Summary
Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.
Abstract
Het onvermogen van het repliceren van de vorming van onoplosbare alpha-synuclein (αS) inclusies in celculturen is al jaren een grote beperking in de studie van αS aggregatie in ziekte Parkinson's (PD). Onlangs, heeft de ontwikkeling van nieuwe dierlijke modellen via de exogene inoculatie van hersenen fragmenten van zieke αS transgene muizen of PD-patiënten nieuwe hoop gegeven aan de mogelijkheid van het creëren van meer adequate cel modellen αS aggregatie. Helaas, wanneer het gaat om cellen in culturen, beheer van extracten van de ruwe hersenen niet zo succesvol in muizen is gebleken en de bron van de keuze van exogene aggregaten is nog steeds in vitro voorgevormde αS fibrillen.
We hebben een methode ontwikkeld om de vorming van intracellulaire αS inclusies in primaire neuronen via de exogene administratie van inheemse microsomes-geassocieerde αS aggregaten, een zeer giftig αS-soorten geïsoleerd uit zieke delen van transgene muizen induceren. Dit gedeelte van αS aggregaten die is gekoppeld aan de microsomes vesikels, is efficiënt geïnternaliseerd en induceert de vorming van intracellulaire insluitsels positief voor geaggregeerde en gefosforyleerd αS. Ten opzichte van in vitro-voorgevormde fibrillen die zijn gemaakt van recombinante αS, onze methode is sneller en garanties dat het pathogene zaaien is gemaakt met authentieke αS aggregaten uit zieke diermodellen van PD, het nabootsen van meer nauw het type insluitsels verkregen in vivo. Dientengevolge, is de beschikbaarheid van weefsels rijk aan αS insluitsels verplicht.
Wij zijn van mening dat deze methode voor een veelzijdige cel-gebaseerde model zorgt voor het bestuderen van de microscopische aspecten van αS samenvoeging en de aanverwante cellulaire pathofysiologie in vivo en een uitgangspunt voor de invoering van nauwkeuriger en geavanceerde cel zullen paradigma van PD.
Introduction
Accumulatie van eiwithoudende insluitsels van alpha-synuclein (αS) is een prominente en belangrijke functie van Parkinson's ziekte (PD) en alpha-synulceinopathies1. Helaas, Hoewel diermodellen kunnen zorgen voor een voldoende cellulaire en biochemische omgeving om de aggregatie stappen die nodig zijn voor de vorming van eiwitten fibrillen2, repliceren vorming van complexe Lewy Body (LB)-zoals aggregaten in celculturen is moeilijk en uitdagend.
Hier beschrijven we een methode om de vorming van αS insluitsels, vergelijkbaar met eiwit-aggregaten verkregen in diermodellen en PD-patiënten, in gekweekte cellen, met behulp van hersenen geïsoleerd muis primaire neuronen. Ons protocol is gebaseerd op de exogene administratie van microsomes-geassocieerde αS aggregaten geïsoleerd van αS symptomatisch (Tg) transgene muizen te muis hippocampal of corticale neuronen van de primaire. Deze methode maakt gebruik van het vermogen van het verspreiden en vermeerdering van αS giftige soorten die, wanneer toegevoegd aan het kweekmedium, kunnen worden geïnternaliseerd, en leiden tot de vorming van volwassen αS-positieve aggregaten3,4, 5,6,7,8.
Oorspronkelijk, standaard methoden om te verkrijgen van de vorming van αS fibrillen in celculturen waren gebaseerd op de overexpressie van het overeenkomstige αS cDNA via de reguliere transfectie protocollen of virale-gemedieerde infectie9. Terwijl in het eerste geval verkrijgen van LB-achtige αS aggregaten toevallig, waren lage efficiëntie toonde, en afhankelijk van het celtype, het tweede protocol heeft geleid tot de vorming van onoplosbare fibrillen, met inbegrip van ultrahoog moleculair gewicht (HMW) soorten in 24-48 h na infectie 10. in deze methoden, de vorming van aggregaten was waarschijnlijk te wijten aan een buitensporige en onevenwichtig in αS eiwit bedrag dat wordt onoplosbaar in plaats van een pathologische conversie van de αS conformatie die aggregatie dicteert. In plaats daarvan, de techniek die wij hier voorleggen verandert niets aan het niveau van de expressie αS maar wijdverbreide eiwit aggregatie als gevolg van de internalisering van exogene fibrillen induceert. Bovendien, de vorming van αS aggregaten door middel van de toediening van exogene fibrillen is een langdurig proces dat vereist van dagen of weken tot uitputtende toestaan van ons om te studeren vroeg en intermediaire fasen van αS insluitsels vorming in een time-lapse mode en te correleren met de cellulaire biochemische veranderingen. Onze methode is dus een waardevolle toepassing om cellulaire modellen van αS aggregatie die nuttig zijn om te studeren αS fibril formatie microscopisch ten opzichte van cellulaire pathofysiologie.
Daarnaast hoewel administratie van ruwe hersenen van zieke αS (Tg) Transgenic muizen11,extracten12 of menselijke PD hersenen-6,13 in staat is voor het opwekken van αS afzetting in GS of wild-type (WT) dieren, toepassing de dezelfde procedure celculturen heeft niet bewezen succesvol te zijn zo, mogelijk vanwege de lage hoeveelheid aggregaten in de gebruikte monsters en het ontbreken van een standaardprocedure te isoleren van inheemse αS giftige soorten14. Vanwege dit, in vitro voorgevormde fibrillen (PFFs) van αS zijn de bron van de aggregaten van keuze tot nu voor de inductie van αS inclusies in cellen en diermodellen3,4,6,7 ,15,16. Met onze protocol, echter, laten we zien dat een microsomes-geassocieerde αS geaggregeerde soorten geïsoleerd van αS GS muizen efficiënt accumulatie van intracellulaire LB-achtige αS inclusies in primaire neuronen kan veroorzaken.
In ons lab zijn microsomes-geassocieerde αS geaggregeerde soorten geïsoleerd van het ruggenmerg (SpC) weefsel van de zieke GS muizen die menselijke αS-gen uitdrukt A53T onder de controle van de muis prion-eiwit (PrP) promotor [Prp menselijke A53T αS GS muizen, lijn G2-317]. Deze muizen Toon een leeftijd-afhankelijke neurodegeneratieve fenotype met robuuste motor dysfunctie en vorming van insluitsels in het centrale zenuwstelsel gemaakt van phosphorylated, ubiquitinated en onoplosbare αS, beginnen na 9 maanden oud. Wanneer motorische dysfunctie wordt weergegeven, wordt het fenotype snel evolueert naar verlamming, vanaf achterste ledematen, die tot de dood in 2-3 weken leidt. Accumulatie van αS aggregaten parallellen manifestatie van de ziekte. Muizen opgeofferd aan het begin van de motorische dysfunctie betrachten een robuuste αS aggregatie in de SpC, hersenstam en kleine hersenen. Er is geen behoefte om te wachten tot verlamming wordt ingesteld op het offeren van de muis. Presymptomatisch muizen zijn genomen op 9 maanden oude dieren die motor disfunctie niet weergeven.
Protocol
Het gebruik van WT en Tg dieren werd goedgekeurd en volledig door de nationale en internationale wetten voor laboratorium dierenwelzijn en experimenten (EEG Raad Richtlijn 86/609/EEG, 12 December 1987 en richtlijn 2010/63/EG, 22 September 2010) in acht genomen. Alle protocollen die zijn beschreven in dit document richtsnoeren dierenverzorgers van onze instelling.
1. isolatie van Microsomes-geassocieerde αS aggregaten van zieke A53T αS GS muizen
- Bereiden de homogenisering buffer die is samengesteld uit sacharose 250 mM, 20 mM HEPES 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM EDTA en 1 x fosfatase/protease-remmers. Houd de buffer op ijs.
- Meng het verse of bevroren weefsel in een 1:10 (w/v) omvang van de ijskoude homogenisering buffer met behulp van een Teflon stamper homogenizer, met 10-15 slagen.
- Eerste homogenaat (1-2 mL) overbrengen in een microcentrifuge buis en centrifuge op 1000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C met behulp van een gekoelde centrifuge om kernen en ongebroken cellen in de resulterende pellet (P1). Gooi P1.
- Het supernatant (S1) overbrengen in een schone microcentrifuge buis en centrifugeer S1 bij 10.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 ° C met behulp van een gekoelde centrifuge met het oog op het tweede supernatant (S10) en de pellet (P10).
Opmerking: P10 is een ruwe membraan pellet die mitochondriën en synaptosomes bevat. Gooi P10. - Het supernatant (S10) overbrengen in een fles van polycarbonaat (> 1 mL) en centrifugeer S10 bij 100.000 × g, gedurende 1 uur bij 4 ° C met behulp van een ultracentrifuge en een vaste hoek rotor (90 Ti).
Opmerking: De bovendrijvende substantie is de Fractie van de zuivere cytosol terwijl de pellet, P100, microsomes-geassocieerde αS aggregaten bevat. - Resuspendeer de pellet P100 met 500 µL van de homogenisering buffer. P100 overbrengen in een schone microcentrifuge buis en centrifuge op 10.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer P100 met 100 µL van homogenisering buffer.
Opmerking: Dit gedeelte is de microsomes-geassocieerde αS aggregaten. - Bewerk ultrasone trillingen ten monsters voor 2 s op ijs [set uitgangsvermogen 1 watt (RMS)]. Winkel monsters bij-80 ° C.
- Overmorgen, bepaalt het bedrag van de eiwitten met behulp van BCA analyse.
2. westelijke vlek
Opmerking: Biochemische karakterisering van de microsomes-geassocieerde αS aggregaten wordt geëvalueerd door de Western Blot.
- Een kleurovergang 4-20% Tris-glycine polyacrylamidegel gegoten op een verticale elektroforese apparaat.
- Laden 1 microgram van microsomes-geassocieerde αS breuken, opgelost in de denatureren monster buffer.
- Een ander goed, geladen 5 µL van eiwit standaard markering.
- Stel de gel bij 100 V in een Tris/glycine/SDS buffer uitvoeren totdat eiwit marker het einde van de gel bereikt.
- Eiwitten overbrengen in een membraan van de nitrocellulose met behulp van een fundamentele carbonaat-buffer (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, 20% Methanol) O/N bij 4 ° C, bij 200 mA, constante.
- Blokkeren van het membraan met PBS-nonionic oppervlakteactieve stof 0.05% (PBS-T) met 5% non-fat droge melk op een roteerschudapparaat gedurende 30 minuten op RT.
- Kort, spoel het membraan met PBS-T.
- Incubeer het membraan met Syn-1 (1:5, 000) of pSer129-αS antilichaam (1:5, 000) in 2,5% non-fat droge melk in PBS-T, O/N bij 4 ° C op een roteerschudapparaat.
- Wassen het membraan gedurende 10 minuten op RT met PBS-T op een roteerschudapparaat.
- Incubeer het membraan met anti-muis of anti-konijn HRP-geconjugeerde secundair antilichaam (1:3, 000) in 2,5% non-fat droge melk in PBS-T voor 1 h op RT.
- Wassen het membraan gedurende 10 minuten op RT met PBS-T op een roteerschudapparaat. Herhaal 3 x.
- Het verkrijgen van het signaal via de reguliere Chemoluminescentie-kits.
3. primaire neuronale culturen
Opmerking: Primaire neuronale culturen waren bereid uit de WT pasgeboren (P0) muis hippocampus of cortex (lijn C57BL/6). De gehele procedure, minus de stappen centrifugeren wordt uitgevoerd onder een cel cultuur motorkap, onder steriele omstandigheden.
- Coverslips (18 mm Ø) met 65% salpeterzuur-oplossing voor ten minste 12 uur behandelen op RT.
- Verwijder de salpeterzuur. Spoel de coverslips twee keer met PBS 10 x en meerdere malen met gedestilleerd water.
- Plaats coverslips in 24-well gerechten en hen jas met poly-D-lysine (0,1 mg/mL in steriel gedistilleerd water of PBS 1 x) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Verwijderen van poly-D-lysine en wassen van de coverslips drie keer met gedestilleerd water. Bewaar ze bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Euthanaseren van de muisknop pups door onthoofding en scheiden van de hoofden van de organen. Plaats de hoofden op gerechten en de huid zachtjes te ontleden.
- Met behulp van fijn schaar, door de schedel te openen door een insnijding aan de basis van de hersenen. De twee helften van de schedels te scheiden en zorgvuldig verwijderen.
- Met behulp van Tang, knijp uit de hersenen van de bases en isoleren van de cortex en de hippocampus. Ze vervolgens overbrengen naar twee aparte gerechten met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) medium dat 1% penicilline/streptomycine.
- Herhaal stap 3.6 en 3.7 voor elk dier. Wees ervan bewust dat het hele proces niet meer dan 30-45 min moet.
- Mince de verzamelde weefsels en ze vervolgens overbrengen naar twee 50 mL conische buizen (één voor hippocampus) en één voor cortex met 10 mL HBSS medium dat trypsine 0,1%. Incubeer in het waterbad gedurende 7 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Geen agitatie is vereist. - Voeg 1 mL DMEM met 10% foetale runderserum (FBS) en 10 µg/mL DNase tot het homogenaat trypsine activiteit te blokkeren.
- Centrifugeer het resulterende gedissocieerde weefsel bij 200 × g gedurende 5 min op RT op een centrifuge en verwijder de bovendrijvende substantie.
Opmerking: De pellet vertegenwoordigt de cellen van het weefsel ontleed. - Resuspendeer de cellen in het medium van de beplating, met 2% B27, 2 mM glutamine, 6 mg/mL glucose, 10% FBS, 12,5 µM glutamaat en 10 µg Fe/mL gentamicine.
- Plaat losgekoppeld neuronen op poly-D-Lysine coverslips in 24 goed platen volgens de verhouding: 1 cortex/12 wells en 1 hippocampus/6 wells, wat resulteert in ongeveer 150.000/200.000 cellen per putje. Handhaven van de cellen in de incubator bij 37 ° C.
- Overmorgen (dag in vitro, DIV 1), wordt het medium plating vervangen door het medium met 2% B27, 10 µg/mL gentamicine en 2 mM glutamine.
- Op div-2, 1/3 van medium verwijderen en toevoegen van 1/3 van het verse medium met 2,5 µM cytosine arabinoside voor 48 h ter beperking van de gliale verontreiniging.
- Neuronen bij 37 ° C te handhaven en de helft van het medium om de drie dagen vervangen.
4. neuronen behandeling
Opmerking: De behandeling is verricht op div-7. Alle stappen zijn op grond van een cel cultuur kap onder steriele omstandigheden geschiedt. Een voorbeeld van de dichtheid van de corticale neuronale cultuur bij DIV 7 wordt geïllustreerd in Figuur 1.
- Zwembad microsomes-geassocieerde αS aggregaten uit het ruggenmerg van drie verschillende zieke GS muizen verkregen hebben een 1 µg/µL-oplossing, met behulp van de oorspronkelijke homogenisering buffer voor de verdunning.
- 1/3 van het medium verwijderen en vervangen het zachtjes met het verse medium met 2% B27, 1 x gentamicine en 2 mM glutamine.
- 1 µg gebundelde microsomes-geassocieerde αS aggregaten toevoegen aan het medium van de cel. Retourneren van neuronen in de incubator bij 37 ° C.
- Om de 3 dagen voor 1 week, voeg 1/3 van verse medium. Het medium niet vervangen. Gewoon toevoegen.
- Na 1 week voor behandeling, 1/3 van het medium verwijderen en vervangen het zachtjes met het verse medium met 2% B27, 10 µg/mL gentamicine en 2 mM glutamine. Herhaal elke 3 dagen.
- Fix neuronen na 2 weken van de behandeling (DIV 21).
5. immunofluorescentie
- Herstellen van neuronen met 2% paraformaldehyde in PBS 1 x en 5% sacharoseoplossing gedurende 15 minuten op RT zonder schudden, onder een chemische stof fume hood.
- Verwijder de fixing oplossing. Kort, wassen met PBS 1 x, 3 keer.
Opmerking: Alle de stappen wassen voorzichtig omdat primaire neuronen niet stevig aan poly-lysine coverslips vasthouden doen. - Permeabilize van neuronen met 0,3% van nonionic oppervlakteactieve stof in PBS 1 x voor 5 min op RT.
- Kort, wassen met PBS 1 x, 3 keer.
- Incubeer neuronen met 3% FBS in PBS 1 x voor 30 min op RT, voor het blokkeren van aspecifieke bandplaatsen, op een roteerschudapparaat.
- Incubeer neuronen met passende primair antilichaam opgelost in 3% FBS in PBS 1 x, O/N bij 4 ° C op een roteerschudapparaat.
Opmerking: syn303 (1:1, 000), mouse αS (1:200), pser129-αS (1:1, 000) en Tau (1:10, 000) antistoffen werden gebruikt. - Verwijder de antilichaam-oplossing en wassen, kort, met PBS 1 x, 3 keer.
- Incubeer neuronen met passende fluorescerende secundair antilichaam opgelost in 3% FBS in PBS, gedurende 1 uur bij RT in het donker op een roteerschudapparaat.
- Verwijder de antilichaam-oplossing en wassen, kort, met PBS 1 x, 3 keer.
- Vlekken van neuronen met de oplossing van de DAPI (0,1 µg/mL in PBS 1 x) gedurende 15 min. op RT in het donker op een roteerschudapparaat.
- Verwijder de antilichaam-oplossing en wassen, kort, met PBS 1 x, 3 keer.
- Mount coverslips op een dia met behulp van antifade montage medium.
Representative Results
Volgens het protocol beschreven en wordt samengevat in Figuur 2, we gezuiverd microsomes-geassocieerde αS aggregaten van drie zieke A53T αS GS muizen (Figuur 3). Microsomes zijn ruwe membraan pellet breuken die het endoplasmatisch reticulum, Golgi en kleine synaptische vesikels bevatten. De mate van zuiverheid van de microsomale pellet in vergelijking met andere fracties was eerder geëvalueerd aan de hand van specifieke organel markeringen18.
Het geïsoleerde Biochemische karakterisering van αS aggregaten wordt beoordeeld via denatureren SDS-pagina, gevolgd door incubatie met Syn-1 of gefosforyleerd αS op Serine 129 (pSer129-αS) antilichaam. Vergeleken met presymptomatisch (PreS) en leeftijd-matched niet-Tg (nTg) muizen, microsomes geïsoleerd van zieke muizen co neerslag met αS aggregaten. Microsomes-geassocieerde αS soorten tonen de typische kenmerken van αS aggregaten, zoals de accumulatie van HMW wasmiddel-resistente soorten en fosforylering bij serine 12919 en C- en N-terminal afgekapt fragmenten (voor een volledige karakterisering van microsomes-geassocieerde αS aggregaten Zie referentie18,20,21). Dit zijn fundamentele eisen aangezien monomeer αS doet niet efficiënt krijgen geïnternaliseerd en niet toe αS afzetting7,15,22 brengt er. Het is belangrijk niet te Gebruik wasmiddel (Ionische of niet-ionogene) te resuspendeer P100 pellets omdat het schadelijk voor cellen zijn kan. Ook, om te voorkomen dat de variabiliteit van de steekproef, zal microsomes-geassocieerde αS aggregaten van drie verschillende zieke muizen voor neuronale behandeling worden samengevoegd.
Toediening van 1 microgram van gebundelde microsomes-geassocieerde αS aggregaten van zieke A53T muizen aan het kweekmedium van corticale of hippocampal neuronen induceert de vorming van een tijd-afhankelijke van αS insluitsels, positief voor αS aggregaten-specifieke antilichamen zoals Syn303 (Figuur 4, 5) of pser129-αS (Figuur 5). Na twee dagen (2d) van deze aggregaten worden weergegeven als kleine, verspreide puncta die als meer overvloedig op latere tijdstippen fungeren zal behandeling. Na twee weken, αS insluitsels lijken lang op en oudere kralen-achtige structuren, sterk verspreid over de neuronale culturen, volgend op een neurite patroon en gedeeltelijk samen met presynaptische te lokaliseren en neurites markers (Figuur 5). Af en toe, kunnen nieuw gevormde αS insluitsels mede lokaliseren en vlek het soma cel of bestrijkt het hele proces, lijkend op necrotische neurites worden gezien.
Hoewel microsomes-geassocieerde αS aggregaten breuken efficiënt in neuronale culturen verspreiden kunnen, moet hun bedrag fijn afgestemd op het aantal neuronen verguld (Figuur 1). In feite, meer dan de aanbevolen verhouding, µg microsomes-geassocieerde aggregaten: aantal neuronen, zal induceren vroegtijdige celdood binnen een paar dagen (Figuur 6), terwijl een onvoldoende hoeveelheid microsomes-geassocieerde αS aggregaten tot leiden zal een schaars en verlaagde aantal inclusies na twee weken van de behandeling, vergelijkbaar met wat werd verkregen op vroegere tijdstippen (Figuur 4A).
Figuur 1 . Corticale neuronale culturen. Representatieve afbeelding toont dichtheid bij DIV 7 van corticale neuronale culturen. Beelden werden genomen met een omgekeerde licht microscope, 10 X doelstelling. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Isolatie van microsomes-geassocieerde αS aggregaten van muis SpC. Stroomdiagram van het protocol van de reiniging van microsomes-geassocieerde αS aggregaten van SpC van zieke muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Isolatie van microsomes breuken uit zieke, presymptomatisch A53T αS GS en nTg muizen. Westelijke vlek analyse weergegeven: gezuiverd microsomes-geassocieerde αS aggregaten geïsoleerd uit drie zieke (ziek), presymptomatisch (PreS) en leeftijd-matched nTg muizen. Zieke muizen zijn A53T αS GS muizen die aantonen dat de motor en neurologische dysfunctie, met inbegrip van de accumulatie van αS insluitsels, terwijl presymptomatisch dieren gezond A53T zijn αS Tgs van 9 maanden van leeftijd die geen vertonen nog eventuele pathologie αS gerelateerde fenotype. nTg muizen zijn nestgenoten van zieke muizen die draag niet de αS transgenic en ontwikkelen dus geen αS geïnduceerde pathologie. 1 µg voor elke gezuiverde fracties werden uitgevoerd op een denatureren SDS-pagina, overgedragen op een membraan van het nitrocellulose en uitgewist met Syn-1 of pSer129-αS antilichaam. Alleen microsomes breuken geïsoleerd van zieke muizen ingeperkt HMW wasmiddel-resistente αS aggregaten die waren phosphorylated op serine 129 en toonde C- en N-terminal afkappen. Dit percentage is aangepast van Colla et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Tijd-afhankelijke inductie van αS afzetting na toediening van microsomes-geassocieerde αS aggregaten. (A) immunofluorescentie van primaire hippocampal neuronen behandeld met 1 µg microsomes-geassocieerde αS aggregaten breuken gebundeld van drie verschillende zieke muizen. Neuronen werden vastgesteld op 2 dagen (2d), 1 week (1w) of 2 weken (2w) van behandeling en immunostained met syn303 (S303, 1:1000), een antilichaam specifiek voor geoxideerd en geaggregeerde αS. Cellen werden counterstained met DAPI. Confocale beelden werden genomen met behulp van een laser confocal microscoop, 63 X doelstelling scannen. Schaal bar = 50 µm. (B) kwantitatieve analyse van totale fluorescence, na achtergrond aftrekken, werd gedaan met behulp van de plugin graaf deeltjes van de Image J-software. Waarden zijn genormaliseerd voor het aantal kernen per veld (DAPI-telling) en uitgedrukt als het percentage van het signaal van de fluorescentie S303 op 2D. Waarden worden gegeven als de gemiddelde ± SD (n = 5). ** p < 0.001, *** p < 0,00001, One-way ANOVA, gevolgd door Fisher's LSD post-hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . ΑS intracellulaire insluitsels colocalize met corticale neurites netwerk. Vertegenwoordiger confocal beelden van corticale neuronen behandeld met microsomes-geassocieerde αS aggregaten zieke GS muizen verkregen. Na 2 weken van de behandeling neuronen vaste en dubbele waren gekleurd met aggregaten-specifieke antilichamen [S303 (A, B) of pser129-αS, 1:1,000 (C)] en neurite markeringen [muis αS, 1:200 (A, B) of Tau, 1:10,000 (C)]. Co etikettering van de fluorescerende signalen aangetoond gedeeltelijke co lokalisatie van de nieuw gevormde αS kraal-achtige structuren met het neurites-netwerk. ΑS insluitsels accumuleren soms binnen de neuronale soma (A, B, pijlpunten). Gestapelde afbeeldingen werden verkregen met een laser confocal microscoop, 63 X doelstelling scannen. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Colla et al. 20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Toevoeging van suboptimaal hoeveelheid microsomes-geassocieerde αS aggregaten is giftig voor de neuronen. DAPI kleuring van neuronen behandeld met toenemende concentratie van microsomes-geassocieerde αS aggregaten leidt tot celdood. (A) corticale neuronen werden behandeld met 1, 2 µg microsomes-geassocieerde αS aggregaten geëxtraheerd uit zieke muizen of enige buffer die geen bevat aggregaten (B) en gekleurd met DAPI. Fluorescerende beelden werden verkregen met een epi-fluorescentie Microscoop met behulp van een 20 X doelstelling. Schaal bar = 100 µm.(B) DAPI-positieve cellen werden geteld met de afbeelding J-software. De grafiek toont een daling in het aantal kernen met de toenemende concentratie van microsomes-geassocieerde αS aggregaten toegevoegd aan de neuronale media. Waarden worden uitgedrukt in gewichtspercenten b en worden gegeven als de gemiddelde ± SD (n = 5), *** p < 0,0001, One-way ANOVA, gevolgd door Fisher's LSD post-hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
We beschreven een methode voor vorming van αS inclusies in hersenen-afgeleide primaire neuronale culturen van WT muizen, door de toevoeging van gezuiverde microsomes-geassocieerde αS aggregaten geïsoleerd van αS GS diermodellen.
Kritische stappen van dit protocol zijn de volgende: de verhouding tussen µg microsomes-geassocieerde αS aggregaten/neuronen en de bron van αS aggregaten. Zoals blijkt uit de resultaten-sessie, is het van cruciaal belang voor het optimaliseren van de verhouding van de microsomes-geassocieerde αS aggregaten/aantal neuronen µg omdat werken in suboptimaal voorwaarden tot de vroegtijdige celdood of te zeldzaam intracellulaire aggregatie leiden kan (Zie de Representatieve resultaten sectie). Vanwege dit is het zeer belangrijk om te evalueren van de dichtheid van de neuronale cultuur op div-7 (afgebeeld in Figuur 1) vóór het begin van de behandeling. Bovendien moeten de αS aggregaten gezuiverd worden van zieke αS GS muizen, dwz. uit diermodellen die accumuleren LB-achtige insluitsels gekenmerkt door gefosforyleerd en wasmiddel onoplosbare αS HMW fibrillen.
Eventuele wijzigingen in dit protocol beschouwen het weefsel, bevroren of vers, uit welke microsomes kunnen worden geïsoleerd en het beginbedrag. Terwijl we SpC van GS muizen vanwege het hoge gehalte aan αS onoplosbare aggregaten gebruikt, is het protocol geschikt voor het isoleren van de microsomes-geassocieerde aggregaten van alle weefsels, mits het gebied een hoog gehalte in αS aggregaten heeft. Bevroren monsters kunnen ook worden gebruikt aangezien bevriezing heeft geen invloed op de stappen van de zuivering van microsomes-geassocieerde aggregaten of de aggregaten per se. Terwijl de aanbevolen basisgewicht voor weefsels ongeveer 100-150 mg is, dit protocol is geschikt voor het verkrijgen van microsomes van zo laag als 50 mg van grondstoffen (geen maximum gewicht limiet). In het geval van het bedrag lager is dan 100 mg, zal de homogenisering van de juiste verhouding evenwel 1:20 (m/v) om te hebben van ten minste 1 mL supernatant S10 te laden op de polycarbonaat fles bij de precipitatie van de ultracentrifuge. In feite, laden van volumes van minder dan 1 mL kan leiden tot de ineenstorting van het verlies van buis en monster. Verhogen van het volume van de homogenisering zal leiden tot een meer verdund supernatant, maar de concentratie van de microsomale pellet zal onaangetast blijven.
Een beperking van dit protocol betreft het inefficiënte Kruis-zaaien in de vorming van αS insluitsels die onlangs zijn gemeld in de zaak administratie van αS PFFs van menselijke oorsprong lymfkliertest neuronale culturen in tegenstelling tot de muis αS PFFs24. Aangezien de verhoging van het bedrag van exogene αS fibrillen gegeven aan lymfkliertest culturen kan het omzeilen van dit probleem, raden wij aan fijn afstemmen van de hoeveelheid microsomes-geassocieerde aggregaten in het geval van toediening van fibrillen verkregen uit andere varianten αS of uit verschillende de neuronale culturen muis dan wat we beschreven soorten.
Exogene αS aggregaten toegevoegd aan de cultuur-media kunnen uit verschillende bronnen. In vitro αS PFFs zijn eerder gebruikt als seeding sjabloon van intracellulaire αS aggregaten in celculturen, primaire neuronen en diermodellen3,,7,,8,15. Vergeleken met onze methode waar microsomes-geassocieerde αS aggregaten in enkele uren kunnen worden geïsoleerd, is de vorming van PFFs langdurige en moeizame, waarbij meerdere stappen van zuivering, gevolgd door extra testen om te controleren αS aggregaten confomations25 . Daarnaast PFFs wordt verkregen uit de mens bacteriële-uitgedrukt of muis αS, d.w.z. ontbreekt posttranslationele modificaties van eukaryoten, typische kunnen presenteren verschillende conformaties, met selectieve zaaien en pathogene eigenschappen, volgens de nucleatie protocollen gevolgd (d.w.z. linten vs fibrillen)5,8 leiden tot verschillende resultaten en conclusies. Eenmalige toediening van in vivo gezuiverd αS aggregaten garandeert in plaats daarvan, de overdracht van meer authentiek pathogene sjablonen, nauw het nabootsen van het proces van vorming van αS inclusies in diermodellen en PD-patiënten.
Als een toekomstige toepassing van deze techniek geloven wij dat dit protocol kan met succes worden gebruikt om te isoleren αS pathogene zaden uit het brein van PD-patiënten of andere αS GS diermodellen, mits zieke gebied waaruit microsomes zijn geïsoleerd zijn rijk aan αS insluitsels.
Om onze kennis is dit de eerste methode, waarmee de zuivering van de inheemse giftige soorten αS van in vivo PD modellen te worden gebruikt als sjabloon voor het verkrijgen van de vorming van αS inclusies in primaire neuronen zaaien.
Wij zijn van mening dat deze methode zeer veelzijdig is en een uitzonderlijke cel-gebaseerde model bieden voor het bestuderen van de verschillende aspecten van αS aggregatie en de invloed daarvan op de pathofysiologie van de cel. Omdat de vorming van αS insluitsels vertegenwoordigen een complex proces dat is moeilijk te repliceren in gekweekte cellen geweest, zijn we hoopvol gestemd dat deze model voor geweldige inzichten in acute pathogene mechanismen, moeilijk zorgt te herkennen in chronische en meer uitgebreide systemen zijn zoals diermodellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Italiaanse ministerie van de Universiteit en onderzoek (MIUR) via de carrière reïntegratie subsidie regeling (RLM programma voor Young Researcher) en van de Scuola Normale Superiore. Wij danken Prof Michael Lee van de Universiteit van Minnesota, USA, voor het verstrekken van de menselijke A53T van Prp αS GS muizen, waaruit aggregaten geïsoleerd zijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
