Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

Summary

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Abstract

Een werkgroep gestart binnen de Franse Cytometry Association (AFC) werd ontwikkeld om het harmoniseren van de toepassing van multiparameter stroom cytometry (MFC) voor myeloïde ziekte diagnose in Frankrijk. Het hier gepresenteerde protocol was overeengekomen en toegepaste tussen September 2013 en November 2015 in zes Franse diagnostische laboratoria (universitaire ziekenhuizen van Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, en Lille en Institut Paoli-Calmettes in Marseille) en de standaardisatie van het beenmerg monster voorbereiding en gegevens overname toegestaan. Drie rijping databases werden ontwikkeld voor neutrofiele, monocytic, en erythroid lineages met beenmerg van "gezonde" donor personen (individuen zonder enig bewijs van een hematopoietische ziekte). Een robuuste analysemethode voor elke myeloïde lineage moet gelden voor routinematige diagnostische gebruik. Nieuwe gevallen kunnen worden op dezelfde manier geanalyseerd en vergeleken met de gebruikelijke databases. Dus, kwantitatieve en kwalitatieve fenotypische afwijkingen kunnen worden geïdentificeerd en personen boven 2SD vergeleken met gegevens van normale beenmerg monsters moeten worden beschouwd als indicatieve van pathologie. De belangrijkste beperking is de hogere variabiliteit tussen de gegevens die zijn bereikt met de monoklonale antilichamen verkregen met de methoden op basis van hybridoma technologieën en momenteel gebruikt in de klinische diagnose. Vaststelling van de criteria voor de technische validering van de verkregen gegevens kan helpen verbeteren van het nut van MFC voor MDS diagnostiek. De vaststelling van deze criteria vereist analyse tegen een database. De vermindering van de onderzoeker subjectiviteit in data-analyse is een belangrijk voordeel van deze methode.

Introduction

Bij gebrek aan fenotypische markeringen specifiek voor de dysplastische veranderingen in myeloïde cellen tijdens de initiatie van de MDS en progressie, is een nieuwe aanpak voorgesteld in de afgelopen jaren op basis van de evaluatie van de rijping trajecten (gewijzigde uitdrukking van myeloïde antigenen tijdens de productie van volwassen myeloïde cellen) of van de abnormale verdeling van de verschillende soorten cellen in het beenmerg (BM) cel compartimenten^1,2.

Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor gestandaardiseerde toepassing van MFC oog op de opsporing van dysplastische veranderingen in BM myeloïde cel compartimenten betrekking hebben op myelodysplastisch syndromen (MDS) of andere myeloïde hematologische ziekten. Deze studie toont ook het nut van het gebruik van rijping databases voor MFC data-analyse.

Standaardisatie van de voorbereiding voorbeeldprocedure, data-acquisitie en analyse met behulp van de databases zou de identificatie van de meest relevante fenotypische afwijkingen die verband houden met dysplastische veranderingen in BM myeloïde cellen. Daarom zijn statistisch geselecteerde deelverzamelingen gebaseerd op goed gelabeld en goed erkende formaten (automatische bevolking scheidingsteken (APS) diagrammen, histogrammen, en dot plots) vereist voor de ontwikkeling van een analyse-strategie die kan worden gebruikt in latere analyse rondes. De ontdekking van robuuste fenotypische afwijkingen in MDS zou verlichten de diagnose in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en zonder cytogenetische aberrancies. Identificatie van discriminerende parameters rekening houdend met de vermindering van de immunophenotypic panelen kan vereenvoudigen de huidige scores², toe te staan hun toepasbaarheid in de laboratoria van de klinische pathologie.

Deze methode beperkt de subjectieve interpretaties van cytometry gegevens, zoals in MDS diagnose³hebben zijn gesignaleerd. Deze stap is een voorwaarde voor de ontwikkeling van de geautomatiseerde hulpmiddelen voor het verwerken en analyseren van stroom gegevens⁴.

MDS bestaat uit een heterogene groep van aandoeningen van de klonen hematopoietische stamcellen (HSC) waarin het spliceosoom mutaties met specifieke epigenetische modifiers werken opleveren van het fenotype van de MDS. Het is nu bekend dat, samen met HSC mutaties, andere mechanismen zijn betrokken bij MDS pathofysiologie, zoals abnormale immuun-gemedieerde ontsteking en interacties tussen kwaadaardige HSCs en de stromale communicatie van de BM. Deze mechanismen blijven echter slecht begrepen. De brede klinische en biologische heterogeniteit van MDS maakt de diagnose en de selectie van de optimale therapie een uitdaging. In het laatste decennium, in meerdere studies hebben aangetoond dat MFC vaak meer is gevoelig voor het opsporen van dysplasie² dan morfologie, maar technische en economische beperkingen deze techniek moeilijk maken om te standaardiseren, met resultaten vaak afhankelijk van de ervaring van de tolk³. Bovendien, is het onduidelijk hoe MFC de balans naar MDS in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en bij gebrek aan cytogenetische afwijkingen of in grensgevallen zoals hypocellular MDS, met een lage blast tellen, kan tip van andere niet-klonen BM stoornissen zoals beenmerg mislukking (dwz., aplastic bloedarmoede). Ook blijft het moeilijk om te onderscheiden grensgevallen van MDS met een overmaat van ontploffingen van acute myeloïde leukemie (AML). Om al deze redenen opnemen de klinische richtsnoeren niet MFC testen in de uiteindelijke diagnose van MDS. In 2011, heeft de Amerikaanse nationale uitgebreide kanker netwerk (NCCN) voor de schatting van het percentage CD34 + cellen, detectie van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie klonen en aanwezigheid van cytotoxische T-cel-klonen in hypocellular MDS⁵MFC aanbevolen. Deze twee laatste gevallen ook betrekking hebben op een therapeutisch doel omdat klinische gegevens hebben aangetoond een goede reactie van deze patiënten op immunosuppressieve therapie⁶. De 2017 NCCN richtsnoeren, onder vermelding van de aanbevelingen van de International Working Group (IWG) vermeld afwijkende immunophenotyping detectie door MFC behoort tot de co criteria voor de diagnose van de MDS, maar zonder eventuele specificaties⁶. Bovendien, bepaalt de onlangs gepubliceerde WHO-indeling dat MFC bevindingen alleen volstaan niet om een primaire diagnose van MDS bij gebrek aan afdoende morfologische en/of cytogenetische gegevens⁷. MFC kan echter worden gebruikt als een aanvullende proef tonen de disregulatie van myeloïde cel rijping patronen en kwantificeren van de "afstand van normale" voor een patiënt op een bepaald tijdstip in de loop van de ziekte.

Deze methode is van toepassing op klinische laboratoria ook geïnteresseerd in de evaluatie van dysplasie in BM myeloïde cellen met behulp van MFC immunophenotyping, ter verfijning van de diagnose in MDS of andere myeloïde aandoeningen met dysplastische afwijkingen.

Protocol

Het onderstaande protocol is goedgekeurd door het "Comité de bescherming des Personnes" (onafhankelijk ethisch comité) Sud-Est 1 from University Hospital van Saint-Etienne, Frankrijk.

1. Cytometer instellingen

Opmerking: De cytometer-instellingen werden uitgevoerd volgens Frankrijk stroom aanbevelingen, EuroFlow procedure "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) voor Instrument Setup en compensatie (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Maandelijkse instrument setup
   1. Inschakelen van de cytometer. Ervoor zorgen dat alle vloeistof niveaus passende en open Diva 6.1.3. Fluidics opstarten: Selecteer in de menubalk, ' Cytometer | Fluidics opstarten '. Klik op 'OK' wanneer daarom wordt gevraagd. Laat de cytometer te warm gedurende ten minste 30 min.
   2. Prestaties controleren - CST kralen
      Opmerking: Deze stap opstellen 12 75 mm polystyreen buis, CST kralen en schede vloeistof (Zie Tabel van materialen).
      1. Label een 12 x 75 mm² polystyreen buis 'CST'. Meng de verstrekte kraal flacon door zachte inversie of zeer zacht vortexing. Toevoegen aan de buis met het label: 0.35 mL vloeistof van de schede en 1 druppel kralen CST. Vortex de tube zachtjes en overgaan tot aankoop. Slaan de buis gedurende maximaal 8 uur bij 2-25 ° C in het donker, als niet onmiddellijk te verwerven.
      2. De controle van prestaties uitvoeren: Selecteer in de menubalk, ' Cytometer | CST'.
      3. In het tabblad 'Setup' van de module CST: de Canto II zoals in de standaardconfiguratie voor de 4-2 H-2V bevestigen en ook bevestigen dat er een basislijn gemaakt met behulp van de huidige veel CST kralen voor deze configuratie bestaat. Als een basislijn niet bestaat, verwijzen naar de CST kralen IFU. Bevestigen dat deze basislijn niet is verlopen: Selecteer onder ' Setup Control', ' Controleer Performance' in het drop-down menu.
      4. Controleer 'Load buis handmatig' en klik op 'Uitvoeren'. Controleer of het lotnummer weergegeven. Zachtjes vortex de verdunde kralen bereid boven en desgevraagd de verdunde kralen laden en klik op 'OK'.
      5. Wanneer de controle van de prestaties voltooid is, controleren of dat de prestaties van de Cytometer doorgegeven. Klik op 'Rapport weergeven'. Opnieuw uitvoeren van de controle van de prestaties als de resultaten niet is geslaagd. Sla het rapport in PDF-formaat met de Tracking verslag voorstellingsdatum.
   3. Aanpassen 'TL bet spanningen' met regenboog kralen (Tabel van materialen).
      Opmerking: De streefwaarden zijn vastgelegd in de Standard Operating Procedure (SOP) van de Euroflow getiteld "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Deze SOP is beschikbaar op Euroflow site (www.euroflow.org; in de openbare ruimte; Tabblad protocollen).
      1. Maak een nieuw experiment via ' maandelijkse Instrument Setup datum | Specimen'.
      2. ', kies de optische parameters en fluorochromes overeenkomt met de betrokken buizen (FITC, PE PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500), en controleer de gewenste overname parameters (Log, A, H en / of W). Huidige CST instellingen (Klik met de rechtermuisknop op ' Cytometer instellingen ' van het Experiment) toe te passen. De drempel voor FSC parameter vastgesteldop 10.000.
      3. De cytometer, de vergoeding uit schakelen tijdens het instellen van fluorescentie bet spanningen voor Target MFI instelling; voor dit doel, ga in het 'Inspecteur', ga naar de tab "Compensatie" Disable compensatie door bestaande "compensatie inschakelen" optie.
      4. Maak een werkblad ' Target MFI' met alle nodige dot percelen (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammen (n = 8; een histogram voor elke fluorescentiedetector) en statistieken tonen de verwijzing piekwaarden (MFI en CV) voor elk kanaal van de fluorescentie.
      5. 1 druppel 8-piek regenboog kralen kalibratie deeltjes in 1 mL gedestilleerd water en vortex vóór gebruik verdund. Verwerven zonder opname van de 8-piek regenboog kralen oplossing bij de 'Lage' debiet. Slaan de buis gedurende maximaal 8 uur bij 2-25 ˚C in het donker, als niet onmiddellijk te verwerven.
      6. Gate singlet kralen ' bevolking P1' met de FSC versus SSC bivariate dot perceel en de 8e of 7e piek in de FITC versus PE bivariate dot perceel (de helderste piek of de volgende dia naar beneden, zoals bepaald in het document van de Euroflow getiteld "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") en de naam van deze poort bevolking P2.
      7. Blijven de verwerving van de 8-peaks Rainbow kraal schorsing en bet spanningen in alle kanalen van de fluorescentie te bereiken van de streefwaarden van de MFI volgens het Euroflow-document "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads" aan te passen.
      8. Zodra doelwit MFI waarden voor de 8ste of 7de piek worden bereikt, nemen de Target MFI bereikt en de bijbehorende resultaatwaarden bet. Verwerven van 5.000 gebeurtenissen en noteer de gegevens.
         Opmerking: Dat bet moet waarden hieronder worden gebruikt in stap 1.2.3 (prestaties controleren - bevestiging van de waarden van de bet met regenboog kralen).
      9. Deze waarden maken van een print screen met werkblad ' Target MFI' en instrument instellingen en opslaan als .jpg afbeelding opnemen.
         Opmerking: Als een "Nieuwe" buis wordt gemaakt, soms de bet waarden verschillen onverwacht. Hiervoor is het van essentieel belang een dubbele controle van bet. Telkens wanneer de bet waarden vergelijken met uw notities, dubbel te controleren dat ' Target MFI' en bet waarden kloppen!
      10. Sla op 'Toepassingsinstellingen'. In de Browser, klik met de rechtermuisknop op ' Cytometer instellingen '. Uit de drop-down menu, selecteer ' toepassingsinstellingen ', en sla. Klik op 'OK'. Klik desgevraagd op Ja als u wilt behouden van de drempelwaarden.
          Opmerking: De instellingen van de toepassing met behulp van de standaardnaam opslaan. De instellingen niet wijzigen.
   4. Pas de 'FCS' en 'SSC spanningen' met lysed gewassen bloed (LWB).
      Opmerking: Voor deze stap, 50 µL van een steekproef van perifeer bloed (PB) uit een gezonde vrijwilligers, lysing oplossing (Tabel van materialen) en wassen buffer nodig zijn.
      1. Pipets 50 µL van PB in een buis. Voeg toe 2 mL vers verdunde lysing oplossing. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 10 min op RT.
      2. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g.
      3. Gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet, ongeveer 50 µL restvolume verlaten in de buis. Meng voorzichtig en voeg 2 mL gefilterde wassen oplossing.
      4. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g.
      5. Herhaal nog een keer de 1.1.4.3–1.1.4.4 stappen.
      6. Voeg 250 µL van gefilterde wassen buffer en meng voorzichtig.
      7. In het Experiment gemaakt voor regenboog kralen verwerving, het maken van een nieuwe ' Specimen | Nieuw werkblad ': een bi-parametrische SSC-A / FSC-A grafiek tekenen.
      8. Verwerven van de cellen, poort van de lymfocyten in een FSC versus SSC bivariate dot plot en aanpassen van FSC en SSC spanningen te bereiken de volgende gemiddelde streefwaarden voor de gated lymfocyten bevolking: FSC: 55.000 (bereik 50.000 – 60.000) en SSC: 13.000 (bereik 11.000 –15,000).
      9. Verwerven en de gegevens met ongeveer 10.000 gebeurtenissen opneemt. Controleer of de gemiddelde FSC en WS-streefwaarden voor gated lymfocyten. FSC en SSC spanning te passen indien nodig.
      10. Scherm afdrukken en opslaan van de afdruk van de streefwaarden van het kanaal die worden verkregen.
   5. Fluorescentie compensatie-instellingen.
      Opmerking: De besturingselementen één gebeitste compensatie moeten worden ingesteld na de Target MFI-instellingen en FSC/SSC instellingen zijn vastgesteld. Voor deze stap, een PB van een gezonde vrijwilliger, compensatie deeltjes (Tabel of Materials), zijn lysing oplossing en wassen van de buffer nodig. De lijst van fluorescerende-geconjugeerde antilichaam reagentia gebruikt om setup van de fluorescentie compensatie matrices en hun bevolkingen verwijzing zijn vermeld in tabel 1.
      1. Één tube per reagens worden gebruikt bij het opzetten van fluorescentie schadevergoeding label (FITC, PE PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 en APC-H7 - CD71) en een "blanco/onbevlekt" buis.
      2. Pipetteer 50 µL van PB in elke buis of 1 druppel van "negatief" compensatie deeltjes + 1 druppel 'positieve' compensatie deeltjes in de compensatie controle buizen hierboven aangegeven in tabel 1.
      3. Juiste hoeveelheid het antilichaam reagens toevoegen aan de buis. Toevoegen van gefilterde wassen buffer om te bereiken een eindvolume van 100 µL per buis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 15 minuten op RT, beschermd tegen licht.
      4. Voeg 2 mL vers verdunde lysing oplossing alleen in de buizen met de cellen en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 10 min op RT, beschermd tegen licht.
      5. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g.
      6. De bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet verlaten ongeveer 50 µL restvolume in elke buis gecombineerd. Meng voorzichtig. Voeg toe 2 mL gefilterde wassen buffer.
      7. 5 min op 540 x gcentrifugeren.
      8. De bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet verlaten ongeveer 50 µL restvolume in elke buis gecombineerd. Toevoegen van gefilterde wassen buffer om te bereiken een eindvolume van 250 µL per buis en meng voorzichtig.
      9. Compensatie besturingselementen maken.
         1. Selecteer in de menubalk, Experiment gemaakt voor regenboog kralen verwerving. Maak een nieuwe ' Specimen | Compensatie Setup | Compensatie besturingselementen maken.
         2. Vink ' Include afzonderlijke onbevlekt schakelaar buis/putje ' in het resulterende dialoogvenster. Generieke (niet de label-specifiek) compensatie besturingselementen maken voor FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Schadevergoeding label-specifieke besturingselementen maken voor PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 en APC-H7 - CD71. Klik op 'OK'.
         3. In een nieuw werkblad, een bi-parametrische SSC-A / FSC-A grafiek maken en tekenen van een hek op lymfocyten (P1) en het histogram overeenkomt met de fluorescerende die zal worden gedetecteerd in elke buis en tekenen van een P2-gate voor de positieve piek. De hiërarchie (Klik met de rechtermuisknop op een grafiek en selecteer ' Toon bevolking hiërarchie ') om te visualiseren het aantal gebeurtenissen in P2, met uitzondering van de buis onbevlekt besturingselement weergeven
         4. Vouw het specimen compensatie besturingselementen in de Browser.
         5. Vortex de onbevlekt cellen, voorbereid boven, 3 – 5 s. installeren bereid onbevlekt cellen in de cytometer. Aanpassen van het debiet aan 'Medium' en klik op ' verwerven Data'. Pas in het FSC-A vs SSC-A dot perceel, de P1 poort volledig omvatten de lymfocyten bevolking. Klik met de rechtermuisknop op de P1-poort. Selecteer 'Toepassen op alle compensatie controle'.
         6. Het 'Verwerving' Dashboard, klik op 'recordgegevens ' te verwerven van 5.000 gebeurtenissen. Controleer voor alle eenkleurige gebeitst controle cellen, of dat de P2 interval poort de positieve bevolking omvat.
         7. Voor de PE-Cy7 en APCH7 buizen, een P3 interval poort toevoegen aan het histogram en ervoor te zorgen dat het de negatieve bevolking omvat, en dat de P2 omvat de positieve bevolking.
         8. Berekenen vergoeding. Selecteer in de menubalk, ' Experiment | Compensatie Setup | Berekenen vergoeding '. Naam van de matrix met compensatie: 'Compensaties datum'. Selecteer 'Link en opslaan'.
         9. De matrix met compensatie in de catalogus applicatie-instellingen opslaan: Klik op 'Cytometer instellingen | Toepassingsinstellingen | Opslaan ', compensatie matrix 'Compensatie datum' een naam en klik op 'OK'.
         10. Klik op ' Cytometer instellingen 'in de Browser. In de inspecteur, ga naar de "Compensatie" tab. Klik op afdrukken in de rechterbenedenhoek.
             Opmerking: Deze informatie kan ook worden opgehaald uit de catalogus.
         11. Controle van de vergoeding-matrix.
             1. Meng in een buis alle de één gebeitst buis (APCH7 van keuze).
             2. Maken van een nieuw Experiment met de naam 'Datum van de controle van de compensatie', het toevoegen van nieuwe Specimen, klikt u op rechts van de ' Cytometer instellingen ' van dit experiment en kiezen ' Link | Ontkoppelen | Toepassingsinstelling ' opgeslagen in de stap 1.1.3.10. Verwerven van 50.000 evenementen van deze buis met de nieuwe instellingen.
             3. Toepassing van een nieuwe globale werkblad. Maak 1 stip perceel FSC-A/SSC-A en tekenen van een hek om te visualiseren de lymfocyten en n x (n-1) / 2 andere percelen gericht op de poort van de lymfocyten te visualiseren twee-aan-twee parameters.
2. Dagelijkse Instrument setup
   1. Inschakelen van de cytometer. Ervoor zorgen dat alle vloeistof niveaus passende en open Diva 6.1.3. Fluidics opstarten: Selecteer in de menubalk, ' Cytometer | Fluidics opstarten '. Klik op 'OK' wanneer daarom wordt gevraagd. Laat de cytometer te warm gedurende ten minste 30 min.
   2. Prestaties controleren - CST kralen: Herhaal de stappen 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Prestaties controleren - bevestiging van bet waarden met regenboog kralen.
      1. Label een polystyreen buis als ' regenboog parels ' en controleer of het lotnummer de is in gebruik. Grondig Meng de regenboog kraal flacon. Bereiden de regenboog kralen, 1 druppel regenboog kralen aan 1 mL gedeïoniseerd of gedestilleerd water toevoegen. Beschermen tegen licht.
         Opmerking: Overgaan tot de verwerving of het bewaren van de buis op 2-8 ˚C tot overname.
      2. Maak een nieuw Experiment: ' regenboog kralen datum '.
      3. Koppelen van de compensaties: Klik met de rechtermuisknop op ' Cytometer instellingen ', selecteer ' Link Setup', de passende vergoeding matrix gemaakt in stap 1.1.5.9.9 selecteren en selecteert u 'Overschrijven'.
      4. Ontkoppelen van compensatie: Klik met de rechtermuisknop op ' Cytometer instellingen ', selecteer 'Ontkoppelen van de eerder gekoppelde setup' en klik op 'OK'.
      5. Toepassing ' toepassingsinstellingen ': Klik met de rechtermuisknop op ' Cytometer instellingen ', selecteer ' toepassingsinstellingen ', gemaakt in stap 1.1.3.10 tijdens de maandelijkse installatie instelling toepassen en selecteer 'houden van de waarde van de vergoeding '.
      6. Schakel het aankruisvak 'Activeer compensatie'.
      7. Maak een nieuwe model in de Experiment met werkbladsjabloon voor regenboog kralen. Het verwerven van de buis in 'LOW' overname.
      8. Pas de P1 poort tot alleen de singlet kraal bevolking tijdens de overname kralen. Pas de P2-poort op het perceel van de FITC-A / PE-A dot te nemen alleen de singlet kraal bevolking. 10.000 gebeurtenissen registreren.
      9. Controleer of de MFI- en de CV-waarden, verkregen voor P2 bevolking in de vooraf gedefinieerde doelstellingen van het protocol. Anders, wassen van de cytometer en de bewerking opnieuw start. Het rapport opslaat als PDF-formaat.

2. BM monstervoorbereiding

Opmerking: De cel wassen protocol net vóór de kleuring procedure uitvoeren

1. Pipetteer 600 µL van primaire monster in een centrifugebuis 15 mL.
2. Voeg vervolgens 10 mL buffer te wassen (PBS + 0,5% BSA [> 98% zuiver BSA] + 0,09% NaN₃ gefilterd oplossing, pH 7.4). Meng de celsuspensie goed met behulp van een precisiepipet.
3. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g (wash 1). Verwijder het supernatant zonder verstoring van de cel-pellet.
4. Herhaal stap 2.2-2.3 (wassen 2).
5. Suspendeer de pellet cel in 400 µL van het wassen van de buffer.
6. -Verkleuring van de markeringen van de ruggengraat. Het gehele volume van de ruggengraat antilichamen overbrengen in een polypropyleen buis FACS p.a., geïdentificeerd met de patiëntgegevens en de "ruggengraat". Voeg 350 µL van gewassen monster (het volume van de gewassen monster moet vullen alle buizen op het paneel). Meng goed met behulp van een precisiepipet.
   Opmerking: Berekening van het totale volume van de ruggengraat antilichamen voor oppervlakte membraan kleuring (zoals weergegeven in tabel 2).
7. Pipeteer gelijke hoeveelheden van de monster-ruggengraat mix in 3 polypropyleen buizen FACS p.a., geïdentificeerd met de patiëntgegevens en "buis nummer 1" naar "buis nummer 3". Indien nodig, gebruik wassen buffer tot een eindvolume van 200 µL per buis.
   Let op: Wees voorzichtig niet te verlaten elk spoor van het monster op de wanden van de buizen; anders, zullen deze cellen niet worden gekleurd. Indien nodig, vortex de cellen en centrifuge de buis.
8. In elke buis, voegt u het juiste volume van antilichamen gericht tegen cel oppervlakte markeringen (met uitzondering van de ruggengraat markeringen), als aangegeven in tabel 2. Meng goed met behulp van een precisiepipet. Incubeer gedurende 30 min op RT beschermd tegen licht.
9. Voeg toe 2 mL lysing oplossing. Meng goed met behulp van een precisiepipet. Incubeer gedurende 10 min op RT beschermd tegen licht.
10. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g. Verwijder het supernatant zonder verstoring van de cel pellet, verlaten ongeveer 50 µL restvolume in elke buis. Meng goed met behulp van een precisiepipet.
11. Voeg toe 2 mL buffer naar de cel pellet te wassen. Meng goed met behulp van een precisiepipet.
12. Herhaal stap 2.10-2.11 (wassen 2).
13. Centrifugeer gedurende 5 min op 540 x g. Verwijder het supernatant zonder verstoring van de cel pellet en resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS. Meng goed met behulp van een precisiepipet.
14. Verwerven van de gewenste cellen, bij voorkeur direct na de kleuring of bewaren bij 4 ° C, beschermd tegen licht, voor niet meer dan 1 h tot gemeten in de cytometer van de stroom.

3. data-acquisitie

1. Open een nieuw Experiment in Diva software en hernoem het volgens de naam, het type van monster en datum.
2. Maak een nieuw model met 3 buizen. De antilichamen die gebruikt in elke buis in de Experiment lay-out opgeven.
3. Klik op rechts op de ' Cytometer instellingen ', kies ' toepassingsinstellingen ' en de waarden die zijn verkregen in maandelijkse Setup (stap 1.1.3.10) van toepassing.
4. Open een nieuwe globale werkblad en maken van de dot percelen: WS-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. In de WS-A/FSC-A dot plot, maken een poort als singlet cellen wilt selecteren. Maak in de WS-A/CD45-BV500-A dot plot, gates Schakel 4 populaties: Granulocyten, monocyten, ontploffingen en lymfocyten. Project deze populaties in de stip percelen eerder hebt gemaakt.
5. Maak een nieuwe globale werkblad voor compensatie controle zoals beschreven in stap 1.1.5.9.11.3.
6. Het verwerven van de buis in 'MEDIUM' verwerving en record 500.000 evenementen/buis. Na technische validatie (evaluatie van de compensatie en de juiste kleuring), door de gegevens te exporteren als FCS3.0-bestanden.

4. de gegevensanalyse

Opmerking: Voor de bouw van de normale BM databases gebruikte bestanden van gezonde donoren en van personen zonder enig bewijs voor een hematopoietische ziekte als volgt werden 11 van 18 bestanden voor de Neutrophils_NM database, 10 uit 18 bestanden voor Monocytes_NM database en 14 van 18 bestanden voor NRC_NM database. De bestanden verwijderd toonde van verschillende technische problemen, zoals beschreven in de sectie vertegenwoordiger resultaten. De bestanden zijn afzonderlijk geanalyseerd met behulp van de Infinicyt software (Tabel of Materials), die voldoen aan de verschillende strategieën afgebeeld in figuur 1A(1-3) voor neutrofiele afkomst (profiel Neutrophils_Maturation.inp), Figuur 2 A voor monocyt afkomst (profiel Monocytes_Maturation.inp), en Figuur 3A(1-2) voor erythroid cel afkomst (profiel NRC_Maturation.inp).

1. Strategie van analyse voor de neutrofiele granulocyten -Neutrophils_NM database bouw 
   1. CD34 + neutrofiele-begaan ontploffing met een doorsnede van zeven poorten, waardoor de selectie van CD34 + CD117 + HLADR + lage CD10 - CD13 + CD11b-evenementen (Figuur 1A.1) te identificeren. Deze gebeurtenissen toewijzen aan het 'Neutrofiele' tabblad in de structuur van de hiërarchie van bevolking en vervolgens uncheck dit tabblad ter opheffing van deze cellen (afgebeeld in het blauw) uit de weergave van de resterende evenementen (grijs).
   2. De CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lage neutrofiele precursoren, met een doorsnede van zes gates zoals afgebeeld in Figuur 1A(2) isoleren en toewijzen aan het 'Neutrofiele' tabblad.
   3. Het identificeren van meer volwassen neutrofiele granulocyten met een doorsnede van vier poorten, waardoor voor de discriminatie van CD45dim SSCint-hi CD117-HLADR-cellen en hun opdracht naar het 'Neutrofiele' tabblad.
   4. Schakel de overige gebeurtenissen, houden alleen de neutrofiele granulocyten zichtbaar, exporteer deze populatie door te klikken op ' bestand | Exporteren ' en verifiëren dat alle vereiste parameters worden gecontroleerd en de prestatiegegevens als FCS bestanden opslaat.
   5. In een samengevoegde bestand dat bestaat uit alle geëxporteerde FCS bestanden, uitgevoerd door een kwaliteitscontrole met een evaluatie van de intensiteit van de expressie van merkers voor elke subpopulatie. Gebruik APS Staanplaatsen met medianen voor elk bestand en SD curven voor elke deelsteekproef zoals getoond, verwijderen de gevallen buiten de 2SD curven (zie details in de sectie vertegenwoordiger resultaten) (Figuur 1B).
   6. In het resulterende bestand samengesteld met "Neutrofielen" zichtbaar, de rijping Pathway tekenen op een APS-diagram (Figuur 1C links) en opslaan als een bestand .cyt.
      Opmerking: Een vergelijking rijping Diagram maakt het mogelijk de visualisatie van alle parameters van alle bestanden die zijn opgenomen in de database van de Neutrophils_NM tegen de genormaliseerde database vertegenwoordigd. Het diagram weergegeven in Figuur 2C, rechts, ziet u dat alle bestanden in de Neutrophils_NM database opgenomen (n = 11) passen in 2 SD in vergelijking met de mediaan van de groep.
2. Strategie van analyse voor monocyten - Monocytes_NM database bouw
   1. Identificeren van de monocytic afstamming cellen (CD117 +/-CD64 + hi HLADR + Hallo) met behulp van een doorsnede van vier poorten(Figuur 2). Deze gebeurtenissen toewijzen aan de 'Monocytic' -tab in de structuur van de hiërarchie van bevolking.
   2. Schakel de overige gebeurtenissen, houden van alleen de monocytic cellen zichtbaar, exporteer deze populatie door te klikken op ' bestand | Exporteren ' en verifiëren dat alle vereiste parameters worden gecontroleerd en de prestatiegegevens als FCS bestanden opslaat.
   3. In een samengevoegde bestand dat bestaat uit alle geëxporteerde FCS-bestanden, een kwaliteitscontrole uitvoeren met een evaluatie van de intensiteit van de expressie van merkers voor elke subpopulatie en deze vervolgens verwijdert de gevallen buiten de 2SD curven (details in sectie vertegenwoordiger resultaten) (Figuur 2 B).
   4. In het resulterende bestand met "Monocytic" cellen zichtbaar, de rijping traject gebruik maken van het APS-diagram (Figuur 2C links) en sla dit op als een .cyt-bestand.
      Opmerking: Een vergelijking rijping Diagram maakt het mogelijk de visualisatie van alle parameters van alle bestanden die zijn opgenomen in de database van de Monocytes_NM tegen de genormaliseerde database vertegenwoordigd. Het diagram weergegeven in Figuur 2C, rechts, ziet u dat alle bestanden in de Monocytes_NM database opgenomen (n = 10) passen in 2 SD in vergelijking met de mediaan van de groep.
3. Strategie van analyse voor genucleëerde rode bloedcellen (NRC) - NRC_NM database bouw
   1. CD34 + erythroid gepleegd ontploffing met een doorsnede van zeven poorten waarmee de selectie van CD34 + CD117 + HLADR + lage CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + evenementen (Figuur 3A(1)) te identificeren. Toewijzen van deze gebeurtenissen naar het tabblad "NRC" in de structuur van de hiërarchie van bevolking en toen uncheck dit tabblad ter opheffing van deze cellen (afgebeeld in het rood) uit de weergave van de resterende evenementen (grijs).
   2. Identificeren van rijpere NRC met een doorsnede van vier poorten waarmee de discriminatie van CD45-/ + dim SSClow CD36 + hi CD71 + hi CD105 +/-cellen. Deze gebeurtenissen toewijzen op het tabblad "NRC" (Figuur 3A(2)). De bloedplaatjes (CD36 + hi SSClow cellen) moeten worden verwijderd uit de NRC bevolking (Figuur 3A(2)).
   3. Schakel de overige gebeurtenissen, houden alleen de NRC cellen zichtbaar, exporteer deze populatie door te klikken op ' bestand | Exporteren ' en verifiëren dat alle vereiste parameters worden gecontroleerd en de prestatiegegevens als FCS bestanden opslaat.
   4. In een samengevoegde bestand dat bestaat uit alle geëxporteerde FCS-bestanden, een kwaliteitscontrole uitvoeren met een evaluatie van de intensiteit van de expressie van merkers voor elke subpopulatie, gevolgd door het verwijderen van de gevallen buiten de 2SD curven (zie details in sectie vertegenwoordiger resultaten) ( Figuur 3 B).
   5. In het resulterende bestand met "NRC" cellen zichtbaar, de rijping traject gebruik maken van het APS-diagram (Figuur 3C, links) en sla dit op als een .cyt-bestand.
      Opmerking: Een vergelijking rijping Diagram maakt het mogelijk de visualisatie van alle parameters van alle bestanden die zijn opgenomen in de database van de NRC_NM tegen de genormaliseerde database vertegenwoordigd. Het diagram gepresenteerd in Figuur 3C, rechts, ziet u dat alle bestanden in de NRC_NM database opgenomen (n = 14) passen in 2 SD in vergelijking met de mediaan van de groep.
4. Evaluatie van rijping in BM myeloïde compartimenten met behulp van de rijping Databases
   1. Open het .cyt-bestand dat correspondeert met de bloedlijn van belang (dwz., Neutrophils_NM_GMFF.cyt voor neutrofiele afkomst, Monocytes_NM_GMFF.cyt voor monocytic afkomst en NRCs_NM_GMFF.cyt voor erythroid afstamming).
   2. Klik met de rechtermuisknop op 'Rijping' tabblad onder de tab die overeenkomt met de bloedlijn van belang (' neutrofielen | Monocytic | NRC') en de rijping te rijping Database opslaan.
   3. Een nieuwe FCS-bestand opent en analyses uit te voeren, zoals eerder uitgelegd (4.1.1–4.1.3 stap voor neutrofielen, stap 4.2.1 voor Monocytic cellen en 4.3.1–4.3.2 stap voor NRC).
   4. Trekken de rijping weg voor de bevolking van belang.
   5. Open de bijbehorende database in het tabblad 'Extra' (Database-analyse) en de bevolking te worden geanalyseerd met de overeenkomstige rijping Database te vergelijken. Controleer de gegevens voor compatibiliteit met de beschikbare database: volledige compatibiliteit (groene driehoek); gedeeltelijke compatibiliteit, in de meeste gevallen verschillen in de naam van de parameters (gele driehoek); en incompatibiliteit (rode driehoek).
   6. Als de gegevens compatibles of gedeeltelijke compatibles zijn, maakt de software het diagram ' genormaliseerd rijping verschillen ' . Om te visualiseren de ' Parameter Band rijping verschillen 'een nieuw diagram openen in tabblad 'Diagram' , en klik op 'Rijping' Kies hoeveel parameters worden weergegeven, klikt u op 'OK' en het diagram worden weergegeven. Met Klik met de rechtermuisknop in het diagram; wijzigingen kunnen worden aangebracht in Data Visualization, Database visualisatie en rijping Diagram visualisatie.
   7. Om te visualiseren de betekenis van de verschillen tussen het nieuwe bestand en de gegevens in de database, het configureren van een zoom (Klik met de rechtermuisknop op ' genormaliseerd rijping verschillen ' en 'Zoom'van de toepassing).

Representative Results

De 54 BM monsters in K-EDTA antistollingsmiddel geoogst werden opgenomen in de studie. De MFC-gegevens werden geanalyseerd in het ontbreken van informatie over de patiënten. Retrospectieve studie toonde aan dat de BM monsters van 7 gezonde donoren (5 mannetjes en 2 vrouwtjes met een gemiddelde leeftijd van 47.4 [35-48], 11 personen met geen bewijs van een hematopoietische ziekte (8 reutjes en 3 teefjes met een gemiddelde leeftijd van 57,9 [35-72]) en 36 gevallen met verschillende waren pathologische condities: 1 geval met bloedarmoede en lage creatinine niveau, 3 gevallen met bloedarmoede en hoge creatinine level, 8 gevallen met bloedarmoede van ontsteking, 1 geval met bloedarmoede veroorzaakt door vitamine B₁₂ tekort, 4 gevallen met bloedarmoede ± andere cytopenias veroorzaakt door leverschade, 3 gevallen met auto-immune hemolytisch bloedarmoede, 5 gevallen met idiopathische trombocytopenische purpura, 1 kast met het syndroom van de activering van de macrofaag, 3 gevallen met volledige verlossing na behandeling van het lymfoom (minimale residuele ziekte < 0,01%) en 7 gevallen Hematologische stoornissen (4 MDS, 1 AML, 1 Chronische MyeloMonocytaire Leukemie en 1 myeloproliferatieve syndroom JAK2 positieve) uitvoering. Deze laatste categorie opgenomen 18 mannen en 18 vrouwen met een gemiddelde leeftijd 60,3 [17-100]. Alle monsters zijn bij personen met een blanke. De databases gebouw toegestaan identificeren en vaststelling van verschillende kwesties in verband met de bereiding van de monsters en overname. In ons geval, de laatste databases opgenomen 11/18/EG bestanden voor neutrofiele rijping, 10/18/EG bestanden voor monocyt rijping en 14/18/EG bestanden voor NRC rijping. De bestanden die niet in databases opgenomen waren verschillende technische problemen opgeleverd. De meest voorkomende kleuring problemen werden waargenomen voor CD11b en CD13 in neutrofielen, CD300e en HLADR in monocyten, en CD71 en HLADR in NRC. gegevens exporteren kan een bron van fouten; de meest voorkomende in onze dataset was de afwezigheid van FSC-H in geëxporteerde bestanden en de omkeringen van FSC-W met FSC-H die soms optreden bij de uitvoer van DIVA bestanden⁸. De evaluatie van nieuwe gevallen van cytopenias die ervan verdacht worden van MDS tegen de myeloïde normale rijping Databases toestaan voor de identificatie van abnormale uiting van rijping antigenen van neutrofielen overdrachtslijn (Figuur 4), monocyten (Figuur 5 ), en NRC (Figuur 6) zelfs in gevallen zonder cytologische of cytogenetische afwijkingen (Figuur 7). Anders, met routine acquisitie software, zoals Diva, deze zou moeilijk of onmogelijk te realiseren.

Figuur 4 : Representatief stroom cytometry analyse van neutrofielen bij een MDS del(7). (A) In the genormaliseerd rijping verschillen diagram, het grijze gebied correspondeert met de normale expressie van antigenen die voortvloeien uit de analyse van de 11 normale bestanden opgenomen in de neutrofiele database (median± 2SD). De abnormale uiting van verschillende antigenen ten opzichte van de del(7) MDS zaak tegen Neutrophils_NM database werd waargenomen (n = 1 versus n = 11 normale controles monsters). (B) Parameter Band rijping diagrammen toestaan de vergelijkingen tussen de gemiddelde intensiteit van meningsuiting van iedere markeerdraad in verschillende stadia van rijping (continue volledige lijnen) en 2SD curven berekend voor de 11 normale BM gevallen opgenomen in de database (continu onderbroken lijnen). Fenotypische afwijkingen van neutrofielen waargenomen bij een MDS del(7) ten opzichte van de neutrofiele normale rijping Database zijn als volgt: algemene verhoogde expressie van CD34, lichte stijging van CD11b meningsuiting op onrijpe neutrofielen (etappes 2), verminderde expressie van CD13 op onrijpe neutrofielen (stappen 1-3) en lichte verhoging van de eerste twee etappes CD16 uitdrukking van neutrofiele rijping gevolgd door gematigde stijgingen van CD16 expressie op de volwassen neutrofiele granulocyten (stappen 4-5). (C) toont dat de bijbehorende stip percelen als gevisualiseerde in DIVA software. Evaluatie van de afbeelding met behulp van de DIVA software maakt identificatie van een klein aantal fenotypische afwijkingen in dit geval MDS: een verhoogd percentage van CD34 + CD13 + precursoren en de Downregulatie van CD13 expressie. De abnormale uiting van CD16 is moeilijk te observeren in dit type van vertegenwoordiging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Representatief stroom cytometry analyse van monocyten bij een MDS del(7). (A) de verschillen Normalized rijping diagram biedt een globaal bekijken van expressie van het antigeen in verschillende stadia van monocytic cel lineage rijping. Het grijze gebied komt overeen met de normale expressie van antigenen die voortvloeien uit de analyse van 10 normale bestanden opgenomen in de monocytic database (mediane ± 2SD). De abnormale uiting van verschillende antigenen overschrijdt 2SD, maar voor sommige markeringen, zoals CD35 en HLADR, het hoger is dan 4SD. (B) In de Parameter Band rijping diagrammen, de fenotypische afwijkingen van monocytic cellen waargenomen in een SMD-del(7) geval wanneer in vergelijking met monocyt normale rijping Database (n = 1 versus n = 10 normale controles monsters) zijn als volgt: verminderde expressie van CD45 in fase 1-4 van monocytic cellen, van CD117 in stadia 1-2 van monocytic precursoren, en van HLA-DR over het geheel genomen. De verhoogde expressie van CD35 in de eerste 3 stadia van rijping van de monocytic cellen was de meest significante afwijking voor deze bloedlijn. (C) de DIVA dot plots waarmee evaluatie van monocytic cellen in een normale BM. (D) de DIVA pixel percelen waarmee evaluatie van monocytic cellen in del(7) MDS geval. Evaluatie van de afbeelding met behulp van de DIVA software maakt identificatie van twee fenotypische afwijkingen in dit geval MDS: de verminderde expressie van HLA-DR en de verhoogde expressie van CD35 in een deel van monocytic precursoren (rode bevolking). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Representatief stroom cytometry analyse van genucleëerde rode bloedcellen bij een MDS del(7). (A) de verschillen Normalized rijping diagram biedt een globaal bekijken van expressie van het antigeen in de verschillende stadia van NRC lineage rijping. Het grijze gebied komt overeen met de normale expressie van antigenen die voortvloeien uit de analyse van de 14 normale bestanden opgenomen in de NRC normale rijping Database (mediane ± 2SD). De abnormale uiting van verschillende antigenen overschrijdt 2SD, maar voor sommige markeringen, zoals CD34, CD117, CD71 en CD105, het hoger is dan 4SD. (B) In de Parameter Band rijping diagrammen, de fenotypische afwijkingen waargenomen in een SMD del(7) geval in vergelijking met de NRC Database voor de rijping van de normale (n = 1 versus n = 14 normale controles monsters) zijn als volgt: verminderde expressie van CD34 in de eerste twee stadia van rijping, van CD117, CD105, CD71 en HLA-DR op fase 1 van de erythroid afstamming precursoren. Evaluatie van de afbeelding met behulp van de DIVA software maakt identificatie van CD71 abnormale meningsuiting op erythroid cellen in dit geval MDS, maar andere wijzigingen zijn niet waarneembaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7 : Representatief stroom cytometry analyse van neutrofiele granulocyten, monocyten en NRC in een vroeg stadium MDS geval zonder morfologische dysplasie en zonder cytogenetische aberrancies. (A) de verdeling van de onvolwassen en volwassen cellen binnen verschillende rijping fasen voor de drie myeloïde lineages: neutrofiele granulocyten, monocyten en NRC. Een toenemend aantal volwassen monocyten (fase 5) en het enigszins verminderen van monocytic onrijpe cellen (fase 2 van rijping) werd waargenomen. (B) de genormaliseerde rijping verschillen diagram laat zien dat de fenotypische afwijkingen 2SD overschrijden, maar voor CD34, CD117, CD11b, CD16 en HLADR, ze hoger bij 4SD. fenotypische afwijkingen waargenomen zijn voor neutrofielen als volgt zijn: lichtjes verhoogde SSC waarden in neutrofiele onvolwassen precursoren (fase 1), vermindering van expressie van CD34 (fase 1), van CD117 (fase 1), van CD16 (fase 1 - 2) en HLADR (stappen 1-3 van rijping). Een verhoogde expressie van CD11b werd waargenomen op neutrofiele onvolwassen precursoren (fase 1). (C) de genormaliseerde rijping verschillen diagram toont aan dat de belangrijkste fenotypische afwijkingen voor de monocytic afkomst waargenomen (meer dan 10SD) zijn groter uitdrukking van CD35 en vroegtijdige verwerving van CD300e op de onvolwassen monocytic precursoren. Andere fenotypische afwijkingen waargenomen op de monocytic afkomst zijn als volgt: vermindering van FSC en WS op rijpere monocyten (fasen 3-5) en lichte afname van meningsuiting van CD14 op 2-3 fasen van monocytic cellen. (D) de Normalized rijping verschillen diagram en de Parameter diagrammen voor de rijping van de Band toont aan dat de belangrijkste fenotypische afwijkingen waargenomen voor de NRC: verhoogde expressie van CD117 (meer dan 10SD) op stadia 2-3 van NRC rijping, verhoogde van expressie van CD34 (meer dan 5SD) tijdens de tweede fase van de rijping van NRC en verminderde expressie van CD36 op de vroege erythroid voorlopers (stappen 1-3). Bovendien, is de wetenschappelijke stuurgroep op onrijpe NRC lager dan op de normale tegenhangers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Bovendien, de interpretatie van de betekenis van verschillen tussen antigeen expressie op pathologische instellingen en normale tegenhangers zorgt voor "quantification" van deze afwijkingen, met de identificatie van degenen die discriminant voor een groep zijn van de gevallen. Dit kan ook het mogelijk maken te rangschikken op basis van belang voor de toepassing van een follow-up. In deze studie werden alle 7 gevallen van hematologische aandoeningen met myeloïde dysplasie functies (4 MDS, 1 AML, 1 Chronische MyeloMonocytaire Leukemie en 1 myeloproliferatieve syndroom JAK2 positieve) geclassificeerd als abnormale in vergelijking met de NBM-databases. Bovendien is de evaluatie tegen de Neutrophils_NM database geëlimineerd de verdenking van myeloïde dysplasie in 7 gevallen met giftige, auto-immune inflammatoire hemolytisch bloedarmoede en bloedarmoede van chronische nierziekte. De evaluatie tegen de Monocytes_NM database uitgeschakeld de verdenking van myeloïde dysplasie in 4 gevallen met idiopathische trombocytopenische purpura (ITP), terwijl de evaluatie tegen NRC_NM toegestaan voor differentiatie in 3 gevallen, 2 van inflammatoire bloedarmoede en 1 van ITP. De BM aspirates van de patiënten in de volledige verlossing na lymfoom of solide tumor behandelingen binnen 2 waren SD van de mediaan van de normale databases voor alle drie geslachten, en dus deze monsters alternatieven voor gezonde donor BM monsters kan worden.

Figuur 1 : Analyse strategieën voor neutrofiele cel bloedlijn. (A) selectie van CD34 + CD117 + HLADR + lage CD10 - CD13 + CD11b-neutrofiele progenitoren werd gerealiseerd door kruising van zeven poorten zoals afgebeeld in A1. De volgende stap van rijping, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lage neutrofiele precursoren werd gekozen met een doorsnede van zes gates zoals afgebeeld in A2. De meer volwassen neutrofielen zijn ten slotte geïdentificeerd met behulp van een doorsnede van vier poorten waarmee discriminatie van CD45dim SSCint-hi CD117-HLADR-cellen (A3). De meeste discriminant markeringen voor neutrofiele lineage waren CD34, CD117, CD11b en CD16. Samen met CD13, toestaan dat deze parameters identificatie van vijf subpopulaties: CD34 + progenitoren (CD34 + CD117 + CD13 +^lage CD11b - CD16-) (donkerblauw); CD34 - CD117 + CD13 +^hi CD11b-CD16-neutrofiele precursoren (blauw); CD34 - CD117 - CD13 +^lage CD11b-CD16-neutrofiele granulocyten (3^rd stap van rijping, lichtblauw); CD34 - CD117 - CD13 +^lage CD11b + CD16 +^lage neutrofiele granulocyten (4^th stap van rijping, roze); volwassen neutrofiele granulocyten (CD34 - CD117 - CD13 +^hi CD11b +^Hallo CD16 +^Hallo; violet). Elke gekleurde cirkel geeft de mediaan van een subpopulatie voor de markering van belang uit één monster (B). (C) toont de homogene verdeling van de geteste parameters tijdens de rijping van de neutrofiele cel in vergelijking met 2 SD van de normale rijping database (n = 11). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Analyse strategie voor monocyten. Identificatie van monocytic afkomst cellen (CD117 +/-CD64 + hi HLADR + Hallo) wordt uitgevoerd met behulp van een doorsnede van vier poorten (A). De meest discriminant markers voor monocytic afkomst werden CD14, CD300e (IREM2), CD35, en HLA-DR. langs met CD117, deze parameters toestaan identificatie van drie subpopulaties: CD34 - CD117 +^lage/ - HLADR +^hi CD35 - CD14 - CD300e - (rood); CD34 - CD117 - HLADR +^med CD35 +^med CD14 +^med CD300e - (oranje); oudere monocyten CD34 - CD117 - HLADR +^med CD35 +^Hallo CD14 +^hi CD300e + (groen) (B). (C) toont de homogene verdeling van de geteste parameters tijdens de rijping van de monocytic cel in vergelijking met 2 SD van de normale rijping database (n = 10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Analyse strategieën voor NRC. (A) de identificatie van CD34 + erythroid gepleegd ontploffing werd gerealiseerd met behulp van een doorsnede van zeven poorten die selectie toestaan van CD34 + CD117 + erythroid progenitoren (A1). De meer volwassen NRC worden geïdentificeerd met behulp van een doorsnede van vijf poorten (A2). Uitsluiting van de bloedplaatjes (CD36 + hi SSClow cellen) van NRC bevolking is vereist (A2). De meeste discriminant markeringen voor erythroid cel lineage waren CD34, CD117, CD71 en CD105. Samen met CD33, toestaan dat deze parameters identificatie van drie subpopulaties: CD45 +^lage CD34 + CD117 + HLADR +^med CD71 +^med CD36 +^med CD105 +^Hallo (rood); CD34 - CD117 + HLADR +^lage CD71 +^hi CD36 +^hi CD105 +^Hallo NRC (2^nd stap van rijping, roze); CD34-CD117-HLADR-/ +^lage CD71 +^hi CD36 +^med CD105 +^lage/-referentiecentra (NRC; roze zalm meer volwassen) (B). (C) toont de homogene verdeling van de geteste parameters tijdens de rijping van de NRC in vergelijking met 2 SD van de normale rijping database (n = 14). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: lijst van gebruikte om setup van de fluorescentie compensatie matrices met hun referentie populaties fluorescerende-geconjugeerde antilichaam reagentia. Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.

Tabel 2: Combinatie en hoeveelheid antilichamen gebruikt voor evaluatie van rijping van neutrofiele, monocyten en erythroid cellen in BM.   Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.

Aanvullende bestand 1: Monocytes_Maturation.inp Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2: Monocytes_NM_GMFF.CYT   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 3: Neutrophils_Maturation.inp   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 4: Neutrophils_NM_GMFF.CYT   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 5: NRC_Maturation.inp   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 6: NRC_NM_GMFF.CYT   Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De kwaliteit van BM aspirate kan gevolgen hebben voor de eindresultaten. De hemodilution van de BM-aspirate kan de verdeling van de cellen in verschillende stadia van rijping te wijten aan de afwezigheid van de progenitoren of precursoren cellen verstoren. Waarschijnlijk een bulk lysing methode in dienst kan helpen bij de normalisering van BM aangeblazen voor hemodilution in stroom cytometrische analyses. Daarnaast zijn de kritische stappen voor de evaluatie van BM myeloïde dysplasie van stroom cytometry de monster verwerking en kleuring, data-acquisitie en interpretatie^2,3. Het monster verwerking en vlekken moet plaatsvinden tot 72 h na BM oogsten. De gegevens moeten worden verworven, bij voorkeur direct na de kleuring of opslaan van de monsters bij 4 ° C, beschermd tegen licht, voor niet meer dan 1 h tot in de cytometer van de stroom te meten. De interpretatie van database-geleide vermijdt de subjectieve beoordeling van BM myeloïde cel rijping.

De antilichaam-combinaties en de bereiding van de monsters werden grotendeels voldaan aan de EuroFlow procedures^9,10. Het verschil in vergelijking met het deelvenster EuroFlow was dat alle antilichamen behalve CD300e werden verstrekt door BD Bioscience. De stroom cytometry standaardisatie maakte het mogelijk om gegevens met hoge niveaus van reproduceerbaarheid¹¹te verkrijgen, maar deelname aan een groep werkt aan de standaardisatie van de panelen in kwestie van dien. In onze fractie blijft de standaardisatie van SSC een gebied voor verbetering vatbaar. De belangrijkste kwestie omtrent databases van MFC gebouw is de kleuring procedure. De initiële verdeling van de niet-ruggengraat antilichamen in FACS buizen voordat u toevoegt de gelijke hoeveelheden van de monster-ruggengraat mix vermijdt herhalen de ruggengraat kleuring in geval van eventuele fouten in de verdeling van andere niet-ruggengraat antilichamen. Bovendien, om te overwinnen de kleuring problemen er zijn twee mogelijkheden: ofwel verhogen de incubatietijd van antilichamen van 15 tot 30 minuten, of gebruik de recombinante antilichamen, waarmee meer reproduceerbaarheid, volgens de fabrikant specificaties¹². De analyse werd uitgevoerd in overeenstemming met het onlangs gepubliceerde gegevens^13,14,15. Met betrekking tot de analyse van de monocyten waargenomen we vaak gebrek aan CD34 + CD117 - monocytic precursoren, zoals eerder is gemeld door Shen et al. ¹⁶. om deze reden we geëlimineerd uit de analyse-strategie een aanvullende poort voor het isoleren van dit bijzondere bevolking. Het snijpunt van poorten waardoor Isolatievan CD64 + F HLADR + F/int en CD117 +/-omvat de onrijpe voorlopers (CD117 + CD34 + lage /-) en de meer volwassen monocyten.

De evaluatie van nieuwe FCS bestanden vergeleken met een database draagt bij tot een objectiever, gestandaardiseerde analyse en data interpretatie en verkeerde interpretaties van de erkenning van de zogenaamde patronen, die moeilijk te standaardiseren³vermijdt. De kwantificering van de amplitude van de fenotypische afwijkingen ten opzichte van normale databases maakt het mogelijk om de rang van deze afwijkingen, die kunnen helpen verbeteren van MFC scores voor MDS diagnose. Bovendien, deze methode kunt nauwkeurige identificatie van de fenotypische afwijkingen op onrijpe CD34 + en/of CD117 + precursoren en in meer volwassen cellen, die niet duidelijk zijn bij gebruik van de huidige analyse strategieën in acquisitie software. Deze methode is in de diagnose van MDS gevallen die doen of hebben geen duidelijk morfologische afwijkingen, of dat doen of draag cytogenetische terugkerende aberrancies niet relevant.

Verbetering van het antilichaam kleuring nodig is, en de toevoeging van nieuwe normale BM gegevens in databases is vereist teneinde de robuustheid, betrouwbaarheid en gevoeligheid van de analyse. Deze methode kan worden toegepast, met verder onderzoek, cytopenias van andere oorzaken, of klonen Haematopoiese van onbepaalde potentieel (CHIP), teneinde de fenotypische wijzigingen betrouwbaar aan dysplastische processen gerelateerde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain