Summary
O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.
Abstract
Um grupo de trabalho iniciado dentro francês citometria de associação (AFC) foi desenvolvido a fim de harmonizar a aplicação da citometria de fluxo multiparâmetros (MFC) para o diagnóstico de doença mieloide na França. O protocolo aqui apresentado foi estabelecido e aplicado entre setembro de 2013 e de 2015 novembro seis laboratórios de diagnóstico francês (hospitais universitários de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice e Lille e Institut Paoli-Calmettes em Marselha) e permitiu a padronização de aquisição de dados e preparação de amostra da medula óssea. Três bancos de dados de maturação foram desenvolvidos para neutrófilos, monocítica e linhagens eritroide com medula óssea de indivíduos "saudáveis" doador (indivíduos sem qualquer evidência de doenças hematopoiéticas). Um método robusto de análise para cada linhagem mieloide deve ser aplicável para o uso rotineiro de diagnóstico. Novos casos podem ser analisados da mesma maneira e comparados com os bancos de dados de sempre. Assim, quantitativas e qualitativas de anormalidades fenotípicas podem ser identificadas e aqueles acima 2SD comparado com dados de amostras normais da medula óssea devem ser consideradas indicativas de patologia. A principal limitação é a maior variabilidade entre os dados obtidos usando os anticorpos monoclonais obtidos com os métodos baseados em tecnologias de hibridoma e atualmente utilizados no diagnóstico clínico. Definição de critérios para validação técnica dos dados adquiridos pode ajudar a melhorar a utilidade do MFC para diagnósticos MDS. O estabelecimento destes critérios exige análise contra um banco de dados. A redução da subjetividade do investigador na análise de dados é uma importante vantagem deste método.
Introduction
Na ausência de marcadores fenotípicos específicos para as alterações displásicas ocorrem em células mieloides durante a iniciação de MDS e progressão, foi proposta uma nova abordagem em anos recentes, com base na avaliação de vias de maturação (expressão alterada de antígenos mieloides durante a produção de células mieloides maduras) ou da distribuição anormal de diferentes tipos de células na medula óssea (BM) de células compartimentos1,2.
Este artigo apresenta um novo método para aplicação padronizada do MFC, a fim de detectar alterações displásicas em compartimentos de células mieloides BM relacionados a Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou outras doenças hematológicas mieloides. Este estudo também mostra a utilidade do uso de bancos de dados de maturação para análise de dados MFC.
Padronização do procedimento de preparação de amostra, aquisição de dados e análise usando os bancos de dados permitiria identificar as anormalidades fenotípicas mais relevantes relacionadas com alterações displásicas em células mieloides BM. Portanto, subconjuntos estatisticamente selecionados com base em formatos bem marcados e bem reconhecidos (diagramas de separador de população automática (APS), histogramas e lotes do ponto) são necessários para o desenvolvimento de uma estratégia de análise que pode ser usada na análise subsequente rondas. A descoberta de anormalidades fenotípicas robustas em MDS facilitariam o diagnóstico em casos com ou sem displasia morfológica mínima e sem aberrancies de citogenéticas. Identificação dos parâmetros discriminatórios para a redução dos painéis imunofenotípica pode simplificar o atual escores2, permitindo a sua aplicabilidade em laboratórios de patologia clínica.
Este método limita as interpretações subjetivas de citometria dados, como tem sido sinalizado no MDS diagnóstico3. Esta etapa é um pré-requisito para o desenvolvimento de ferramentas automatizadas para processamento e análise de fluxo de dados4.
MDS compreende um grupo heterogêneo de desordens de células-tronco hematopoéticas clonais (HSC), em que as mutações spliceossoma cooperarem com modificadores epigenéticas específicas para produzir o fenótipo do MDS. Agora sabe-se que, juntamente com as mutações do HSC, outros mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia do MDS, tais como inflamação mediada por imune aberrante e interações entre linfócitos malignos e o microambiente do estroma do BM. No entanto, estes mecanismos permanecem mal compreendidos. A heterogeneidade ampla clínica e biológica da MDS faz o diagnóstico e seleção da terapia ideal um desafio. Na última década, vários estudos têm mostrado que MFC é muitas vezes mais sensível na detecção de displasia2 do que a morfologia, mas as restrições técnicas e econômicas dificultam essa técnica padronizar, com resultados muitas vezes dependendo do experiência do intérprete3. Além disso, não está claro como MFC pode pender a balança em direção a MDS com ou sem displasia morfológica mínima nos casos e na ausência de anomalias citogenéticas ou em casos-limite como hipocelular MDS, com uma contagem baixa de explosão, de outro não-clonal BM doenças como a insuficiência de medula óssea (i. e., anemia aplástica). Também continua a ser difícil diferenciar casos-limite da MDS com excesso de blastos da leucemia mieloide aguda (LMA). Por todas estas razões, as diretrizes clínicas não integrar a MFC testes para o diagnóstico final do MDS. Em 2011, a rede de câncer abrangente nacional dos EUA (NCCN) recomendado MFC para a estimativa da percentagem de células CD34 +, detecção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna e presença de clones de células T citotóxicas em hipocelular MDS5. Estas duas situações este último também envolvem um objetivo terapêutico porque dados clínicos mostraram uma boa resposta desses pacientes a terapia imunossupressora6. As diretrizes NCCN 2017, citando as recomendações do grupo de trabalho internacional (GTI), listado immunophenotyping aberrante deteção pelo MFC entre os co critérios para o diagnóstico do MDS, mas sem fazer quaisquer especificações6. Além disso, a classificação WHO publicada recentemente estipula que as conclusões de MFC sozinhos não são suficientes para estabelecer um diagnóstico primário de MDS na ausência de dados conclusivos morfológica e/ou citogenética7. No entanto, MFC pode ser usado como um teste adicional mostrando o dysregulation do célula mieloide padrões de maturação e quantificar a "distância normal" para um paciente em um momento específico do curso da doença.
Este método é aplicável em laboratórios clínicos interessados na avaliação de displasia em células mieloides BM, usando MFC immunophenotyping, a fim de refinar o diagnóstico em MDS ou outros distúrbios mieloides com anormalidades displásicos.
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Protocol
O protocolo listado abaixo foi aprovado pelo "Comité de Protection des Personnes" (Comitê de ética independente) 1 Sud-Est da Universidade Hospital de Saint-Etienne, França.
1. citômetro de configurações
Nota: As configurações de citômetro foram realizadas de acordo com recomendações de fluxo de França, em conformidade com o procedimento EuroFlow "EuroFlow operacional protocolo padrão (SOP) para instalação do instrumento e a compensação (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Configuração de instrumento mensal
- Ligue o citômetro. Certifique-se de que todos os níveis de fluido são adequada e aberto Diva 6.1.3. Executar inicialização fluidics: na barra de menu, selecione ' citômetro | Fluidics Startup'. Clique em 'Okey' quando solicitado. Permita o citômetro aquecer durante pelo menos 30 min.
- Verificação de desempenho - grânulos de CST
Nota: Para esta etapa, prepare-se 12 tubo 75mm poliestireno, grânulos de CST e bainha fluido (ver Tabela de materiais).- Rotular um tubo de poliestireno 12 x 75 mm2 'CST'. Misture o frasco de talão fornecido pela inversão suave ou delicado num Vortex. Adicionar ao tubo rotulado: 0,35 mL de fluido de bainha e 1 gota de grânulos de CST. O tubo de vórtice suavemente e proceder à aquisição. Armazene o tubo para até 8 h 2-25 ° c no escuro se não adquirir imediatamente.
- Realizar a verificação do desempenho: na barra de menu, selecione ' citômetro | CST'.
- No separador 'Setup' do módulo CST: confirmar o Canto II como a configuração de 4-2 H-2V padrão e também confirmar que uma linha de base criada usando o lote atual de grânulos CST existe para esta configuração. Se não existir uma linha de base, consulte o IFU de grânulos de CST. Confirmar que esta linha de base não expirou: em ' controle de configuração ', selecione ' verificar Performance' do menu drop-down.
- Verifique 'Carregar manualmente o tubo' e clique em 'Executar'. Confirme o número de lote exibido. Delicadamente vórtice os grânulos diluídos preparado acima e quando solicitado, carregar os grânulos diluídos e clique em 'Okey'.
- Quando a verificação de desempenho estiver concluída, verifique se que o citômetro de desempenho passado. Clique em 'Exibir relatório'. Re-execute a verificação de desempenho se os resultados não passou. Salve o relatório em formato PDF com a data de relatório de acompanhamento de desempenho.
- Ajuste o 'PMT fluorescente tensões' com grânulos de arco-íris (Tabela de materiais).
Nota: Os valores-alvo são estipulados no procedimento operacional padrão do Euroflow (SOP) intitulado "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Esta SOP está disponível no site Euroflow (www.euroflow.org; na área pública; Guia de protocolos).- Criar um novo experimento através de ' mensal data de instalação do instrumento | Amostra '.
- ', escolha os parâmetros ópticos e fluorochromes correspondentes aos tubos em causa (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) e verifique os parâmetros de aquisição desejada (Log, A, H e / ou W). Aplica configurações atuais do CST (botão direito do mouse em ' configurações de citômetro ' da experiência). Defina o limite para o parâmetro do FSC em 10.000.
- Sobre o citômetro, desligue a compensação ao definir fluorescência tensões de PGTO para configuração de destino das IFM; para este efeito, vá no 'Inspetor', navegue até a guia 'Compensação' Disable compensação pela opção de ' Ativar compensação ' desmarcando.
- Criar uma planilha ' alvo IFM ' com todos os lotes do ponto necessário (n = 2; FSC contra SSC, FITC contra PE), histogramas (n = 8; um histograma para cada detector de fluorescência) e dados estatísticos que demonstram a referência a valores de pico (IFM e CV) para cada canal de fluorescência.
- Dilua 1 gota de partículas de calibração de grânulos de arco-íris de 8-pico em 1 mL de água destilada e vórtice antes do uso. Adquira sem gravação a solução de grânulos de arco-íris 8-pico em 'LOW' taxa de fluxo. Armazene o tubo para até 8 h em 2-25 ˚ c no escuro se não adquirir imediatamente.
- Singlete portão grânulos ' população P1' no FSC contra trama do ponto bivariada de SSC e o pico 8 ou 7 o FITC contra trama do ponto bivariada de PE (o pico mais brilhante ou a outra para baixo, como estipula no documento Euroflow intitulado "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") e o nome deste portão população P2.
- Continuar a aquisição da suspensão do grânulo do arco-íris 8-picos e ajustar tensões PGTO em todos os canais de fluorescência para atingir valores de IFM de destino de acordo com o documento Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
- Quando são atingidos valores alvo IFM para o pico de 7 ou 8, grave o IFM alvo alcançado e os correspondentes valores finais de pgto. Adquirir 5.000 eventos e gravar os dados.
Nota: Que PMT valores deve ser usada abaixo na etapa 1.2.3 (verificação de desempenho - confirmação de PGTO valores com grânulos de arco-íris). - Anote estes valores fazendo uma impressão de tela com configurações ' IFM alvo ' e instrumento de planilha e salvar como imagem. jpg.
Nota: Quando é criado um tubo "Novo", às vezes os PGTO valores variam inesperadamente. Por isso, é essencial uma dupla verificação de pgto. Compare cada vez que os valores de PGTO para suas notas, verifique que os valores de ' IFM alvo ' e PGTO estão corretas! - Salve o 'Application Settings'. No navegador, clique em ' configurações de citômetro '. No menu suspenso, selecione ' configurações de aplicativo 'e salve. Clique em 'Okey'. Se solicitado, clique em Sim para manter os valores de limiar.
Nota: Salve as configurações do aplicativo usando o nome padrão. Não renomeie as configurações.
- Ajuste o 'FCS' e 'Tensões SSC' com sangue lavado lisado (LWB).
Nota: Para esta etapa, são necessários 50 µ l de uma amostra de sangue periférico (PB) de uma solução saudável voluntária, Lise (Tabela de materiais) e o tampão de lavagem.- Pipetas de 50 µ l de PB em um tubo. Adicione 2 mL de solução de Lise recentemente diluída. Misture delicadamente e incubar durante 10 minutos a RT
- Centrifugue por 5 min a 540 x g.
- Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l do tubo. Misture delicadamente e adicione 2 mL da solução de lavagem filtrada.
- Centrifugue por 5 min a 540 x g.
- Repita mais uma vez o 1.1.4.3–1.1.4.4 de passos.
- Adicionar 250 µ l de tampão de lavagem filtrada e misture delicadamente.
- No experimento criado para aquisição de grânulos de arco-íris, criar um novo ' amostra | Nova planilha ': desenhar um gráfico bi-paramétrica de SSC-A / FSC-A.
- Adquirir as células, portão os linfócitos em um FSC contra trama do ponto bivariada de SSC e ajustar tensões FSC e SSC para alcançar os seguintes valores-alvo significa para a população de linfócitos fechado: FSC: 55.000 (gama 50.000-60.000) e SSC: 13.000 (gama 11.000 –15,000).
- Adquirir e registar os dados com cerca de 10.000 eventos. Verifique se os valores de alvo FSC e CCD médios para linfócitos fechados. Reajuste a tensão FSC e SSC se necessário.
- Tela de impressão e armazenar a impressão dos valores de canal de destino que são obtidos.
- Configurações de compensação de fluorescência.
Nota: Os controles de compensação single-manchado devem ser definidos após as configurações IFM alvo e estabeleceram-se as configurações do FSC/SSC. Para esta etapa, um PB de um voluntário saudável, partículas de compensação (Tabela de materiais), solução de Lise e tampão de lavagem são necessários. A lista de reagentes de anticorpos conjugados a fluorocromo usado para configurar as matrizes de compensação de fluorescência e suas populações de referência estão listados na tabela 1.- Rotular um tubo por reagente deve ser usado na criação de compensação de fluorescência (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71) e um tubo "em branco/inocente".
- Pipetar 50 µ l de PB em cada tubo ou 1 gota de "negativo" partículas de compensação + 1 gota de partículas de compensação "positivos" em tubos de controle de compensação indicadas na tabela 1.
- Adicione a quantidade apropriada do reagente anticorpo ao tubo. Adicione o tampão de lavagem filtrada para alcançar um volume final de 100 µ l de pelo tubo e misture delicadamente. Incube durante 15 min em RT, protegido da luz.
- Adicionar 2 mL de solução de Lise recentemente diluída apenas nos tubos com as células e misture delicadamente. Incube durante 10 minutos a RT, protegido da luz.
- Centrifugue por 5 min a 540 x g.
- Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Misture suavemente. Adicione 2 mL de tampão de lavagem filtrada.
- Centrifugar 5min a 540 x g.
- Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Adicione o tampão de lavagem filtrada para alcançar um volume final de 250 µ l pelo tubo e misture delicadamente.
- Crie controles de compensação.
- Barra de menu, selecione experimento criado para aquisição de grânulos de arco-íris. Criar um novo ' amostra | Configuração de compensação | Criar controles da compensação.
- Na caixa de diálogo resultante, selecione a opção ' incluir controle imaculado separado tubo/bem ' . Crie controles de compensação (não específico do rótulo) genérico para FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Crie controles de rótulo específico compensação para PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71. Clique em 'Okey'.
- Em uma nova planilha, criar um gráfico de SSC-A / FSC-A bi-paramétrica e desenhar um portão em linfócitos (P1) e o histograma correspondente para o fluorocromo que será detectado em cada tubo e desenha uma porta P2 para o pico positivo. Exiba a hierarquia (clique direito em um gráfico e selecione ' mostrar a população hierarquia ') para visualizar o número de eventos em P2, exceto para o tubo de controle Unstained.
- No navegador, expanda o espécime de controles de compensação.
- Vórtice as células imaculadas, preparado acima, para instalar s. 3 – 5 células imaculadas preparadas sobre o citômetro. Ajustar a taxa de fluxo para 'médio ' e clique em ' adquirir dados '. Na trama do SSC-A ponto de FSC-A vs, ajuste o portal P1 para abranger totalmente a população de linfócitos. Botão direito do mouse sobre o portão de P1. Selecione 'Aplicar a todos os controle de compensação'.
- Do painel de controle 'Aquisição' , clique em 'dados de registro ' para adquirir 5.000 eventos. Para todas as células coradas controle único-cor, verifique se que o portão de intervalo P2 engloba a população positiva.
- Para o PE-Cy7 e APCH7 tubos, adicione um portão de intervalo de P3 para o histograma e garantir que engloba a população negativa, e que o P2 engloba a população positiva.
- Calcule a compensação. Barra de menu, selecione ' experiência | Configuração de compensação | Calcular a compensação '. A matriz de compensação o nome: 'Data de compensações'. Selecione 'Link e salvar'.
- Salvar a matriz de compensação em configurações do aplicativo de catálogo: clique em 'citômetro configurações | Configurações do aplicativo | Salve ', o nome de matriz de compensação 'Data de compensação' e clique em 'Okey'.
- No navegador, clique em ' configurações de citômetro '. No Inspetor, navegue até a guia 'Compensação' Print clique no canto inferior direito.
Nota: Esta informação também pode ser obtida do catálogo. - Controle da matriz de compensação.
- Misture em um tubo de todos o único tubo manchado (APCH7 de escolha).
- Criar um novo experimento chamado 'Data de verificação de compensação', Adicionar nova amostra, clique direito em ' configurações de citômetro ' deste experimento e escolha ' Link | Desvincular | Configuração do aplicativo ' salvou na etapa 1.1.3.10. Adquira 50.000 eventos deste tubo com as novas configurações.
- Aplica uma nova planilha Global. 1 enredo de ponto FSC/SSC um de criar e desenhar um portão para visualizar os linfócitos e n x (n-1) / 2 outros focasse o portão de linfócitos Visualizar dois-por-dois parâmetros.
- Configuração de instrumento diária
- Ligue o citômetro. Certifique-se de que todos os níveis de fluido são adequada e aberto Diva 6.1.3. Executar inicialização fluidics: na barra de menu, selecione ' citômetro | Fluidics Startup'. Clique em 'Okey' quando solicitado. Permita o citômetro aquecer durante pelo menos 30 min.
- Verificação de desempenho - CST grânulos: Repita os passos 1.1.2.1–1.1.2.5.
- Verificação de desempenho - confirmação de PGTO valores com grânulos de arco-íris.
- Rotular um tubo de poliestireno como Grânulos de arco-íris '' e verifique se o número de lote está em uso. Misture bem o frasco do grânulo do arco-íris. Preparar os grânulos de arco-íris, adicione 1 gota de grânulos de arco-íris para 1 mL de água destilada ou desionizada. Protege da luz.
Nota: Proceder à aquisição ou armazenar o tubo em 2-8 ˚ c até aquisição. - Criar uma nova experiência: ' data de grânulos de arco-íris '.
- Vincular as compensações: clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione ' Setup Link', selecione a matriz de compensação adequada criada na etapa 1.1.5.9.9 e selecione 'Substituir'.
- Desvincular a compensação: clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione 'Desvincular da configuração anteriormente vinculada' e clique em 'Okey'.
- Aplicar Configurações de aplicativo '': clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione ' configurações de aplicativo ', aplicar a configuração criada na etapa 1.1.3.10 durante a configuração mensal e selecione 'manter o valor de compensação '.
- Desmarque a opção 'Habilitar compensação'.
- Crie uma nova amostra no experimento com o modelo de planilha para grânulos de arco-íris. Adquira o tubo na aquisição de 'LOW' .
- Durante a aquisição de grânulos, ajuste o portal P1 para incluir apenas a população de grânulo singlet. Ajuste a porta P2 sobre a trama de ponto FITC-A / PE-A para incluir apenas a população de grânulo singlet. Registro 10.000 eventos.
- Verifique o IFM e os valores de CV obtidos para população P2 estão as metas pré-definidas do protocolo. Caso contrário, lave o citômetro e iniciar a operação novamente. Salve o relatório como o formato PDF.
- Rotular um tubo de poliestireno como Grânulos de arco-íris '' e verifique se o número de lote está em uso. Misture bem o frasco do grânulo do arco-íris. Preparar os grânulos de arco-íris, adicione 1 gota de grânulos de arco-íris para 1 mL de água destilada ou desionizada. Protege da luz.
2. preparação da amostra BM
Nota: Execute a célula lavar protocolo apenas antes do processo de coloração.
- Pipete 600 µ l de amostra primária para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Adicionar 10 mL de tampão de lavagem (PBS + 0,5% BSA [> 98% puro BSA] + 0,09% NaN3 filtrado solução, pH 7,4). Misture a suspensão de células bem usando uma pipeta.
- Centrifugue por 5 min a 540 x g (lavagem 1). Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
- Repita as etapas 2.2 – 2.3 (lavar 2).
- Suspenda o centrifugado em 400 µ l de tampão de lavagem.
- Coloração de marcadores de espinha dorsal. Transferi todo o volume de anticorpos a espinha dorsal para um tubo de polipropileno para análise de FACS, identificado com os dados do paciente e a "espinha dorsal". Adicione 350 µ l de amostra lavada (o volume da amostra lavado necessário para preencher todos os tubos no painel). Misture bem com uma pipeta.
Nota: Calcule o volume total de anticorpos de espinha dorsal para a superfície da membrana, coloração (como mostrado na tabela 2). - Pipetar quantidades iguais da mistura amostra-espinha dorsal para 3 tubos de polipropileno para análise de FACS, identificado com os dados do paciente e "tubo número 1" para "tubo número 3". Se necessário, use tampão de lavagem para atingir um volume final de 200 µ l pelo tubo.
Cuidado: Tenha cuidado para não deixar vestígios da amostra nas paredes dos tubos; caso contrário, estas células não ser manchadas. Se necessário, vórtice a células e centrifugar o tubo. - Em cada tubo, adicione o volume adequado de anticorpos dirigidos contra marcadores de superfície celular (exceto para os marcadores de coluna vertebral), como especificado na tabela 2. Misture bem com uma pipeta. Incube durante 30 min à RT, protegido da luz.
- Adicione 2 mL de solução de Lise. Misture bem com uma pipeta. Incube durante 10 minutos a RT, protegido da luz.
- Centrifugue por 5 min a 540 x g. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Misture bem com uma pipeta.
- Adicione 2 mL de tampão para o centrifugado de lavagem. Misture bem com uma pipeta.
- Repita os passos 2.10 – 2.11 (lavar 2).
- Centrifugue por 5 min a 540 x g. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado e ressuspender o sedimento celular em 200 µ l de PBS. Misture bem com uma pipeta.
- Adquirir as células, de preferência, imediatamente depois da coloração ou armazenar a 4 ° C, protegido da luz, para não mais de 1h até medido no citômetro de fluxo.
3. aquisição de dados
- Abra uma nova experiência em software de Diva e renomeá-lo de acordo com o nome, tipo de amostra e data.
- Crie uma nova amostra contendo 3 tubos. Especifica o Layout de experimento os anticorpos usados em cada tubo.
- Clique direito sobre o ' citômetro Settings', escolha ' configurações do aplicativo ' e aplicar os valores obtidos na configuração mensal (etapa 1.1.3.10).
- Abra uma nova planilha Global e criar os lotes do ponto: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Na trama SSC/FSC um ponto, crie um portal para selecionar células singlet. Na trama SSC/CD45 BV500-um ponto, criar portões para selecionar 4 populações: granulócitos, monócitos, linfócitos e explosões. Projeto dessas populações nas tramas ponto criadas anteriormente.
- Crie uma nova planilha Global para o controle de compensação, conforme descrito na etapa 1.1.5.9.11.3.
- Adquira o tubo em 'MEDIUM' aquisição e registro 500.000 eventos/tubo. Após a validação técnica (avaliação da compensação e a coloração adequada), exporte os dados como arquivos FCS3.0.
4. análise de dados
Nota: Para construir as bases de dados BM normais foram usados arquivos de doadores saudáveis e de indivíduos sem qualquer evidência para uma doença hematopoiética como segue 11 de 18 arquivos para o Neutrophils_NM do banco de dados, 10 de 18 arquivos banco de dados Monocytes_NM e 14 de 18 arquivos de banco de dados NRC_NM. Os arquivos descartados mostrou vários problemas técnicos, como apresentado na seção de resultados de representante. Os arquivos individualmente foram analisados utilizando o software Infinicyt (Tabela de materiais), em conformidade com as várias estratégias retratadas na figura 1A(1-3) para linhagem neutrófilos (perfil Neutrophils_Maturation.inp), Figura 2 A para a linhagem de monócitos (perfil Monocytes_Maturation.inp) e Figura 3A(1-2) de linhagem de célula eritroide (perfil NRC_Maturation.inp).
- Estratégia de análise para os neutrófilos -Construção de banco de dados Neutrophils_NM
- Identifica CD34 + confirmada por neutrófilos explosões usando uma interseção de sete portões, permitindo a seleção de CD34 + CD117 + HLADR + baixo CD10 - CD13 + CD11b-eventos (Figura 1a. 1). Atribuir a esses eventos para a guia 'Neutrófilos' na árvore de hierarquia de população e posteriormente, desmarque essa guia a fim de remover estas células (representadas em azul) do visor dos restantes eventos (cinza).
- Isolar o CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores de neutrófilos baixas usando uma interseção de seis portões, conforme representado na Figura 1A(2) e atribuí-los à guia 'Neutrófilos' .
- Identifica os neutrófilos mais maduros usando uma interseção de quatro portões, permitindo a discriminação de CD45dim SSCint-Oi CD117-HLADR-células e sua atribuição à guia 'Neutrófilos' .
- Os eventos restantes, mantendo apenas os neutrófilos visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
- Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, execute uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação. Usando APS parcelas com medianas para cada arquivo e SD curvas para cada subpopulação, conforme mostrado, remover os casos fora das curvas de 2SD (veja detalhes na seção de resultados de representante) (Figura 1B).
- No arquivo composto resultante com "Neutrófilos" visíveis, desenhar o percurso de maturação em um diagrama APS (Figura 1C , à esquerda) e salvar como um arquivo de .cyt.
Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados Neutrophils_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 2,C, direita, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados Neutrophils_NM (n = 11) encaixar 2 SD comparado com mediana do grupo.
- Estratégia de análise para monócitos - construção de banco de dados de Monocytes_NM
- Identificar as células de linhagem monocítica (CD117 + CD64 + HLADR + Oi) usando uma interseção de quatro portas(Figura 2). Atribua a esses eventos para a guia 'Monocytic' na árvore de hierarquia de população.
- Os eventos restantes, mantendo apenas as células monocítica visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
- Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, executar uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação e, em seguida, remover os casos fora das curvas de 2SD (detalhes na seção de resultados de representante) (Figura 2 B).
- No arquivo resultante com "Monocytic" células visíveis, desenhar o percurso de maturação no diagrama de APS (Figura 2C esquerdo) e salvar como um arquivo de .cyt.
Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados Monocytes_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 2,C, direita, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados Monocytes_NM (n = 10) encaixar 2 SD em comparação com a média do grupo.
- Estratégia de análise para hemácias nucleadas (CRN) - construção de banco de dados NRC_NM
- Identifica CD34 + explosões eritroide cometido usando uma interseção de sete portões que permitem a seleção de CD34 + CD117 + HLADR + baixa CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventos (Figura 3a. 1). Atribuir a esses eventos para a aba "NRC" na árvore de hierarquia de população e desmarque essa guia a fim de remover estas células (representadas em vermelho) na exibição dos restantes eventos (cinza).
- Identificar mais maduros NRCs usando uma interseção de quatro portões que permitem a discriminação de CD45-/ + dim SSClow CD36 + Oi CD71 + CD105 + /-células. Atribua a esses eventos para a aba "NRC" (Figura 3-A(2)). As plaquetas (CD36 + Oi SSClow células) deve ser removido da população NRC (Figura 3-A(2)).
- Os eventos restantes, mantendo apenas as células NRC visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
- Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, executar uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação, seguido pela remoção dos casos fora o 2SD curvas (veja mais detalhes na seção de resultados de representante) ( Figura 3 B).
- No arquivo resultante com células "NRC" visíveis, desenhar o percurso de maturação no diagrama de APS (Figura 3C, à esquerda) e salvar como um arquivo de .cyt.
Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados NRC_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 3C, lado direito, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados NRC_NM (n = 14) encaixar 2 SD comparado com mediana do grupo.
- Avaliação da maturação em compartimentos mieloides BM, usando os bancos de dados de maturação
- Abra o arquivo .cyt, correspondente a linhagem de interesse (i. e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt para linhagem neutrófilos, Monocytes_NM_GMFF.cyt para linhagem monocítica e NRCs_NM_GMFF.cyt para linhagem eritroide).
- Botão direito do mouse na guia 'Maturação' abaixo da guia correspondente para a linhagem de interesse (' neutrófilos | Monocítica | NRC') e salve o banco de dados de maturação a maturação.
- Abra um novo arquivo de FCS e realizar a análise, conforme explicado anteriormente (passo 4.1.1–4.1.3 por neutrófilos, passo 4.2.1 para células monocítica, e passo a 4.3.1–4.3.2 para o NRC).
- Desenhe o percurso de maturação para a população de interesse.
- Abra o banco de dados correspondente na aba 'Ferramentas' (análise de banco de dados) e comparar a população a ser analisado com o banco de dados correspondente de maturação. Verifique os dados para compatibilidade com Banco de dados disponível: completa compatibilidade (triângulo verde); compatibilidade parcial, na maioria das discrepâncias de casos em nome de parâmetros (triângulo amarelo); e incompatibilidade (triângulo vermelho).
- Se os dados forem compatíveis ou parciais compatíveis, o software cria o diagrama ' diferenças de maturação normalizado ' . Para visualizar as ' diferenças de maturação de banda parâmetro ', abrir um novo diagrama na aba 'Diagrama' , clique em 'Maturação' e escolher quantos parâmetros para ser exibida, clique em 'Okey' e o diagrama aparecem. Com o botão direito do mouse no diagrama; alterações podem ser feitas na visualização de dados, visualização de dados e visualização de diagrama de maturação.
- Para visualizar o significado das diferenças entre o novo arquivo e dados incluídos no banco de dados, configurar um zoom (botão direito do mouse em ' diferenças de maturação normalizado ' e aplicar 'Zoom').
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Representative Results
As 54 amostras de BM colhidas em anticoagulante EDTA-K foram incluídas no estudo. Analisaram-se os dados do MFC na ausência de qualquer informação sobre os pacientes. Estudo retrospectivo mostrou que as amostras de BM eram de 7 doadores saudáveis (5 machos e 2 fêmeas com idade mediana de 47,4 [35-48], 11 indivíduos sem evidência de doença hematopoiética (8 machos e 3 fêmeas com idade mediana de 57.9 [35-72]) e 36 casos com vários condições patológicas: 1 caso com anemia e nível de creatinina baixa, 3 casos com anemia e nível de creatinina alta, 8 casos com anemia da inflamação, 1 caso com anemia causada pela vitamina deficiência de B12 , 4 casos com anemia ± outras citopenias causadas por danos ao fígado, 3 casos com anemia hemolítica auto-imune, 5 casos com Púrpura Trombocitopênica Idiopática, 1 caso com síndrome de ativação de macrófagos, 3 casos com remissão completa após o tratamento de linfoma (doença residual mínima < 0,01%) e 7 casos carregando a distúrbios hematológicos (4 MDS, 1 AML, 1 Leucemia mielomonocítica crônica e 1 síndrome mieloproliferativa JAK2 positivo). Nesta última categoria incluídos 18 homens e 18 mulheres com média de idade 60.3 [17-100]. Todas as amostras foram de indivíduos caucasianos. Os bancos de dados do edifício permitiam identificar e corrigir vários problemas relacionados com a aquisição e preparação da amostra. No nosso caso, os bancos de dados finais incluem 11/18 arquivos para maturação dos neutrófilos, 10/18 arquivos para maturação de monócitos e 14/18 para maturação do NRC. Os arquivos que não foram incluídos nos bancos de dados colocados vários problemas técnicos. Os problemas mais comuns de coloração foram observados para CD11b e CD13 em neutrófilos, CD300e e HLADR em monócitos, e CD71 e HLADR no CRN. exportação de dados podem ser uma fonte de erros; as mais frequentes em nosso dataset foi a ausência de FSC-H em arquivos exportados e as inversões do FSC-W com FSC-H que às vezes ocorrem na exportação de arquivos DIVA8. A avaliação de novos casos de citopenias suspeitos de serem MDS contra a maturação mieloide Normal que bancos de dados permitem a identificação da expressão anormal de antígenos de maturação da linhagem neutrófilos (Figura 4), monócitos (Figura 5 ) e o NRC (Figura 6), mesmo em casos sem anormalidades citológicas ou citogenéticas (Figura 7). Caso contrário, utilizando o software de aquisição de rotina, tais como Diva, estes seriam difíceis ou impossíveis de realizar.
Figura 4 : Análise de citometria de fluxo representativo dos neutrófilos em um caso MDS del(7). (A) diagrama em the normalizado maturação as diferenças, a área cinza corresponde a expressão normal dos antígenos resultante da análise dos 11 arquivos normais incluídos no banco de neutrófilos (2SD median±). A expressão anormal de vários antígenos foi observada quando comparado com o caso do MDS del(7) contra Neutrophils_NM de banco de dados (n = 1 e n = 11 amostras controles normais). (B) parâmetro banda maturação diagramas permitem que as comparações entre a intensidade mediana de expressão de cada marcador em diferentes estágios de maturação (linhas contínuas completa) e curvas de 2SD calculado para 11 casos BM normais incluído no banco de dados (linhas tracejadas contínuas). Anormalidades fenotípicas de neutrófilos observados em um caso, MDS del(7) banco de maturação Normal dos neutrófilos são as seguintes: aumento global da expressão de CD34, ligeiro aumento da expressão de CD11b em neutrófilos imaturos (fase 2), reduzida expressão de CD13 em neutrófilos imaturos (estágios 1-3) e ligeiro aumento da expressão de CD16 sobre as duas primeiras fases de maturação dos neutrófilos, seguida por aumentos moderados de expressão CD16 sobre os neutrófilos maduros (estágios 4-5). (C) mostra que o ponto correspondente parcelas como visualizados no software DIVA. Avaliação de imagem usando o software DIVA permite a identificação de um pequeno número de anormalidades fenotípicas neste caso MDS: um aumento percentual de CD34 + CD13 + precursores e o downregulation de expressão de CD13. A expressão anormal de CD16 é difícil observar neste tipo de representação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Análise de citometria de fluxo representativo de monócitos em um caso MDS del(7). (A) as diferenças de maturação Normalized diagrama oferece uma total vista da expressão do antígeno em vários estágios de maturação de linhagem monocítica célula. A área cinza corresponde a expressão normal dos antígenos resultante da análise de 10 arquivos normais incluídos no banco de dados monocítica (mediana ± 2SD). A expressão anormal de vários antígenos excede 2SD, mas para alguns marcadores, tais como CD35 e HLADR, excede 4SD. (B) em the parâmetro banda maturação diagramas, as anomalias fenotípicas de células monocítica, observadas em um del(7) SMD caso quando comparado com monócito Normal de maturação de banco de dados (n = 1 e n = 10 exemplos de controles normais) são os seguintes: diminuiu a expressão de CD45 durante estágios 1-4 de células monocítica, de CD117 em fases 1-2 de precursores monocítica e HLA-DR em geral. A expressão aumentada de CD35 nas 3 primeiras fases de maturação das células monocítica foi a anormalidade mais significativa para esta linhagem. (C) a DIVA dot terrenos que permitem a avaliação das células monocítica em um único ponto BM. (D) a DIVA normal parcelas que permitam a avaliação das células monocítica em del(7) caso MDS. Avaliação de imagem usando o software DIVA permite a identificação de anormalidades fenotípicas dois neste caso MDS: a expressão diminuída de HLA-DR e o aumento da expressão de CD35 numa parte dos precursores monocítica (população vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Análise de citometria de fluxo representativo de hemácias nucleadas em um caso MDS del(7). (A) as diferenças de maturação Normalized diagrama oferece uma total vista da expressão do antígeno em diferentes estágios de maturação de linhagem do NRC. A área cinza corresponde a expressão normal dos antígenos resultante da análise dos 14 normais arquivos incluídos no banco de maturação Normal NRC (mediana ± 2SD). A expressão anormal de vários antígenos excede 2SD, mas para alguns marcadores, tais como CD34, CD117, CD71 e CD105, excede 4SD. (B) em the parâmetro banda maturação diagramas, as anomalias fenotípicas observadas em um caso de del(7) SMD quando comparado com o banco de dados do NRC Normal maturação (n = 1 e n = 14 exemplos de controles normais) são os seguintes: reduzida expressão de CD34 nas duas primeiras fases de maturação, CD117, CD105, CD71 e HLA-DR em fase 1 de precursores de linhagem eritroide. Avaliação de imagem usando o software DIVA permite a identificação de CD71 expressão anormal em células eritroide neste caso do MDS, mas outras modificações não são detectáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Análise de citometria de fluxo representativo de neutrófilos, monócitos e CRN em fase inicial caso MDS sem displasia morfológica e sem aberrancies citogenéticas. (A), a distribuição das células imaturas e maduras dentro de estágios de maturação diferentes para as três linhagens mieloides: neutrófilos, monócitos e CRN. Observou-se um aumento do número de monócitos maduros (etapa 5) e a diminuição de células imaturas monocítica (etapa 2 de maturação) ligeiramente. (B) a maturação normalizado diferenças o diagrama mostra que as anomalias fenotípicas excederem 2SD, mas para CD34, CD117, CD11b, CD16 e HLADR, eles são mais elevados em 4SD. anormalidades fenotípicas observadas para os neutrófilos são as seguintes: ligeiramente aumento de SSC valores em precursores de neutrófilos imaturos (fase 1), diminuição da expressão de CD34 (fase 1), de CD117 (fase 1), de CD16 (fase 1 - 2) e de HLADR (estágios 1-3 de maturação). Observou-se um aumento da expressão de CD11b na precursores de neutrófilos imaturos (fase 1). (C) o normalizado maturação diferenças diagrama mostra que as mais importantes anomalias fenotípicas observadas para a linhagem monocítica (superior a 10SD) são aumento da expressão de CD35 e precoce aquisição de CD300e sobre o imaturo monocítica precursores. Outras anormalidades fenotípicas observadas na linhagem monocítica são as seguintes: diminuição do FSC e CCD em monócitos mais maduros (estágios 3-5) e ligeira diminuição da expressão de CD14 em estágios de 2-3 de células monocítica. (D) as diferenças de maturação Normalized diagrama e os diagramas de maturação de banda parâmetro mostra que o mais importantes anormalidades fenotípicas observadas para o NRC são: aumento da expressão de CD117 (superior a 10SD) em estágios de 2-3 do NRC maturação, aumentou a expressão do CD34 (superior a 5SD) durante o segundo estágio de maturação do NRC e diminuição da expressão de CD36 sobre os primeiros precursores eritroide (estágios 1-3). Além disso, o CCD na NRC imaturo é menor do que sobre as contrapartes normais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, a interpretação do significado das diferenças entre a expressão do antígeno em configurações patológicas e contrapartes normais permite a "quantificação" destas anomalias, com a identificação daqueles que são discriminantes para um grupo dos casos. Isto também tornou possível para classificá-las com base na importância para efeitos de seguimento. Neste estudo, todos os 7 casos de desordens hematológicas com características de displasia mieloide (4 MDS, 1 AML, 1 Leucemia mielomonocítica crônica e 1 síndrome mieloproliferativa JAK2 positivo) foram classificados como anormais quando comparado com os bancos de dados NBM. Além disso, a avaliação no banco de dados Neutrophils_NM eliminou a suspeita de displasia mieloide em 7 casos com tóxico, inflamatória, autoimune anemia hemolítica e anemia de doença renal crônica. A avaliação no banco de dados Monocytes_NM eliminou a suspeita de displasia mieloide em 4 casos com Púrpura Trombocitopênica Idiopática (PTI), enquanto a avaliação contra NRC_NM permissão para diferenciação em 3 casos, 2 de anemia inflamatória e 1 do ITP. O BM aspira dos pacientes em remissão completa após tratamentos de tumores sólidos ou linfoma foram dentro 2 SD de mediana os bancos de dados normal para todas as três linhagens e, portanto, essas amostras pode ser alternativas para amostras de doadores saudáveis BM.
Figura 1 : Estratégias de análise para a linhagem de células neutrófilos. (A) seleção de CD34 + CD117 + HLADR + baixos progenitores CD10 - CD13 + CD11b-neutrófilos, realizada pelo cruzamento de sete portões como retratado no A1. A próxima etapa de maturação, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores dos neutrófilos baixas foi escolhida usando uma interseção de seis portões, como retratado no A2. Os neutrófilos mais maduros finalmente são identificados usando uma interseção de quatro portões que permitem a discriminação de CD45dim SSCint-Oi CD117-HLADR-células (A3). A maioria dos marcadores de discriminante para linhagem neutrófilos foram CD34, CD117, CD11b e CD16. Juntamente com CD13, esses parâmetros permitem a identificação de cinco subpopulações: CD34 + progenitores (CD34 +, CD117 + CD13 +baixo CD11b - CD16-) (azul escuro); CD34 - CD117 + CD13 +Oi CD11b-CD16-neutrófilos precursores (azul); CD34 - CD117 - CD13 +baixo CD11b-CD16-neutrófilos (3rd etapa de maturação, luz-azul); CD34 - CD117 - CD13 +baixo CD11b + CD16 +baixo neutrófilos (4th etapa de maturação, rosa); neutrófilos maduros (CD34 - CD117 - CD13 +Oi CD11b +Oi CD16 +Oi; violeta). Cada círculo colorido representa a mediana de uma subpopulação para o marcador de interesse de uma amostra (B). (C) exibe a distribuição homogênea dos parâmetros testados durante a maturação de células neutrófilos, quando comparado com 2 SD do banco de maturação normal (n = 11). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Estratégia de análise para monócitos. Identificação de células de linhagem monocítica (CD117 + CD64 + HLADR + Oi) é executada usando uma interseção de quatro portas (A). Mais discriminante marcadores de linhagem monocítica foram CD14, CD300e (IREM2), CD35 e HLA-Dr. junto com CD117, esses parâmetros permitem a identificação de três subpopulações: CD34 - CD117 +baixo/ - HLADR +Oi CD35 - CD14 - CD300e - (vermelho); CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +med CD14 +med CD300e - (laranja); maduras monócitos CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +Oi CD14 +Oi CD300e + (verde) (B). (C) exibe a distribuição homogênea dos parâmetros testados durante a maturação de células monocítica quando comparado com 2 SD do banco de maturação normal (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Estratégias de análise para CRN. (A) a identificação de CD34 + explosões eritroide comprometida foi realizada usando uma interseção de sete portões que permitem a seleção de CD34 + CD117 + eritroide progenitores (A1). O CRN mais maduros é identificados usando um cruzamento de cinco portas (A2). Exclusão das plaquetas (CD36 + Oi SSClow células) do NRC população é necessária (A2). A maioria dos marcadores de discriminante para linhagem de célula eritroide foram CD34, CD117, CD71 e CD105. Juntamente com CD33, esses parâmetros permitem a identificação de três subpopulações: CD45 +baixo CD34 +, CD117 + HLADR +med CD71 +med CD36 +med CD105 +Oi (vermelho); CD34 - CD117 + HLADR +baixa CD71 +Oi CD36 +Oi CD105 +Oi NRCs (2nd etapa de maturação, rosa); CD34-CD117-HLADR-/ +baixo CD71 +Oi CD36 +med CD105 +baixo/-CRN (mais maduro CRN; rosa salmão) (B). (C) exibe a distribuição homogênea dos parâmetros testados durante a maturação do NRC quando comparado com 2 SD do banco de maturação normal (n = 14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: lista de reagentes de anticorpos conjugados a fluorocromo usado para configurar as matrizes de compensação de fluorescência com suas populações de referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Tabela 2: Combinação e quantidades de anticorpos utilizados para avaliação da maturação das células neutrófilos, monócitos e eritroide em BM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Arquivo complementar 1: Monocytes_Maturation.inp por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 2: Monocytes_NM_GMFF.CYT Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 3: Neutrophils_Maturation.inp Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 4: Neutrophils_NM_GMFF.CYT Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 5: NRC_Maturation.inp Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 6: NRC_NM_GMFF.CYT Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A qualidade do aspirado BM poderia impactar os resultados finais. A hemodiluição do aspirado BM pode distorcer a distribuição de células em diferentes estágios de maturação devido à ausência dos progenitores ou precursores. Provavelmente, empregar um granel lise método pode ajudar na normalização da BM aspirados por hemodiluição em análises de fluxo cytometric. Além disso, os passos críticos para a avaliação da displasia mieloide BM por citometria de fluxo são o exemplo de processamento e coloração, aquisição de dados e interpretação2,3. A amostra de processamento e coloração deve ser realizada até 72 h após a colheita do BM. Os dados devem ser adquiridos, de preferência, imediatamente depois da coloração ou armazenam as amostras em 4 ° C, protegido da luz, para não mais de 1h até medir no citômetro de fluxo. A interpretação orientada por banco de dados evita a avaliação subjetiva de maturação de células mieloides BM.
As combinações de anticorpos e a preparação da amostra foram amplamente em conformidade com os procedimentos de EuroFlow9,10. A diferença em comparação com o painel do EuroFlow foi que todos os anticorpos exceto CD300e foram fornecidos por BD Bioscience. A padronização de citometria de fluxo, foi possível obter dados com altos níveis de reprodutibilidade11, mas isso implica um grupo trabalhando na padronização de painéis em questão. No nosso grupo, a padronização de SSC continua a ser uma área a ser melhorado. A questão principal sobre bancos de dados MFC de construção é o processo de coloração. A distribuição inicial dos anticorpos não-espinha dorsal na FACS tubos antes de adicionar as quantidades iguais de mistura amostra-espinha dorsal evita repetir a espinha dorsal de coloração em caso de eventuais erros na distribuição de outros anticorpos não-espinha dorsal. Além disso, para superar a coloração problemas lá são duas possibilidades: aumentar o tempo de incubação de anticorpos de 15 a 30 minutos, ou usar os anticorpos recombinantes, que fornecem maior reprodutibilidade, de acordo com as indicações do fabricante especificações de12. A análise foi realizada em conformidade com dados recentemente publicados13,14,15. No que se refere a análise de monócitos, frequentemente observamos a ausência de CD34 + CD117 - monocítica precursores, como foi noticiado anteriormente pelo Shen et al 16. por esta razão, nós eliminamos da estratégia de análise um portão complementar para isolamento desta população específica. A interseção dos portões, permitindo o isolamento de CD64 + F HLADR + F/int e CD117 + /-inclui os precursores imaturos (CD117 + CD34 + baixo /-) e os monócitos mais maduros.
A avaliação de novos arquivos FCS em comparação com um banco de dados contribui para um objectivo mais, padronizado de interpretação de dados e análise e evita interpretações do reconhecimento de padrões so-called, que é difícil padronizar3. A quantificação da amplitude de anormalidades fenotípicas em comparação com os bancos de dados normais torna possível classificar estas anomalias, que podem ajudar a melhorar as pontuações do MFC para o diagnóstico MDS. Além disso, este método permite a identificação precisa das anomalias fenotípicas imaturo CD34 + e/ou CD117 + precursores e em células mais maduras, que não são evidentes quando usando as estratégias de análise atual no software de aquisição. Este método é relevante no diagnóstico de casos MDS que fazer ou não têm anormalidades morfológicas evidentes, ou que faça ou não faça citogenéticas recorrentes aberrancies.
Melhoria da mancha do anticorpo é necessária, e a adição de novos dados normais do BM em bancos de dados é necessário para aumentar a robustez, confiabilidade e sensibilidade da análise. Esse método poderá ser aplicado, a investigação adicional, citopenias de outras causas, ou hematopoiese clonal de potencial indeterminado (CHIP), a fim de identificar as alterações fenotípicas confiantemente relacionadas com processos displásicos.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. O departamento de citometria de fluxo, o laboratório de Hematologia do Hospital da Universidade de Saint-Etienne é um membro do consórcio EuroFlow.
Acknowledgments
Os anticorpos utilizados neste estudo foram fornecidos pela BD Biosciences. Os autores gostaria de agradecer ao seu colega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde o departamento de Biologia Molecular, laboratório de Hematologia, University Hospital de Saint-Etienne, França, que forneceu a perícia para interpretação dos dados NGS para o segundo Caso do MDS. Os autores são gratos a hematologia clínico para seu interesse e envolvimento neste estudo e para os pacientes e doadores saudáveis para o seu acordo em participar deste estudo. Os autores também gostaria de agradecer à Fundação "Les Amis de Rémi" apoio financeiro para publicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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