okyanus omurgasızlar vardır. Ancak, yükselen okyanus sıcaklıklar ve okyanus asitleştirme gibi insan etkileri nedeniyle, mercan giderek tehdit altında vardır. Bu sorunları çözmek için hücre ve moleküler biyoloji gelişmeler mercan sağlık tanılamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. İnsan tıpta çok kullanılan tekniklerden bazıları değiştirme tedavi ve mercan kaydetmek için araştırmacıların yeteneği büyük ölçüde artırabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için öncelikle insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi kullanılan in situ hibridizasyon için bir protokol yetişkin mercan stres altında kullanmak için adapte edilmiştir.
Bu yöntemin amacı bir RNA sondayı parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan doku içine kayma ifade görselleştirmek etmektir. Bu yöntem parafin ve rehydration örnek kaldırma, ön örnek, öncesi hibridizasyon kuluçka, RNA sonda hibridizasyon ve RNA sonda görselleştirme geçirgenliği sağlamak için örnek üzerinde odaklanır. Sigara model organizmalar nerede belirli genlerin ifade edilir ve protokol diğer sigara model organizmalar için kolayca adapte edilebilir keşfetmek için kullanırken bu güçlü bir yöntemdir. Öncelikle nitel, çünkü ifade yoğunluğu görselleştirme adım ve sonda konsantrasyonu sırasında harcanan zamanı miktarına bağlı olarak değişebilir ancak, yöntem sınırlı olmamasıdır. Bu iletişim kuralı-ebilmek almak ilâ 5 gün (ve birçok durumda daha uzun) kullanılan sonda bağlı olarak Ayrıca, sabır, gerekmemektedir. Son olarak, non-spesifik arka plan boyama yaygındır, ama bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.
Introduction
Mercan çoğu kritik ekosistem inşaatçılar ve okyanus ve insan sağlığı1,2,3' te biyoçeşitlilik için önemli. İklim değişikliği ve diğer antropojenik stres nedeniyle tehdit altında olduklarını ve birçok mercan türünün kritik tehlike altında olarak kabul edilir. Böylece, mercan stres altında tanılamak hücresel ve moleküler araçları için önemli bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, orada az nerede genler yetişkin mercan doku ve bu genlerin fonksiyonları bu nedenle küçük anlayışı içinde ifade edilir hakkında anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için sık kullanılan insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi, parafin gömülü doku örnekleri yetişkin mercanlar üzerinde kullanım için in situ hibridizasyon (ISH) protokolü adapte olması. Isı stres maruz gibi stresli bir olay geçiren yetişkin mercanlar üzerinde kullanıldığında en güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknik çok çeşitli doku ve mercan hayat aşamalarında kullanılan ve sadece ısı vurguladı mercan4,6,7için sınırlı değildir. Ayrıca, orada olduğu sürece cDNA sırası bilgi kullanılabilir Bu teknik dokular veya herhangi bir metazoan hücreleri üzerinde kullanılabilir.
Bu yöntemin amacı RNA probları yetişkin mercan doku korunmuş ve parafin içinde gömülü ve slaytlar kesitli içinde görselleştirmek etmektir. Bu yöntem, nükleik asitler yetişkin mercan doku içinde görselleştirme sağlar güçlü bir tanı aracıdır. Başlangıçta bu yöntem tıbbi teşhis için geliştirilmiş ve beri alanlarda gelişim biyolojisi ve evrimsel gelişim biyolojisi8,9,10gibi popüler bir araç haline gelmiştir. ISH da kritik, özellikle sigara modeli sistemlerinde, genomik zaman yöntemidir ve transcriptomic sıra veri mevcut ancak kayma gen ifade desenleri bilinmemektedir. Hangi hücre ve dokuların bir gen ilgi hızlı ve daha fazla hedefli tedavi yaklaşımları8,9,10' aaçabilir belirtebilirsiniz tanılama iş için model olmayan sistemlerde, bu teknik güçlü çünkü, 11,12. Son olarak, bu teknik nitel ve nicel gen ifadesi verileri11ile eşleştirilmiş durumdayken daha güçlü olur.
Bu makalede özetlenen yaklaşım zaten bir digoxigenin (kazmak) tasarladık araştırmacılar için ilgi olacaktır-RNA sonda (anlam ve antisens probları) ve are şimdi bir örnek probları in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için hazır etiketli. Bu yöntemi gerçekleştirmek için iki seri bölümler parafin mercan doku test edilen her sonda için gerekli olacaktır. Bir bölümü anlamda sonda diğeri antianlamlı sonda kullanılacaktır. Anlamda sonda non-spesifik bağlama belirtmek için bir kontrol olacak. Boyama anlamda soruşturma görülmektedir, faiz RNA için belirli antianlamlı sonda tek değil. Probları ifade herhangi bir gen için tasarlanabilir. Bu protokol için birkaç örnek daha önce mercan ısı stres sırasında ifade edilecek bulunan kullanılmıştır: FBJ fare osteosarkom viral onkogen homolog B (Fos-B), aktivatör protein (AP1) ve tümör nekroz faktör reseptör 41 (TNFR 41)11. KAZMAK etiketli RNA problar kullanarak ISH kullandıklarında daha fazla daha güvenli10olduğundan radyoaktif problar kullanarak üzerinden tercih edilir. Buna ek olarak, bu teknik son derece hassas ve çok çeşitli doku ve ısı vurguladı yetişkin mercan13,14,15,16ötesinde embriyo üzerinde gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. parafin kaldırılması
Dikkat: bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- İnce kesitli parafin Katıştırılmış slaytlar ile % 100 ksilen Coplin kavanozların 10 dk içinde başlık altında dewax. Ksilen plastik erir olarak plastik Coplin kavanoz, kullanmayın. Bir otoklav kullanmadan önce Coplin kavanozlarda sterilize.
- Aşağıdaki dört steril cam Coplin kavanoz hazırlamak: % 100 etanol, % 80'i etanol, % 70 etanol ve % 60 etanol. Etanol RNase free suyla seyreltik.
- 10 dakikadır onları emmek ve steril cam Coplin % 100 etanol ile slaytlar transfer. 10 dk sonra cam Coplin boş ve yeni % 100 etanol ile değiştirin. Slaytları 10 min için tekrar ıslatın.
- Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 80 etanol ile aktarın.
- Slaytları steril cam Coplin % 70 etanol için 1 dk ile aktarın.
- Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 60 etanol ile aktarın.
2. RNA sonda hibridizasyon hazırlanması için slaytların Önarıtma
- Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında, aşağıdaki yıkar gerçekleştirin. Oda sıcaklığında yıkar bir orbital çalkalayıcı yavaş hızda gerçekleştirin. Steril slayt postaları slaytları yıkama için en çok beş slaytlar için oda ile birlikte kullanın.
- Slaytlar ile 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 18 mL steril slayt mailler aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
- 1 x PBS dökün ve hemen sonda penetrasyon dokusunun etkinleştirmek için İndinavir K bulunan slaytlarda doku tedavi. Yaklaşık 18 mL İndinavir K çözeltisi slayt mailler eklemek (çözüm konsantrasyonu çalışmak için bkz. Tablo 1 ). 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Sallama.
- Slaytları kuluçka iken, prehybridization arabellek (Prehybe arabellek) hazırlayın. Prehybe arabellek 10 dakika kaynar su banyosu içinde yer, o zaman bir buz banyosu 5 min için serin. Prehybe arabellek tarifini bkz. Tablo 1.
- Sindirim İndinavir K tepki dışarı İndinavir K eriyik dökerek durdurmak ve hemen slayt mailler için 18 mL % 0,2 glisin-PBS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için oturup slayt mailler izin.
- % 0,2 glisin-PBS solüsyonu dökün ve her slayt mailler için 18 mL 2 x Serum sodyum sitrat (SSC) çözeltisi ekleyin. Slaytları 2 yıkama x SSC 100-150 rpm'de sallayarak ile 10 dakika oda sıcaklığında.
3. prehybridization slayt RNA sonda hibridizasyon için hazırlık
- Slaytları 2 ile yıkanır iken x SSC, yeni bir steril slayt mailler alın ve yaklaşık 18 mL Prehybe arabelleği slayt mailler koymak. Slayt mailler hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık fırında yerleştirin.
Not: Hibridizasyon sıcaklık genellikle 50-60 ° c arasında değişmektedir ama kullanılan sonda göre değişir - 2 x SSC yıkama tamamlandığında, 2 x SSC ve yere dökmek Slaytları Slayt mailler Prehybe arabellek için 1s hibridizasyon fırında içinde.
4. hibridizasyon RNA sonda
- Slaytları hibridizasyon fırın Prehybe arabelleği ile kuluçka iken, hibridizasyon-sonda çözüm hazırlamak.
- Her sonda hibridizasyon arabelleği (24.5 µL hibridizasyon arabelleği ile inceleyebilirsek 0.5 µL) oranında seyreltin.
Not: Tarifi hibridizasyon arabellek için Tablo 1' de bulunur. Sonda hazırlık ve konsantrasyonları örneği-ebilmek bulunmak içinde Traylor Knowles vd. 11. - 12 dk bir 86-90 ° C ısı blokta seyreltilmiş sonda yer, o zaman buz üzerinde 1 dk. için serin.
- Her sonda hibridizasyon arabelleği (24.5 µL hibridizasyon arabelleği ile inceleyebilirsek 0.5 µL) oranında seyreltin.
- Slayt mailler hibridizasyon Fırından çıkarın ve tek tek slaytlar steril Cımbız kullanarak slayt mailler kaldırın. Düz kağıt havlu üzerinde slaytlar yatıyordu ve dikkatle doku örnekleri geçici aşırı Prehybe arabellek yok etmek. Örnekleri, dokunmak dikkatli olun ve iş hızlı doku örnekleri kurutma önlemek için.
- Doku PAP kalemle çevreler. Bir pipet ile seyreltilmiş sonda çözümün 25 µL uygulamak ve bir plastik coverslip ile örnek kapak.
- Örnekleri slayt nem odası ile 4 x SSC + % 50 formamide çözüm içinde belgili tanımlık dip odasının yerleştirin.
- Probları tüm slaytlara eklendikten sonra slayt nem odası hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık 50-60 ° c en az 24 saat fırında yerleştirin Kuluçka süresi sonda konsantrasyonu bağlı olarak değişebilir ama en az 24 saat olmalıdır.
- Seyreltilmiş probları ile gece kuluçka sonra slayt nem odası hibridizasyon Fırından çıkarın.
- Coverslips doku yerinden değil dikkatli olmak slaytların herbirinden kaldırın. 1000 µL pipet 1000 µL 2 x SSC çözüm ekleyin ve slayt nazikçe yıkayın.
- Slayt 18 mL oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC çözeltisi ile steril slayt mailler yerleştirin. Solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 2 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için tekrar.
- 2 x SSC solüsyonu dökün. 1 x SSC çözüm ve 5 min için yıkama 18 mL oda sıcaklığında ekleyin. 1 x SSC solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 1 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için yineleyin.
- 1 dökmek x SSC. 18 mL 0.5 x SSC ve 10 min için yıkama 42 ° C'de sallayarak olmadan ekleyin. SSC ve Değiştir x 0.5 dökmek 18 mL taze 0,5 ile x SSC. Tekrar sallayarak olmadan 42 ° C'de 10 dakika yıkayın.
5. RNA sonda görselleştirme
Not: sonda görüntülenmesi için BM mor geliştirme süreci sırasında kullanılır. Ancak, bu adımdan önce birkaç yıkama için boyama örnekleri hazırlamak için gereklidir.
- Olmadan MgCl2 1 dk. AP-tampon MgCl2olmadan dökmek ve 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek Maleik asit tampon ile seyreltilmiş ekleyin slaytlar alkalen fosfataz arabelleği (AP-tampon) 18 mL ile yıkayın. Nazik sallayarak ile bir slayt mailler içinde oda sıcaklığında en az 1 h için kuluçkaya.
Not: Boehringer-Mannheim engelleme tampon ve kullanılan Maleik asit tampon erken ve kazmak yıkama ve blok arabellek ayarla satın (mevcut ticari olarak).- Alternatif olarak, kuluçka gecede 4 ° C'de gerçekleştirilir. Artık bu engelleme bir süre belirsiz bağlama görünümünü azaltmak olacaktır.
- Seyreltilmiş kazmak anti-digoxigenin-AP Fab parçaları 20 mL hazırlamak (Anti-kazmak antikor Anti-kazmak antikor + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek 2 µL =). Bu 1 Plastik slayt mailler kullanımda yeterli olur. Birden fazla slayt mailler kullanılacak ise bu çözüm daha fazla hazırlanmalıdır.
- Anti-kazmak antikor yeni bir steril slayt mailler ekleyin ve Slaytları Slayt mailler Anti-kazmak antikor çözüm ile aktarın. Nazik sallayarak ile 3 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Kuluçka sonra anti-kazmak antikor dökmek ve Slaytları Slayt mailler AP-tampon 18 mL MgCl2 nazik sallayarak ile 5 min için olmadan ile yıkayın.
- AP-tampon MgCl2, olmadan dökmek ve AP-tampon 18 mL ekleyin. Nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. 5 dk kuluçka sonra AP-tampon dökün, eski yerine koymak o ile 18 mL taze AP-arabelleği ve nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın.
- Karanlıkta, AP-tampon dökmek ve BM mor 18 mL slayt mailler için ekleyin. Slayt görüntüleme için her ½ h. tepki süreleri değişir mor renk geliştirme geliştirilmektedir prob dayanarak denetleniyor karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
Not: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ve nitro mavi tetrazolium (NBT) kullanarak BM mor görselleştirme yerine geliştirme çözümü yapılabilir. Yönergeler için bkz: Tablo 1 . - Renk geliştirme Tris-EDTA (TE) arabelleği karanlık oda sıcaklığında 5 min için 18 mL ile yeni bir steril slayt mailler için slaytları aktararak durdurmak.
- TE tampon dökün ve slayt mailler ve karanlıkta 1 dk. için yıkama 18 mL RNase free su ekleyin.
- Slaytları sudan çıkarın ve kuru onları dokuyu kenarlarda. Ve coverslips yer Orta montaj gliserol ekleyin. Resimler alınacak hazır olana slaytlar 4 ° C'de depolayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı tamamlandıktan sonra hücreleri ve RNA sonda ilgi ifade eden dokular elde edilecektir. Bu iletişim kuralı için temsilcisi fark AP-1, FosB ve TNFR41 için sonuçlarıdır. Bu sonuçlar, daha önce Traylor Knowles ve ark. tarafından yayınlandı 11, ısı stres maruz kaldılar yetişkin mercanlar üzerinde gösteri kayma ifade RNA'ın sondalar. İki farklı boyama türü örnekleri Şekil 1' de sunulmaktadır. Şekil 1A diffüz doku boyama bir örnektir. Leke doku sadece belirli hücrelerde bulunur. Burada, Anti-anlamda AP-1 ifadesi epidermis ve oral gastrodermis11 (Şekil 1A) bulunur. Boyama yaygın ve değil bir belirli hücre tipi için ayrılmış. Bazı sonuçları belirsiz boyama nedeniyle gibi boyama bu tür için bu bir anlamda denetim aynı zamanda çalıştırmak için özellikle önemlidir.
Boyama ikinci hücre özgü, leke sadece belirli hücre tiplerinde bulunur türüdür. FosB (Şekil 1B) ve TNFR41 (Şekil 1 c) bu tür boyama göster. Her ikisi de bu sondalar doku örnekleri bir ısı stres11' e maruz kalan yetişkin mercanlar üzerinde kullanılmıştır. Anti-anlamda panelinde mor boyama görülmektedir. TNFR41 cnidocytes, sadece cnidarians (Şekil 1) içinde bulunan bir aile hücre tiplerinin farklı türde ifade edildi. Özellikle, microbasic mastigophore organel (nematocysts) üretmek nematocytes ve spirocysts, tüm mercan doku epidermisin içinde bulunan üretmek spirocytes lekeli. Nematocytes da calicodermis gibi mercan diğer doku katmanları bulunur; Ancak, bu belirli örnek üzerinde gerçekleştirilen kesit nedeniyle, bu bilgiyi elde edilebilir değil. FosB da cnidocytes lekeli ve spirocytes ve nematocytes için özel. Bu sondalar adınıza anlamda denetim yok boyama, boyama için anti-anlamda sonda gerçekten özel olduğunu belirten gösterdi. Bu sondalar farklı tipleri ile mevcut olabilir boyama teknikleri temsilcisi sonuçları (diffüz doku boyama ve hücre özel boyama) sadece iki türü vardır. Bu değişkenlik nedeniyle, non-spesifik boyama belirlemek için bir anlamda denetimi kullanmak için önemlidir.
Şekil 1: belirli hücreleri lekeli ISH temsilcisi sonucu. (A) ilk panelinde anlamda denetim için AP-1 sonda küçük boyama slayt içinde yüklü olduğunu gösterir. İkinci panelinde, AP-1 için anti-anlamda sonda Bu sonda ile boyama doku yaygın olduğunu gösterir. Leke oral gastrodermis ve epidermis özgüdür. Boyama bu tür ile gözlenen boyama belirli olduğundan emin olmak için bir anlamda denetim çalıştırmak için önemlidir. (B) bir anlamda ilk paneli FosB soruşturma için küçük mevcut boyama görüntülüyor. İkinci panelinde FosB Anti-anlamda prob spirocytes ve nematocytes diffüz epidermis ve oral gastrodermis boyama ile özel boyama gösterir. (C) ilk panelinde anlamda denetim TNFR 41 soruşturma için küçük boyama slayt üzerinde yüklü olduğunu gösterir. İkinci panelinde Anti-anlamda sonda TNFR 41 için spirocytes, nematocytes ve microblastic mastigophores içinde boyama belirli gösterir. Kısaltmalar: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), konukçunun içeren gastrodermal hücreye (SU). Bu rakam izni11ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Not: Tüm dilutions autoclaved cam ürünleri steril, RNase Free su ile yapılmalıdır. | |||
| Prehybe arabellek (50 mL) | EKLE | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0.1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| % 20 Ara-20 | 0.5 mL | ||
| % 20 SDS | 0.5 mL | ||
| 10 mg/mL somon Sperm DNA (eklemeden önce denatüre) | 2 mL | ||
| RNase Free su | 4.4 mL | ||
| Not: Çözüm bir disposible 50 mL tüp içinde yapılabilir. Somon Sperm ısı blokta çözüm eklemeden önce 5 dakika kaynatılarak denatüre. | |||
| Hibridizasyon arabellek (47 mL) | EKLE | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0.1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| % 20 Ara-20 | 0.5 mL | ||
| % 20 SDS | 0.5 mL | ||
| 10 mg/mL somon Sperm DNA (eklemeden önce denatüre) | 2 mL | ||
| RNase Free su | 1 mL | ||
| Not: Çözüm bir disposible 50 mL tüp içinde yapılabilir. Somon Sperm ısı blokta çözüm eklemeden önce 5 dakika kaynatılarak denatüre. | |||
| 10 X PBS (1.0 L) | EKLE | ||
| 18.6 mM NaH2PO4 | 2,56 g | ||
| 84,1 mM Na2HPO4 | 11,94 g | ||
| 1750 mM NaCl | 102.2 g | ||
| Notlar: Fosfatlar 800 ml su 1.0 L cilt için karıştırın. PH kontrol edin. Bu 7,4 ± 0,4 olmalıdır. Yoksa pH 7.4 NaCl NaOH, HCl. ekleyin ve su geri kalanı için değiştirin. PH ayarlanan otoklav sonra. | |||
| 20 X SSC (1.0 L) | EKLE | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0.3 M Na sitrat | 88.2 g | ||
| Notlar: Yaklaşık 800 mL 1.0 L birime getirmek için RNase free su karışımı. PH 4.5 ve basınçlı kap için ayarlayın. | |||
| Alkalin fosfataz (AP) arabellek MgCl2 (50 mL) w/o | EKLE | ||
| 1 M NaCl | 5.0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5.0 mL | ||
| % 20 Ara-20 | 1,25 mL | ||
| RNase Free su | 38.75 mL | ||
| Notlar: Bir 50 mL tüp kullanmadan sadece önce hazırlayın. | |||
| Alkalin fosfataz (AP) arabellek (100 mL) | EKLE | ||
| 1 M NaCl | 10.0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| % 20 Ara-20 | 2.5 mL | ||
| RNase Free su | 72,5 mL | ||
| Not: sadece bir 50 mL tüp kullanmadan önce hazırlayın. Çözüm birkaç saat sonra bulutlu olur ve artık enzimatik reaksiyon için çalışır. | |||
| AP substrat çözeltisi | EKLE | ||
| AP arabellek | 25 mL | ||
| NBT | 82.5 uL | ||
| BCIP | 82.5 uL | ||
| Notlar: Bu BM mor yerine kullanılabilir. Bir 50 mL tüp kullanmadan sadece önce hazırlayın. Bu çözüm tüp folyo kaplama ve düşük ışık koşullarında hazırlanması karanlıkta bırakın. | |||
| İndinavir K hisse senedi çözüm (10 mg/mL) | EKLE | ||
| İndinavir K | 10 mg | ||
| RNase Free su | 10 mL | ||
| Notlar: Aliquot ve mağaza-20 ° C'de | |||
| Çözüm çalışma İndinavir K | EKLE | ||
| İndinavir K hisse senedi çözüm | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Notlar: En iyi sonuçlar için kullanmak için sadece önceki olun. | |||
| %0,2 glisin-PBS çözüm | EKLE | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase ücretsiz su | 405 mL | ||
| Glisin | 1 g | ||
| Notlar: autoclaved cam kapta hazırlamak. Stirer plaka üzerinde oda sıcaklığında glisin tamamen eriyene kadar karıştırın. | |||
| Boehringer-Mannheim engelleme arabellek (30 mL) (kazmak yıkama ve blok arabellek kümesi parçası) | EKLE | ||
| çözüm engelleme x 10 | 3 mL | ||
| Maleik asit arabellek x 1 | 27 mL | ||
| Not: en iyi sonuç için kullanmak için sadece önceki olun. Hisse senedi engelleme çözüm ve Maleik asit tampon kullanılmıştır "kazmak yıkama ve blok-arabellek kümesi". | |||
| 4 X SSC — % 50 formamide (30 mL) | EKLE | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| % 50 formamide | 24 mL | ||
| Notlar: 50 mL tüp kullanmadan sadece önce hazırlayın. Laboratuvar başlık altında hazırlayın. | |||
| Gliserol montaj medya | EKLE | ||
| 50 mM Tris, pH 8.4 | 80 ΜL | ||
| Gliserol | 20 ΜL | ||
Tablo 1: stok çözümleri gerçekleştirmek için situ hibridizasyon. Tablo bu iletişim kuralı için gerekli farklı hisse senedi çözümler listesidir. Toplam tutarlar için yaklaşık 2 Slayt postaları performans tahmin edilir. Bu toplam tutarları işlenmekte olan slaytlar miktarına göre ayarlamak için tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için açıklanan yöntemi tıbbi ve evrimsel gelişim araştırma8,9,10,12,17önceki işten değiştirildi. Bu iletişim kuralı bir in situ hibridizasyon nüansları korunmuş ve parafin içinde gömülü yetişkin mercanlar üzerinde kazmak etiketli RNA Anti-anlamda sonda ile odaklanır. Bu yöntem ayrıca parafin gömülü olan mercan ötesinde organizmaların örnekleri için kolayca transfer edilebilir. Son olarak, bu yöntem-ebilmek var olmak kılınmak sırasında farklı yaşam evreleri mercanlar (Örneğin, larva) veya hücre kültürleri içinde ama bu tür örnekleri parafin gömülü5,6 değildir bu yana tam protokolü farklı olabilir .
Sonda hibridizasyon ve sonda renk geliştirilmesi İndinavir K tedavisi de dahil olmak üzere bu protokol için birkaç önemli adım vardır. İndinavir K tedavi sırasında zamanlama çok önemlidir. Tedavisi önerdi daha uzun ise, dokular bozulmuş ve zarar görmüş olmak. Ayrıca, İndinavir K tepki durdurma belirtilen tam zamanlı noktada gerçekleştirilmesi gerekiyor. Ayrıca örnek bir sabit hibridizasyon sıcaklıkta tutmak için kritik sıcaklığı düşürücü olarak non-spesifik bağlama sondanın neden ve karmaşık sonuçlar. Sonda yıkarken, bir zaman, yerine tüm slaytları bir düşük sıcaklık probu ile melez değil olduğunu emin olmak için bir kez, her slayt hibridizasyon fırın bir dışarı atın önemlidir. Ayrıca, slaytları ayrıntılı yıkandıktan sonra sonda hibridizasyon non-spesifik bağlama engellenmesine yardımcı olur. Son olarak, sonda renk geliştirilmesi bu sürecin en kritik henüz öznel adımlardan biridir. Renk geliştirme kolayca abartılı veya çok erken durdu. Bu adımı sabır gerektirir ve bu slaytlar aşırı boyama emin olmak için sürekli tetikte oluşmaz.
Bu iletişim kuralı sorun giderme adımları sayısı nedeniyle zor bir işlem olabilir. Protokol olumsuz sonuçlar verir, o zaman bu anti-anlam (ve değil anlamında) olduğundan emin olmak için sonda inceleyerek başlamak için en iyi sonda. Ayrıca, eski çözümlerdir, mahiyettedir ya onlar bu protokolü gerçekleştirirken taze böylece onları yerine değer tek. Hibridizasyon ve engelleme, uzunlukları gibi değişiklikleri sonda hibridizasyon ya da arka plan ve non-spesifik boyama miktarda azaltarak şansını artırmak için uygulanabilir. Bu iletişim kuralı adımda yüksek sayıda nedeniyle, izini kaybetmek kolay olabilir; Bu nedenle, düzeninizi korumanıza ve protokol hangi bölümleri tamamlanmıştır izlemek önemlidir. Ayrıca, hiçbir adım atlanır ve o zaman incubations ve yıkama sırasında aşağı kesilir değil emin olmak için önemlidir. Bir kural için tüm slaytları iyice temizlenir emin olmak için daha kısa yıkama yerine uzun izin vermektir.
Bu yöntemin en büyük sınırlama sonuçları ölçülebilir değildir. Bu, histoloji, transcriptomics ve Proteomik, gibi diğer yöntemleri ile uyum içinde çok bilgilendirici bir nitel yöntemidir. Hibridizasyon hem de görselleştirme öznel zamanlarda nedeniyle değişimler, boyama şiddeti miktarının kolayca başarılı değil. O bir sonda daha yüksek büyük yoğunluğu gösterir ancak bu Protokolü (örneğin, renk geliştirme için izin verilen süre miktarını) değişimler nedeniyle gen ifade miktarları tespit edilemez ifade edilir demek için cazip olduğunu.
Bu teknik biyolojide yeni bir yöntem değildir; Ancak, çok sık yetişkin mercanlar üzerinde gerçekleştirilen değil biridir. Yetişkin mercanlar üzerinde bu yöntemin kullanılması çok güçlü çünkü gen ifadesi verileri için bir doku tutturur veya bir hücre11yazın. Transcriptomics ve genomik popüler ve güçlü araçlar mercan biyolojide olmuştur; Ancak, bu yöntemler genellikle bütün hayvan homogenates üzerinde yapılır. Bu mercan hangi bölümlerinin genler ilgi ifade tanımlamak için zorlu ve böylece daha gerçek mekanizmalarını anlamaya zor yapar. Gen ifadesi verileri ile birlikte ISH kullanılarak nerede ve ne ölçüde genlerin ifade edilir daha bütünsel bir yaklaşım elde edilebilir. Bu büyük ölçüde farklı stres yanıt yollar yetişkin mercan sorumlu mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ödülü tarafından finanse edildi yok. OCE-1323652 Ulusal Bilim Vakfı okyanus bilimi doktora sonrası Bursu ve Ödülü no.1012629 Burroughs Wellcome Fonu doktora sonrası zenginleştirme programı aracılığıyla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
