Database-styrede flowcytometri for evaluering af knoglemarven myeloide celle modning

Summary

MDS diagnose er vanskeligt i mangel af morfologiske kriterier eller ikke-informativ cytogenetisk. MFC kunne bidrage til at forædle MDS diagnostiske proces. For at blive nyttige for klinisk praksis, MFC analysen skal være baseret på parametre med tilstrækkelig specificitet og sensitivitet, og oplysningerne skal være reproducerbare mellem forskellige operatører.

Abstract

En arbejdsgruppe, der er iværksat inden for den franske flowcytometri (AFC) blev udviklet for at harmonisere anvendelsen af multiparameter flowcytometri (MFC) for myeloid sygdom diagnose i Frankrig. Protokollen præsenteres her var aftalt og anvendt mellem September 2013 og November 2015 i seks franske diagnostiske laboratorier (universitetshospitaler i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, og Lille og Institut Paoli-Calmettes i Marseille) og tilladt standardisering af knoglemarven prøve forberedelse og dataopsamling. Tre modning databaser blev udviklet til neutrofile, monocytic, og erythroid lineages med knoglemarv fra "sund" donor personer (personer uden nogen tegn på en hæmatopoietisk sygdom). En robust metode til analyse af hver myeloide lineage bør gælde for rutinemæssig diagnostisk brug. Nye tilfælde kan analyseres på samme måde og sammenlignet med de sædvanlige databaser. Således, kvantitative og kvalitative fænotypisk abnormiteter kan identificeres og dem over 2SD sammenlignet med data fra normal knoglemarv prøver skal betragtes som vejledende i patologi. Den store begrænsning er den højere variabilitet mellem de data, der opnås ved hjælp af monoklonale antistoffer fremstillet med metoder baseret på hybridom teknologier og i øjeblikket anvendes i kliniske diagnose. Fastsættes kriterier for teknisk validering af de data, der er erhvervet kan hjælpe med at forbedre nytten af MFC til MDS diagnostik. Opstillingen af disse kriterier kræver analyse mod en database. Reduktion af investigator subjektivitet i dataanalyse er en vigtig fordel ved denne metode.

Introduction

I mangel af fænotypiske markører specifikke til de Dysplastiske forandringer i myeloide celler under MDS indledningen og progression, er en ny tilgang blevet foreslået i de seneste år baseret på en evaluering af modning veje (ændret udtryk for myeloid antigener under produktionen af modne myeloide celler) eller af unormale fordelingen af forskellige celletyper i knoglemarven (BM) celle rum^1,2.

Denne artikel præsenterer en ny metode for standardiseret anvendelse af MFC for at afsløre Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler rum relateret til myelodysplastisk syndrom (MDS) eller andre myeloide hematological sygdomme. Denne undersøgelse viser også nytten af benytter modning databaser for MFC dataanalyse.

Standardisering af eksempelprocedure forberedelse, dataopsamling og analyse ved hjælp af databaserne, der ville tillade identifikation af de mest relevante fænotypisk abnormiteter relateret til Dysplastiske forandringer i BM myeloide celler. Derfor, statistisk valgte delmængder baseret på godt mærket og velkendt formater (automatiske befolkning Separator (APS) diagrammer, histogrammer og dot parceller) er påkrævet for at udvikle en analyse-strategi, der kan bruges i efterfølgende analyse runder. Opdagelsen af robust fænotypisk abnormiteter i MDS ville lette diagnosen i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og uden cytogenetisk aberrancies. Identifikation af diskriminerende parametre giver mulighed for reduktion af immunophenotypic paneler kan forenkle de nuværende score², tillader deres anvendelighed i klinisk patologi laboratorier.

Denne metode begrænser de subjektive fortolkninger af flowcytometri data, som har været signaleret i MDS diagnose³. Dette trin er en forudsætning for udviklingen af automatiserede værktøjer til behandling og analyse af flow data⁴.

MDS består af en heterogen gruppe af klonede hæmatopoietisk stamcelle (HSC) lidelser som spliceosome mutationer i samarbejde med specifikke epigenetiske modifikatorer at give MDS fænotype. Det er nu kendt, at sammen med HSC mutationer, andre mekanismer er involveret i MDS Patofysiologi, som afvigende immun-medieret betændelse og interaktioner mellem maligne HSCs og de stromale mikromiljø af BM. Disse mekanismer er dog stadig dårligt forstået. Bredt klinisk og biologiske heterogenitet af MDS gør diagnose og valg af den optimale behandling en udfordring. I det sidste årti, har flere undersøgelser vist, at MFC er ofte mere følsomme til at opdage dysplasi² end morfologi, men tekniske og økonomiske begrænsninger gør denne teknik vanskeligt at standardisere, med resultater ofte afhængig af oplevelse af tolk³. Det er desuden uklart, hvordan MFC kan tippe balancen mod MDS i tilfælde med eller uden minimal morfologiske dysplasi og i mangel af cytogenetiske anomalier, eller i grænsetilfælde som hypocellular MDS, med en lav blast tælle, fra andre ikke-klonede BM lidelser såsom knoglemarv svigt (dvs., Aplastisk anæmi). Det er også fortsat vanskeligt at skelne grænsetilfælde af MDS med et overskud af Blaster fra akut myeloid leukæmi (AML). Af alle disse grunde integrerer de kliniske retningslinjer ikke MFC test i MDS endelige diagnose. I 2011 anbefalede den amerikanske nationale omfattende Cancer Network (NCCN) MFC til at anslå procentdelen af CD34 + celler, påvisning af paroxysmal natlige hemoglobinuria kloner, og tilstedeværelsen af cytotoksiske T-celler kloner i hypocellular MDS⁵. Disse to sidstnævnte situationer også indebære en terapeutiske mål for kliniske data har vist en god respons på disse patienter til immunsupprimerende behandling⁶. 2017 NCCN retningslinjer, med henvisning til de internationale arbejder gruppen (Kuwait) anbefalinger, opført afvigende Immunofænotypning påvisning af MFC blandt fælles kriterier for MDS diagnose, men uden at gøre nogen specifikationer⁶. Desuden, fastsætter den nyligt offentliggjorte WHO klassifikationen at MFC resultater alene ikke er tilstrækkelig til at fastslå en primære diagnose af MDS i mangel af afgørende morfologiske og/eller cytogenetisk data⁷. MFC kan dog bruges som en ekstra test viser dysregulering af myeloide celle modning mønstre og kvantificere "distance fra normal" for en patient på et bestemt tidspunkt i kurset sygdom.

Denne metode finder anvendelse på kliniske laboratorier interesseret i evalueringen af dysplasi i BM myeloide celler ved hjælp af MFC Immunofænotypning, for at finpudse diagnose i MDS eller andre myeloide sygdomme med dysplastiske abnormiteter.

Protocol

Den protokol, der er anført nedenfor er blevet godkendt af den "Comité de Protection des Personnes" (uafhængige etiske komité) Sud-Est 1 fra University Hospital i Saint-Étienne i Frankrig.

1. forskellige indstillinger

Bemærk: Indstillingerne for forskellige blev udført efter Frankrig Flow anbefalinger, efter EuroFlow Procedure "EuroFlow Standard Operating protokol (SOP) for Instrument Setup og kompensation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Månedlige instrument setup
   1. Slå forskellige. Sikre, at alle væskestande passende og åbne Diva 6.1.3. Udføre fluidics start: i menulinjen, skal du vælge ' forskellige | Fluidics Startup'. Klik på 'OK' når du bliver spurgt. Giver mulighed for forskellige til at varme op til mindst 30 min.
   2. Ydeevne check - CST perler
      Bemærk: For dette trin, forberede 12 75 mm polystyren tube, CST perler og kappe væske (Se Tabel af materialer).
      1. Mærke en 12 x 75 mm² polystyren tube 'CST'. Bland den medfølgende perle hætteglas af blid inversion eller meget blid vortexing. Tilføje til mærket røret: 0,35 mL kappe væske og 1 dråbe af CST perler. Vortex røret forsigtigt og gå videre til erhvervelse. Gemme rør i op til 8 timer ved 2-25 ° C i mørke, hvis ikke erhverve straks.
      2. Udføre performance check: i menulinjen, skal du vælge ' forskellige | CST'.
      3. I 'Setup' fanen for modulet CST: bekræfte Canto II som standard 4-2 H-2V i konfigurationen og også bekræfte, at en baseline oprettet ved hjælp af den aktuelle masse CST perler findes for denne konfiguration. Hvis en baseline ikke findes, henvise til CST perler IFU. Bekræfte, at denne oprindelig ikke er udløbet: under ' Setup Control', Vælg ' Tjek Performance' fra drop-down menuen.
      4. Check 'Load tube manuelt' og klik 'Kør'. Bekræfte lotnummeret vises. Forsigtigt vortex fortyndet perlerne forberedt ovenfor og når du bliver spurgt, indlæse de fortyndede perler og klik på 'OK'.
      5. Når ydeevne check er færdig, skal du kontrollere, at forskellige ydeevne bestået. Klik på 'View Report'. Kør igen ydeevne check, hvis resultaterne ikke bestå. Gemme rapporten i PDF-format med ydeevne sporing rapport dato.
   3. Justere 'Fluorescerende ydelse spændinger' med regnbuen perler (Tabel af materialer).
      Bemærk: Målværdierne, der er fastsat i Euroflow Standard Operating Procedure (SOP), med titlen "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Denne SOP er tilgængelig på Euroflow websted (www.euroflow.org; i det offentlige område; Protokoller fane).
      1. Oprette et nyt eksperiment via ' månedlige Instrument installation dato | Modellen '.
      2. ', vælge de optiske parametre og fluorokromer svarende til de pågældende rør (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500), og kontrollere de ønskede erhvervelse parametre (Log, A, H og / eller W). Anvende aktuelle CST indstillinger (Højreklik på ' forskellige indstillinger ' af eksperimentet). Angiv grænsen for FSC parameter på 10.000.
      3. På forskellige, slå kompensationen fra samtidigt med at nedgang fluorescens ydelse spændinger for Target MFI indstilling; til dette formål, gå i «Skibsinspektør», navigere til fanen 'Kompensation' Deaktiver erstatning af unchecking ' aktiverer erstatning ' valgmulighed.
      4. Oprette en regneark ' Target MFI' med alle nødvendige dot parceller (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammer (n = 8, et histogram for hvert fluorescens detektor) og statistikker, der viser referencen spidsværdier (MFI og CV) for hver kanal, fluorescens.
      5. Fortyndes 1 dråbe af 8-peak regnbuen perler kalibrering partikler i 1 mL destilleret vand og vortex før brug. Erhverve uden at registrere 8-peak regnbuen perler løsning på 'Lav' strømningshastighed. Gemme rør i op til 8 timer ved 2-25 ˚C i mørke, hvis ikke erhverve straks.
      6. Gate singlet perler ' befolkning P1' i FSC versus SSC bivariate dot plot og 8. eller 7th peak i FITC versus PE bivariate dot plot (den lyseste peak eller den næste nedad, som det er fastsat i Euroflow dokumentet med titlen "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") og navngive denne gate befolkning P2.
      7. Fortsætte erhvervelse af 8-toppe Rainbow perle suspension og justere ydelse spændinger i alle fluorescens kanaler til at nå målværdierne MFI ifølge Euroflow dokumentet "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. Når målet MFI værdier for 8 eller 7 toppen er nået, optage Target MFI opnåede og de tilsvarende endelige ydelse værdier. Erhverve 5.000 begivenheder og registrere data.
         Bemærk: At PMT værdier skal bruges under taktfast 1.2.3 (Performance Check - bekræftelse af ydelse værdier med regnbuen perler).
      9. Optage disse værdier gør en print-skærm med regneark ' Target MFI' og instrument indstillinger og gemme som jpg billede.
         Bemærk: Når der oprettes et "Nyt" rør, undertiden ydelse værdier varierer uventet. For dette er en dobbelt kontrol af ydelse afgørende. Sammenlign hver gang ydelse værdier til dine noter, dobbelttjekke at ' Target MFI' og ydelse værdier er korrekte!
      10. Gemme 'Programindstillinger'. I browseren, skal du højreklikke på ' forskellige indstillinger '. Fra drop-down menuen, Vælg "ansøgning indstillinger", og Gem. Klik på 'OK'. Hvis du bliver bedt om det, skal du klikke på Ja for at fastholde tærskelværdierne.
          Bemærk: Gem programindstillingerne ved hjælp af standardnavnet. Omdøb ikke indstillingerne.
   4. Justere 'FCS' og 'SSC spændinger' med mængden vasket blod (LWB).
      Bemærk: For dette trin, 50 µL af perifert blod (PB) prøve fra en sund løsning frivillige, lysing (Tabel af materialer) og vask buffer er nødvendig.
      1. Pipets 50 µL af PB ind i et rør. Der tilsættes 2 mL frisk fortyndet lysing løsning. Bland forsigtigt og inkuberes i 10 min. ved RT.
      2. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g.
      3. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet, forlader ca 50 µL residualvolumen i røret. Bland forsigtigt og der tilsættes 2 mL filtreret vaskeopløsning.
      4. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g.
      5. Gentage en gang mere skridt 1.1.4.3–1.1.4.4.
      6. Tilsæt 250 µL af filtrerede vask buffer og bland forsigtigt.
      7. Opret en ny i forsøget lavet til regnbuen perler erhvervelse, ' model | Nyt regneark ': tegn et bi-parametrisk SSC-A / FSC-en graf.
      8. Erhverve cellerne, gate lymfocytter i en FSC versus SSC bivariate dot plottet og justere FSC og SSC spændinger for at nå de følgende gennemsnitlige målværdier for gated lymfocyt befolkning: FSC: 55.000 (intervallet 50.000-60.000) og SSC: 13.000 (range 11.000 –15,000).
      9. Erhverve og registrere data med omkring 10.000 begivenheder. Kontrollere de gennemsnitlige FSC og SSC målværdierne for gated lymfocytter. Justere FSC og SSC spænding, hvis nødvendigt.
      10. Udskriv skærmbilledet og gemme print af kanal målværdier, der er opnået.
   5. Fluorescens kompensation indstillinger.
      Bemærk: Single-farvede kompensation kontrol skal indstilles efter mål MFI indstillinger og FSC/SSC indstillinger er blevet etableret. For dette trin, en PB fra sunde frivillig, kompensation partikler (Table of Materials), er lysing løsning og vask buffer nødvendige. Liste over fluorokrom-konjugeret antistof reagenser til setup fluorescens kompensation matricer og deres reference populationer er angivet i tabel 1.
      1. Mærke en tube pr. reagens, der skal bruges i opsætning af fluorescens kompensation (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 og APC-H7 - CD71) og en "blank/unstained" rør.
      2. Med pipette overfoeres 50 µL af PB i hver tube eller 1 dråbe af "negative" kompensation partikler + 1 dråbe af "positive" kompensation partikler i kompensation kontrol rør, der er nævnt i tabel 1.
      3. Tilføje passende mængde antistof reagens til røret. Tilføje filtrerede vask buffer for at nå en endelige mængden af 100 µL pr. tube og blandes forsigtigt. Inkuber i 15 min. ved RT, beskyttet mod lys.
      4. Tilsættes 2 mL frisk fortyndet lysing løsning kun i rør med celler og blandes forsigtigt. Der inkuberes i 10 min. ved RT, beskyttet mod lys.
      5. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g.
      6. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet forlader ca 50 µL residualvolumen i hver tube. Bland forsigtigt. Der tilsættes 2 mL filtreret vask buffer.
      7. Der centrifugeres 5 min på 540 x g.
      8. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet forlader ca 50 µL residualvolumen i hver tube. Tilføje filtrerede vask buffer for at nå en endelige mængden af 250 µL pr. tube og blandes forsigtigt.
      9. Oprette kompensation kontrolelementer.
         1. Fra menulinjen, skal du vælge eksperiment skabt til regnbuen perler erhvervelse. Opret en ny ' model | Kompensationsopsætning | Oprette kompensation kontrol.
         2. I den fremkomne dialogboks, skal du vælge afkrydsningsfeltet ' Medtag separate unstained kontrol tube/godt ' . Oprette generiske (ikke etiket-specifik) kompensation kontrolelementer for FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Oprette etiket-specifik kompensation kontrolelementer for PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 og APC-H7 - CD71. Klik på 'OK'.
         3. I et nyt regneark, oprette en bi-parametrisk SSC-A / FSC-en graf og tegne en gate på lymfocytter (P1) og histogrammet svarende til den fluorokrom, der vil blive fundet i hver tube og tegne en P2 gate for den positive peak. Få vist hierarkiet (Højreklik på en graf og vælg "Vis befolkningen hierarki") for at visualisere antallet af begivenheder i P2, undtagen Unstained kontrol tube.
         4. Udvid kompensation kontrol prøveeksemplar i browseren.
         5. Vortex unstained cellerne, forberedt ovenfor, på 3 – 5 s. Installer de forberedte unstained celler på forskellige. Justere flow til at 'Medium' og klik på ' erhverve Data'. I FSC-A vs SSC-A dot plot, justere P1 gate til at fuldt ud omfatte lymfocyt befolkning. Højreklik på P1 gate. Vælg 'Anvend på alle kompensation kontrol'.
         6. Fra 'Køb' Dashboard, skal du klikke på 'postdataene ' at erhverve 5.000 begivenheder. Til alle cellerne, ensfarvet farves kontrol, kontrollere, at P2 interval gate omfatter befolkningens positive.
         7. For PE-Cy7 og APCH7 rør, tilføje en P3 interval gate til histogrammet og sikre, at det omfatter befolkningens negative, og at P2 omfatter befolkningens positive.
         8. Beregning af kompensationen. Fra menulinjen, skal du vælge ' eksperiment | Kompensationsopsætning | Beregning af kompensationen '. Navngiv kompensationsmatrix: 'Kompensationer dato'. Vælg 'Link og gemme'.
         9. Gem kompensationsmatrix i kataloget Programindstillinger: Klik på 'forskellige indstillingerne | Programindstillinger | Gemme ', Navngiv kompensationsmatrix 'Kompensation dato' og klik på 'OK'.
         10. I browseren, klik på ' forskellige indstillinger '. I infovinduet, navigere til fanen 'Kompensation' Klik på Udskriv i nederste højre hjørne.
             Bemærk: Denne oplysninger kan også hentes fra kataloget.
         11. Kontrol af matrixen kompensation.
             1. Bland i et rør alle de indre farvede tube (APCH7 valg).
             2. Oprette et nyt eksperiment ved navn 'Kompensation verifikation dato', tilføje nye modellen, klik på højre af ' forskellige indstillinger ' i dette eksperiment og vælge ' Link | Fjerne sammenkædningen | Application Setting' gemte i trin 1.1.3.10. Erhverve 50.000 begivenheder fra dette rør med de nye indstillinger.
             3. Anvende en ny Global regneark. Oprette 1 dot plot FSC-Andersen/SSC og tegner en gate til at visualisere lymfocytter og n x (n-1) / 2 andre parceller fokuseret på lymfocytter gate til at visualisere to af to parametre.
2. Daglige Instrument setup
   1. Slå forskellige. Sikre, at alle væskestande passende og åbne Diva 6.1.3. Udføre fluidics start: i menulinjen, skal du vælge ' forskellige | Fluidics Startup'. Klik på 'OK' når du bliver spurgt. Giver mulighed for forskellige til at varme op til mindst 30 min.
   2. Ydeevne Check - CST perler: Gentag trin 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Ydeevne Check - bekræftelse af ydelse værdier med regnbuen perler.
      1. Mærke en polystyren tube som "Rainbow perler" og kontrollere, at lotnummeret er i brug. Blandes grundigt Rainbow perle hætteglas. Forberede regnbuen perler, tilsættes 1 dråbe af regnbuen perler til 1 mL deioniseret eller destilleret vand. Beskytte mod lys.
         Bemærk: Fortsæt til erhvervelse eller gemme rør ved 2-8 ˚C indtil erhvervelse.
      2. Oprette et nyt eksperiment: ' Rainbow perler dato '.
      3. Link til kompensationer: Højreklik på ' forskellige indstillinger ', Vælg ' Link Setup', vælge den passende kompensationsmatrix har oprettet i trin 1.1.5.9.9 og vælg "Overskriv".
      4. Fjerne sammenkædningen kompensation: Højreklik på ' forskellige indstillinger ', Vælg 'Fjern sammenkædning fra opsætningen af tidligere sammenkædede' og klik på 'OK'.
      5. Anvende "ansøgning indstillinger": Højreklik på ' forskellige indstillinger ', Vælg "ansøgning indstillinger", gælder indstillingen skabt taktfast 1.1.3.10 under den månedlige Setup og vælge 'holde kompensation værdi '.
      6. Fjern markeringen 'Aktiver kompensation'.
      7. Oprette en ny model i eksperimentet med regnearksskabelon for regnbuen perler. Erhverve røret i 'Lav' erhvervelse.
      8. Under perler erhvervelse, justere P1 gate til at omfatte kun singlet perle befolkning. Justere P2 gate på FITC-A / PE-A dot plot til at omfatte kun singlet perle befolkning. Optage 10.000 begivenheder.
      9. Kontroller, at MFI og CV værdier opnået for P2 befolkning i de foruddefinerede mål i protokollen. Ellers vaske forskellige og starte handlingen igen. Gemme rapporten som PDF format.

2. BM prøveforberedelse

Bemærk: Udføre cellen vask protokollen lige før proceduren farvning.

1. Der afpipetteres 600 µL af primære prøve i en 15 mL centrifugeglas.
2. Der tilsættes 10 mL af vask buffer (PBS + 0,5% BSA [> 98% ren BSA] + 0,09% NaN₃ filtreret løsning, pH 7,4). Bland cellesuspension godt ved hjælp af en pipette.
3. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g (vask 1). Supernatanten uden at forstyrre den celle pellet.
4. Gentag trin 2.2 – 2.3 (vask 2).
5. Suspendere celle pellet i 400 µL af vask buffer.
6. Farvning af rygraden markører. Overføre hele mængden af rygraden antistoffer til en polypropylen tube til FACS analyse, identificeret med den patientdata og "rygraden". Tilføje 350 µL af vasket prøve (volumen af vasket prøven kræves for at udfylde alle rør på panelet). Bland godt med en pipette.
   Bemærk: Beregne det samlede rumfang af rygraden antistoffer for overflade membran farvning (som vist i tabel 2).
7. Afpipetteres lige store mængder af prøven-rygraden mix i 3 polypropylen rør til FACS analyse, identificeret med patientdata og "tube nummer 1" til "tube nummer 3". Hvis det er nødvendigt, bruge vask buffer til at nå en endelige mængden af 200 µL pr. rør.
   Advarsel: Pas på ikke at efterlade nogen spor af prøven på væggene i rør; disse celler vil ellers ikke være plettet. Hvis det er nødvendigt, vortex celler og centrifugeres røret.
8. I hvert rør, tilføje den passende mængde af antistoffer rettet mod celle overflade markører (undtagen rygraden markører), som angivet i tabel 2. Bland godt med en pipette. Inkuber i 30 min. ved RT beskyttet mod lys.
9. Der tilsættes 2 mL lysing løsning. Bland godt med en pipette. Der inkuberes i 10 min. ved RT beskyttet mod lys.
10. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g. Supernatanten uden at forstyrre den celle pellet, forlader ca 50 µL residualvolumen i hver tube. Bland godt med en pipette.
11. Der tilsættes 2 mL vask buffer til celle pellet. Bland godt med en pipette.
12. Gentag trin 2.10 – 2.11 (vask 2).
13. Der centrifugeres i 5 min. ved 540 x g. Supernatanten uden at forstyrre den celle pellet og genopslæmmes celle pellet i 200 µL af PBS. Bland godt med en pipette.
14. Erhverve celler, helst umiddelbart efter farvning eller opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys, for ikke mere end 1 h indtil målt i flow Flowcytometret.

3. dataindsamling

1. Åbn et nyt eksperiment i Diva software og omdøbe det efter navn, type prøve og dato.
2. Oprette en ny model der indeholder 3 rør. Angiv i layoutet eksperiment antistoffer bruges i hver tube.
3. Klik på højre på ' forskellige indstillinger ', Vælg ' programindstillinger ' og anvende de værdier, der er opnået i månedlige Setup (trin 1.1.3.10).
4. Åbn en ny Global regneark og oprette dot parceller: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Opret en gate for at vælge singlet celler i handlingen SSC-Andersen/FSC dot. SSC-A/CD45-BV500-A dot plot, oprette gates for at vælge 4 populationer: granulocytter, monocytter, eksplosioner og lymfocytter. Projekt disse populationer i dot parceller oprettet tidligere.
5. Opret en ny Global regneark for kompensation kontrol, som beskrevet i trin 1.1.5.9.11.3.
6. Erhverve røret i 'MEDIUM' erhvervelse og post 500.000 begivenheder/tube. Efter teknisk validering (evaluering af kompensation og ordentlig farvning), skal du eksportere dataene som FCS3.0 filer.

4. dataanalyse

Bemærk: for at konstruere de normale BM databaser var anvendte filer fra raske donorer og fra personer uden nogen beviser for en hæmatopoietisk sygdom som følger 11 fra 18 filer til Neutrophils_NM database, 10 fra 18 filer for Monocytes_NM database og 14 fra 18 filer til NRC_NM database. Filerne kasseret viste diverse tekniske problemer, som præsenteret i afsnittet repræsentant resultater. Filerne blev individuelt analyseret ved hjælp af Infinicyt software (Table of Materials), der svarer til de forskellige strategier, der er afbildet i figur 1A(1-3) for neutrofile afstamning (profil Neutrophils_Maturation.inp), figur 2 A for monocyt lineage (profil Monocytes_Maturation.inp), og figur 3A(1-2) for erythroid celle lineage (profil NRC_Maturation.inp).

1. Strategi analyse for neutrofiler -Neutrophils_NM database konstruktion 
   1. Identificere CD34 + neutrofile-begået eksplosioner ved hjælp af et kryds af syv porte, tillader valg af CD34 + CD117 + HLADR + lav CD10 - CD13 + CD11b-hændelser (figur 1A.1). Tildeler fanen 'Neutrofile' i hierarkitræet befolkning disse begivenheder og derefter fjerne markeringen denne fane for at fjerne disse celler (afbildet i blå) fra visning af de resterende begivenheder (grå).
   2. Isolere CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lav neutrofile prækursorer ved hjælp af et kryds af seks porte, som afbilledet i figur 1,2 og tildele dem til fanen 'Neutrofile' .
   3. Identificere mere modne neutrofiler ved hjælp af et kryds med fire låger, giver mulighed for forskelsbehandling af CD45dim SSCint-hi CD117-HLADR-celler og deres tildeling til fanen 'Neutrofile' .
   4. Uncheck de resterende begivenheder, holder kun neutrofiler synlige, derefter eksportere denne befolkning ved at klikke på ' filer | Eksportere ' og kontrollere, at alle de nødvendige parametre kontrolleres og gemme dataene som FCS filer.
   5. I en fusionerede fil bestående af alle eksporterede FCS filer, skal du udføre en kvalitetskontrol ved at vurdere intensiteten af udtryk markører for hver af de delpopulationer. Ved hjælp af APS parceller med medianerne for hver fil og SD kurver for hver af de delpopulationer vist, fjerne tilfælde uden for 2SD kurver (Se detaljer i afsnittet repræsentant resultater) (figur 1B).
   6. I den resulterende sammensat fil med "Neutrofiler" synlig, tegne modning Pathway på et APS-diagram (figur 1C venstre) og gemme som en .cyt.
      Bemærk: En sammenligning modning Diagram giver mulighed for visualisering af alle parametre fra alle filer inkluderet i Neutrophils_NM database repræsenteret mod den normaliserede database. Diagrammet præsenteret i figur 2C, højre side, viser, at alle filer inkluderet i Neutrophils_NM-databasen (n = 11) passer i 2 SD sammenlignet med medianen af gruppen.
2. Strategi analyse for monocytter - Monocytes_NM database konstruktion
   1. Identificere monocytic slægt celler (CD117 +/-CD64 + Hej HLADR + Hej) ved hjælp af et kryds af fire porte (fig. 2A). Tildel fanen 'Monocytic' i hierarkitræet befolkning disse begivenheder.
   2. Uncheck de resterende begivenheder, holder kun de monocytic celler synlige, derefter eksportere denne befolkning ved at klikke på ' filer | Eksportere ' og kontrollere, at alle de nødvendige parametre kontrolleres og gemme dataene som FCS filer.
   3. I en fusionerede fil bestående af alle eksporterede FCS filer, udføre en kvalitetskontrol ved at vurdere intensiteten af udtryk markører for hver af de delpopulationer, derefter fjerne tilfælde uden for 2SD kurver (detaljer i repræsentative resultater sektion) (figur 2 B).
   4. I den resulterende fil med "Monocytic" celler synlige, tegne modning Pathway på APS-diagram (fig. 2C venstre) og gemme det som en .cyt.
      Bemærk: En sammenligning modning Diagram giver mulighed for visualisering af alle parametre fra alle filer inkluderet i Monocytes_NM database repræsenteret mod den normaliserede database. Diagrammet præsenteret i figur 2C, højre side, viser, at alle filer inkluderet i Monocytes_NM-databasen (n = 10) passer i 2 SD sammenlignet med medianværdien af en gruppe.
3. Strategi analyse for nukleeret røde blodlegemer (referencecentre) - NRC_NM database konstruktion
   1. Identificere erythroid begået eksplosionerne CD34 + ved hjælp af et kryds af syv gates, der tillader udvælgelse af CD34 + CD117 + HLADR + lav CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + begivenheder (figur 3a.1). Tildeler fanen "NRC" i hierarkitræet befolkning disse begivenheder og derefter fjerne markeringen denne fane for at fjerne disse celler (afbildet i røde) fra visning af de resterende begivenheder (grå).
   2. Identificere mere modne referencecentre ved hjælp af et kryds af fire gates, der tillader diskrimination af CD45-/ + dim SSClow CD36 + Hej CD71 + Hej CD105 +/-celler. Tildele disse begivenheder til fanen "NRC" (figur 32). Blodpladerne (CD36 + Hej SSClow celler) skal fjernes fra NRC befolkning (figur 32).
   3. Uncheck de resterende begivenheder, holder kun NRC celler synlige, derefter eksportere denne befolkning ved at klikke på ' filer | Eksportere ' og kontrollere, at alle de nødvendige parametre kontrolleres og gemme dataene som FCS filer.
   4. I en fusionerede fil bestående af alle eksporterede FCS filer, udføre en kvalitetskontrol ved at vurdere intensiteten af udtryk markører for hver af de delpopulationer, efterfulgt af fjernelse af sager uden for 2SD kurver (Se detaljer i repræsentative resultater sektion) ( Figur 3 B).
   5. I den resulterende fil med "NRC" celler synlige, tegne modning Pathway APS diagrammet (figur 3C, venstre) og gemme det som en .cyt.
      Bemærk: En sammenligning modning Diagram giver mulighed for visualisering af alle parametre fra alle filer inkluderet i NRC_NM database repræsenteret mod den normaliserede database. Diagrammet præsenteret i figur 3C, højre side, viser, at alle filer inkluderet i NRC_NM-databasen (n = 14) passer i 2 SD sammenlignet med medianen af gruppen.
4. Evaluering af modning i BM myeloide rum ved hjælp af modning databaser
   1. Åbn filen .cyt svarende til interesse slægt (i.e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt for neutrofile afstamning, Monocytes_NM_GMFF.cyt for monocytic afstamning, og NRCs_NM_GMFF.cyt for erythroid afstamning).
   2. Højreklik på "Modning" fanen nedenfor fanen svarende til lineage af interesse (' neutrofile | Monocytic | NRC'), og Gem databasen modning til modning.
   3. Åbn en ny FCS-fil og udføre analyse som forklaret tidligere (trin 4.1.1–4.1.3 for neutrofiler, skridt 4.2.1 for Monocytic celler, og trin 4.3.1–4.3.2 til NRC).
   4. Tegne modning vej for befolkningens interesse.
   5. Åbn de tilsvarende database under fanen 'Værktøjer' (Database analyse) og sammenligne befolkning skal analyseres med den tilsvarende modning Database. Kontrollere dataene for kompatibilitet med de tilgængelige database: komplet kompatibilitet (grøn trekant); delvis kompatibilitet, i de fleste tilfælde uoverensstemmelser i parametre (gul trekant); og uforenelighed (rød trekant).
   6. Hvis dataene er kompatible eller delvis compatibles, skaber softwaren ' normaliseret modning forskelle ' diagram. For at visualisere ' Parameter Band modning forskelle ', åbner et nyt diagram i 'Diagram' fanen, klik på "Modning" og vælge hvor mange parametre, der skal vises, klik på vises 'OK' og diagrammet. Med Højreklik i diagrammet; ændringer kan foretages i datavisualisering, Database visualisering og modning Diagram visualisering.
   7. For at visualisere betydningen af forskellene mellem den nye fil og data, der indgår i databasen, konfigurere en zoom (Højreklik på ' normaliseret modning forskelle ' og anvende 'Zoom').

Representative Results

54 BM prøverne høstet i K-EDTA antikoagulans indgik i undersøgelsen. MFC data blev analyseret i mangel af oplysninger om patienterne. Retrospektiv undersøgelse viste, at BM stikprøverne var fra 7 raske donorer (5 hanner og 2 hunner med en median alder af 47.4 [35-48], 11 personer med ingen tegn på en hæmatopoietisk sygdom (8 hanner og 3 hunner med en median alder af 57,9 [35-72]) og 36 tilfælde med forskellige patologiske betingelser: 1 kasse med anæmi og lavt kreatinin niveau, 3 tilfælde med anæmi og høj kreatinin niveau, 8 tilfælde med anæmi af betændelse, 1 kasse med anæmi, der forårsaget af vitamin B₁₂ vitaminmangel, 4 sager med anæmi ± andre cytopenier forårsaget af leverskader, 3 tilfælde med autoimmun hæmolytisk anæmi, 5 tilfælde med idiopatisk thrombocytopenisk purpura, 1 kasse med makrofag aktivering syndrom, 3 tilfælde med komplet remission efter lymfom behandling (minimal residual sygdom < 0,01%) og 7 tilfælde transporterer hematological lidelser (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytic leukæmi og 1 myeloproliferative syndrom JAK2 positiv). Denne sidste kategori inkluderet 18 mænd og 18 kvinder med en gennemsnitlig alder 60,3 [17-100]. Alle prøver blev fra kaukasiske individer. Bygning databaser tilladt at identificere og fastsættelse af flere spørgsmål relateret til forberedelse af prøver og erhvervelse. I vores tilfælde omfattede de endelige databaser 11/18 filer til neutrofile modning, 10/18 filer til monocyt modning og 14/18 filer til NRC modning. De filer, der ikke var medtaget i databaser stillet forskellige tekniske problemer. De mest almindelige farvning problemer blev observeret for CD11b og CD13 i neutrofile, CD300e og HLADR i monocytter, og CD71 og HLADR i referencecentre. eksport af data kan være en kilde til fejl; den hyppigste i vores datasæt var manglen på FSC-H i eksporterede filer og omvendinger af FSC-W med FSC-Hansen, der undertiden opstår i eksporterende DIVA filer⁸. Evaluering af nye tilfælde af cytopenier mistænkes for at være MDS mod myeloide Normal modning databaser giver mulighed for identificering af unormale udtryk for modning antigener af neutrofile afstamning (figur 4), monocytter (figur 5 ), og NRC (figur 6) også i tilfælde uden cytologiske eller cytogenetiske abnormiteter (figur 7). Ellers ville bruger rutinemæssig erhvervelse software, såsom Diva, disse være vanskeligt eller umuligt at indse.

Figur 4 : Repræsentant flow flowcytometri analyse af neutrofiler i en del(7) MDS sag. (A) i de normaliserede modning forskelle diagram, det grå område svarer til den normale udtryk for antigener som følge af analysen af de 11 normale filer inkluderet i den neutrofile database (median± 2SD). De unormale udtryk for flere antigener blev observeret sammenlignet del(7) MDS sag mod Neutrophils_NM database (n = 1 versus n = 11 normal kontrol prøver). (B) Parameter Band modning diagrammer tillade sammenligninger mellem median intensiteten af udtryk for hver markør på forskellige stadier af modning (kontinuerlig fuld linjer) og 2SD kurver beregnet for de 11 normale BM tilfælde medtaget i databasen (kontinuerlig stiplede linjer). Fænotypisk abnormiteter af neutrofiler observeret i del(7) MDS tilfælde forhold neutrofile Normal modning databasen er som følger: samlede øget udtryk af CD34, svag stigning af CD11b udtryk på umodne neutrofile (trin 2), formindsket udtryk for CD13 på umodne neutrofile (fase 1-3) og svag stigning af CD16 udtryk på de to første faser af neutrofile modning efterfulgt af moderate stigninger af CD16 udtryk på de modne neutrofile (trin 4-5). (C) viser de tilsvarende dot afbilder som visualiseret i DIVA software. Billede evalueringen ved hjælp af DIVA software giver mulighed for identifikation af et lille antal fænotypisk abnormiteter i sagen MDS: en større procentdel af CD34 + CD13 + prækursorer og downregulation af CD13 udtryk. Udtrykket unormale CD16 er vanskeligt at observere i denne type af repræsentation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Repræsentant flow flowcytometri analyse af monocytter i en del(7) MDS sag. (A) normaliseret modning forskelle diagram tilbyder en samlet visning af antigen udtryk på forskellige stadier af monocytic celle lineage modning. Det grå område svarer til den normale udtryk for antigener som følge af analysen af 10 normale filer inkluderet i monocytic-databasen (median ± 2SD). De unormale udtryk for flere antigener overstiger 2SD, men for nogle markører, såsom CD35 og HLADR, det overstiger 4SD. (B) i the Parameter Band modning diagrammer, de fænotypisk abnormiteter af monocytic celler observeret i en SMD del(7) sag når sammenlignet med monocyt Normal modning Database (n = 1 versus n = 10 normal kontrol prøver) er som følger: formindsket udtryk for CD45 under trin 1-4 af monocytic celler, i CD117 på trin 1-2 af monocytic prækursorer og HLA-DR samlet. Den øgede udtryk for CD35 i de første 3 faser af modningen af de monocytic celler var den mest betydningsfulde abnormitet for denne slægt. (C) den DIVA dot parceller, der tillader evaluering af monocytic celler i en enkelt normal BM. (D) den DIVA dot parceller, der giver mulighed for evaluering af monocytic celler i del(7) MDS sag. Billede evalueringen ved hjælp af DIVA software giver mulighed for identifikation af to fænotypisk abnormiteter i sagen MDS: formindsket udtryk for HLA-DR og øget udtryk for CD35 i en del af monocytic prækursorer (rød befolkning). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 : Repræsentant flow flowcytometri analyse af nukleeret røde celler i en del(7) MDS sag. (A) normaliseret modning forskelle diagram tilbyder en samlet visning af antigen udtryk på forskellige stadier af NRC lineage modning. Det grå område svarer til den normale udtryk for antigener som følge af analysen af de 14 normal filer inkluderet i NRC Normal modning Database (median ± 2SD). De unormale udtryk for flere antigener overstiger 2SD, men for nogle markører, såsom CD34, CD117, CD71 og CD105, det overstiger 4SD. (B) i the Parameter Band modning diagrammer, fænotypisk abnormiteter observeret i SMD del(7) fald sammenlignet med NRC Normal modning Database (n = 1 versus n = 14 normal kontrol prøver) er som følger: formindsket udtryk af CD34 i de to første faser af modning, CD117, CD105, CD71 og HLA-DR på stage 1 af erythroid afstamning prækursorer. Billede evalueringen ved hjælp af DIVA software giver mulighed for identificering af CD71 unormal udtryk på erythroid celler i sagen MDS, men andre ændringer er ikke kan påvises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7 : Repræsentant flow flowcytometri analyse af neutrofiler, monocytter og de nationale referencecentre i et tidligt tidspunkt MDS sag uden morfologiske dysplasi og cytogenetiske aberrancies. (A) fordeling af umodne og modne celler inden for forskellige modning faser for de tre myeloide lineages: neutrofiler, monocytter og de nationale referencecentre. Et stigende antal modne monocytter (trin 5) og lidt formindskelse af monocytic umodne celler (fase 2 af modning) blev observeret. (B) de normaliserede modning forskelle diagram viser, at de fænotypiske abnormiteter overstiger 2SD, men for CD34, CD117, CD11b, CD16 og HLADR, de er højere på 4SD. fænotypisk abnormiteter observeret for neutrofile er som følger: lidt øget SSC værdier i neutrofile umodne forstadier (fase 1), formindskelse af udtryk af CD34 (fase 1), af CD117 (fase 1), af CD16 (fase 1 - 2) og af HLADR (fase 1-3 af modning). Et forøget udtryk af CD11b blev observeret på neutrofile umodne forstadier (fase 1). (C) de normaliserede modning forskelle diagram viser, at de vigtigste fænotypiske abnormiteter observeret for monocytic slægt (over 10SD) er forøget udtryk af CD35 og tidlig erhvervelse af CD300e på den umodne monocytic prækursorer. Andre fænotypisk abnormiteter observeret på den monocytic slægt er som følger: formindskelse af FSC og SSC på mere modne monocytter (trin 3-5) og lille formindskelse af udtryk af CD14 på trin 2-3 i monocytic celler. (D) normaliseret modning forskelle diagram og Parameter Band modning diagrammer viser, at de vigtigste fænotypiske abnormiteter observeret for NRC er: øget udtryk for CD117 (over 10SD) på fase 2-3 i NRC modning, øget udtryk for CD34 (over 5SD) under anden fase af modning af NRC og nedsat udtryk for CD36 på de tidlige erythroid prækursorer (fase 1-3). Desuden, er den videnskabelige Styringskomité på umodne NRC lavere end på de normale modstykker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Derudover fortolkning af betydningen af forskelle mellem antigen udtryk på patologisk indstillinger og normal kolleger giver mulighed for "kvantificering" af disse abnormaliteter, med identifikation af dem, der er diskriminanten for en gruppe af sager. Det kan også gøre det muligt at rangordne dem baseret på betydning med henblik på opfølgning. I denne undersøgelse, var alle 7 tilfælde af hematological lidelser med myeloide dysplasi funktioner (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytic leukæmi og 1 myeloproliferative syndrom JAK2 positive) klassificeret som unormale sammenlignet med NBM databaser. Desuden elimineret evaluering mod Neutrophils_NM database mistanke om myeloide dysplasi i 7 tilfælde med giftige, inflammatoriske, autoimmun hæmolytisk anæmi og anæmi fra kronisk nyresygdom. Evaluering på Monocytes_NM databasen elimineret mistanke om myeloide dysplasi i 4 tilfælde med idiopatisk thrombocytopenisk purpura (ITP), mens evalueringen mod NRC_NM tilladt for differentiering i 3 tilfælde, 2 af inflammatoriske anæmi og 1 af ITP. BM aspirates fra patienter i komplet remission efter lymfom eller solid tumor behandlinger var inden for 2 SD fra medianen af de normale databaser for alle tre slægter, og dermed disse prøver kan være alternativer til sund donor BM prøver.

Figur 1 : Analyse strategier for neutrofile celle slægt. (A) udvælgelse af CD34 + CD117 + HLADR + lav CD10 - CD13 + CD11b-neutrofile stamfaderen blev realiseret ved skæringspunktet mellem syv porte som afbildet i A1. Det næste trin i modning, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lav neutrofile prækursorer blev valgt ved hjælp af et kryds af seks porte, som afbildet i A2. De mere modne neutrofile er endelig identificeret ved hjælp af et kryds af fire gates, der tillader diskrimination af CD45dim SSCint-hi CD117-HLADR-celler (A3). De fleste diskriminanten markører for neutrofile afstamning var CD34, CD117, CD11b og CD16. Sammen med CD13, disse parametre giver mulighed for identifikation af fem delpopulationer: CD34 + stamfaderen (CD34 + CD117 + CD13 +^lav CD11b - CD16-) (mørkeblå); CD34 - CD117 + CD13 +^Hej CD11b-CD16-neutrofile prækursorer (blå); CD34 - CD117 - CD13 +^lav CD11b-CD16-neutrofile (3^rd trin modningsproces, lyseblå); CD34 - CD117 - CD13 +^lav CD11b + CD16 +^lav neutrofile (4^th skridt modningsproces, pink); modne neutrofile (CD34 - CD117 - CD13 +^Hej CD11b +^Hej CD16 +^Hej, violet). Hvert farvet cirkel repræsenterer medianen af en delpopulation for markør af interesse fra én prøve (B). (C) viser homogen fordeling af de testede parametre under neutrofile celle modning sammenlignet med 2 SD af den normale modning database (n = 11). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Analyse strategi for monocytter. Identifikation af monocytic slægt celler (CD117 +/-CD64 + Hej HLADR + Hej) udføres ved hjælp af et kryds af fire porte (A). Den mest diskriminanten markører for monocytic slægt var CD14, CD300e (IREM2), CD35 og HLA-DR. langs med CD117, disse parametre giver mulighed for identifikation af tre delpopulationer: CD34 - CD117 +^lav/ - HLADR +^Hej CD35 - CD14 - CD300e - (rød); CD34 - CD117 - HLADR +^med CD35 +^med CD14 +^med CD300e - (orange); modne monocytter CD34 - CD117 - HLADR +^med CD35 +^Hej CD14 +^Hej CD300e + (grøn) (B). (C) viser homogen fordeling af de testede parametre under monocytic celle modning sammenlignet med 2 SD af den normale modning database (n = 10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Analyse strategier for referencecentre. (A) identifikation af CD34 + erythroid begået eksplosionerne blev realiseret ved hjælp af et kryds af syv gates, der tillader udvælgelse af CD34 + CD117 + erythroid ophav (A1). De mere modne referencecentre er identificeret ved hjælp af et kryds af fem porte (A2). Udelukkelse af trombocytterne (CD36 + Hej SSClow celler) fra NRC befolkning er påkrævet (A2). De fleste diskriminanten markører for erythroid celle afstamning var CD34, CD117, CD71 og CD105. Sammen med CD33, disse parametre giver mulighed for identifikation af tre delpopulationer: CD45 +^lav CD34 + CD117 + HLADR +^med CD71 +^med CD36 +^med CD105 +^Hej (rød); CD34 - CD117 + HLADR +^lav CD71 +^Hej CD36 +^Hej CD105 +^Hej referencecentre (2^nd trin modningsproces, pink); CD34-CD117-HLADR-/ +^lav CD71 +^Hej CD36 +^med CD105 +^lav/-referencecentre (mere modne referencecentre; Sølvlaks) (B). (C) viser homogen fordeling af de testede parametre under NRC modning sammenlignet med 2 SD af den normale modning database (n = 14). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: liste over fluorokrom-konjugeret antistof reagenser setup fluorescens kompensation matricer med deres reference populationer. Venligst klik her for at se en større version af denne tabel.

Tabel 2: Kombination og mængder antistoffer bruges til evaluering af modning af neutrofile, monocytter og erythroid celler i BM.   Venligst klik her for at se en større version af denne tabel.

Supplerende fil 1: Monocytes_Maturation.inp venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Monocytes_NM_GMFF.Cyt   Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Neutrophils_Maturation.INP   Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Neutrophils_NM_GMFF.Cyt   Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: NRC_Maturation.INP   Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: NRC_NM_GMFF.Cyt   Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Kvaliteten af BM aspirat kan indvirke på de endelige resultater. Blodfortynding af BM aspirat kan forvrænge fordelingen af celler i forskellige stadier af modning på grund af fravær af stamfaderen eller prækursorer celler. Sandsynligvis ansætte en bulk lysing metode kan hjælpe i normalisering af BM aspirates for blodfortynding i flow cytometric analyser. Derudover er de kritiske trin for evaluering af BM myeloide dysplasi ved flowcytometri prøve forarbejdning og farvning, dataopsamling og fortolkning^2,3. Stikprøven forarbejdning og farvning bør udføres op til 72 timer efter BM høst. Dataene skal erhverves, helst umiddelbart efter farvning eller opbevare prøver ved 4 ° C, beskyttet mod lys, for ikke mere end 1 h indtil måling i flow Flowcytometret. Den database-styrede fortolkning undgår den subjektive vurdering af BM myeloide celle modning.

Antistof kombinationer og prøveforberedelsen var stort set var i overensstemmelse med EuroFlow procedurer^9,10. Forskellen sammenlignet med panelet EuroFlow var, at alle antistoffer undtagen CD300e blev leveret af BD Bioscience. Flow flowcytometri standardisering gjort det muligt at få data med en høj grad af reproducerbarhed¹¹, men det indebærer at deltage i en gruppe arbejder på standardisering af de pågældende paneler. I vores gruppe forbliver standardisering af VSK et område skal forbedres. Det store spørgsmål om MFC databaser bygning er proceduren farvning. Den oprindelige fordeling af ikke-rygraden antistoffer i FACS rør før du tilføjer de lige store mængder af prøven-rygraden mix undgår at gentage rygraden farvning i tilfælde af eventuelle fejl i fordelingen af andre ikke-rygraden antistoffer. Hertil kommer, for at overvinde farvning problemer der er to muligheder: enten øge inkubationstiden af antistoffer fra 15 til 30 minutter, eller bruge de rekombinante antistoffer, som giver større reproducerbarhed, ifølge producentens specifikationer¹². Analysen blev udført i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte data^13,14,15. Hvad angår monocytter analyse observeret vi ofte mangel af CD34 + CD117 - monocytic prækursorer, som tidligere er rapporteret af Shen et al. ¹⁶. af denne grund vi fjernet fra analyse strategi en supplerende gate til isolation af denne bestemte population. Skæringspunktet mellem porte tillader dyrkning af CD64 + F HLADR + F/int og CD117 +/-omfatter de umodne forstadier (CD117 + CD34 + lav /-) og de mere modne monocytter.

Evaluering af nye FCS filer i forhold til en database bidrager til en mere objektiv, standardiseret analyse og data fortolkning og undgår fejlfortolkninger af de såkaldte mønstre anerkendelse, som er vanskeligt at standardisere³. Kvantificering af amplituden af fænotypisk abnormiteter sammenlignet med normale databaser gør det muligt at rangordne disse abnormiteter, som kan hjælpe med at forbedre MFC noder for MDS diagnose. Desuden, denne metode giver nøjagtige identifikation af de fænotypisk abnormiteter på umodne CD34 + og/eller CD117 + prækursorer og i mere modne celler, som ikke er indlysende, når du bruger de aktuelle analyse strategier i erhvervelse software. Denne metode er relevante i diagnosticering af MDS tilfælde som eller har ikke indlysende morfologiske abnormiteter, eller at gøre eller ikke bære cytogenetisk tilbagevendende aberrancies.

Forbedring af antistoffarvning er nødvendig, og tilføjelsen af nye normale BM data i databaser er nødvendig for at øge robustheden, pålidelighed og følsomhed af analysen. Denne metode kunne anvendes med yderligere undersøgelser, at cytopenier fra andre årsager, eller at klonede bloddannelsen ubestemt potentiale (CHIP), for at identificere de fænotypiske forandringer pålideligt relateret til Dysplastiske processer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain