Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.
Abstract
במשך שנים, חוסר היכולת של שכפול היווצרות לא מסיסים אלפא-synuclein (αS) בקהילות תרביות תאים כבר מגבלה גדולה במחקר של צבירת αS פרקינסון (PD). לאחרונה, פיתוח מודלים בבעלי חיים חדשים דרך חיסון אקסוגני תמציות במוח העכברים הטרנסגניים αS חולה או חולי PD נתן תקוות חדשות לאפשרות של יצירת התא יותר הולם, דגמי צבירה αS. למרבה הצער, כאשר מדובר על תאים בתרבויות, הניהול של המוח raw תמציות לא הוכיחה מוצלח כמו עכברים, המקור של בחירה של אגרגטים אקסוגני הוא עדיין במבחנה שהופעתם בהם αS הסיבים.
פיתחנו שיטה כדי לגרום להיווצרות תאיים αS בקהילות נוירונים העיקרי דרך הממשל אקסוגני של אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים αS, זן αS רעיל מאוד מבודד מאזורים נגועים של העכברים הטרנסגניים. זה חלק αS אגרגטים המשויך השלפוחיות המוגלתיות microsomes, ביעילות הפנימו ומשרה היווצרות של הכללות תאיים חיובית מצטברת, phosphorylated αS. בהשוואה במבחנה-הסיבים preformed אשר מורכבים מחומרים αS רקומביננטי, השיטה שלנו היא מהירה, ערבויות כי זריעה פתוגניים הוא עשה עם אגרגטים αS אותנטי מופק ולכוונו מודלים חייתיים של PD, מחקה יותר מקרוב את הסוג תכלילים מתקבל בתוך vivo. כתוצאה מכך, הזמינות של רקמות עשיר תכלילים αS הוא חובה.
אנו מאמינים כי שיטה זו תספק דוגמנית מבוססת תא צדדי כדי לחקור את ההיבטים מיקרוסקופיים של צבירת αS ו ה קשורים פתופסיולוגיה הסלולר ויוו תהיה נקודת ההתחלה עבור הקמת תא מדויקת ומתקדמת יותר הפרדיגמה של המשטרה.
Introduction
הצטברות של הכללות proteinaceous אלפא-synuclein (αS) היא תכונה בולטת וחשובה של פרקינסון מחלת (PD), אלפא-synulceinopathies1. למרבה הצער, בעוד מודלים בעלי חיים מסוגלים לספק סביבה הסלולר וביוכימי מספיק כדי לגרום את השלבים צבירת הכרחי להיווצרות חלבון הסיבים2, שכפול היווצרות של הגוף לוי מורכבים (LB)-כמו אגרגטים תרביות תאים הוא קשה ומאתגר.
כאן אנו מתארים שיטה כדי לגרום להיווצרות תכלילים αS, הדומה אגרגטים חלבון שהושג חייתיים, החולים במחלה, בתאים בתרבית, באמצעות העכבר המוח מבודדים נוירונים העיקרי. פרוטוקול שלנו מבוססת על הממשל אקסוגני של אגרגטים αS microsomes-הקשורים מבודד αS (Tg) סימפטומטי העכברים הטרנסגניים כדי העכבר בהיפוקמפוס או קליפתי נוירונים העיקרי. שיטה זו מנצלת היכולת להתפשט והתפשטות של מינים רעילים αS אשר, לאחר ההוספה למדיום תרבות, הם מסוגלים להפוך הפנימו, לגרום להיווצרות אגרגטים αS-חיובי בוגר3,4, 5,-6,-7,-8.
במקור, בשיטות הרגילות כדי להשיג היווצרות αS הסיבים בתרבויות תא התבססו על ביטוי של cDNA αS התואמת דרך פרוטוקולים תרביות תאים רגילים או זיהום ויראלי בתיווך9. בעוד במקרה הראשון קבלת αS ליברות כמו אגרגטים היו מקרי, הראה יעילות נמוכה, תלויים בסוג התא, פרוטוקול השני הוביל להיווצרות של הסיבים לא מסיסים, כולל זנים משקל מולקולרי גבוה (HMW) ב- 24-48 שעות מפני הידבקות 10. בשיטות אלה, היווצרות של אגרגטים היה כנראה כתוצאה שימוש מופרז, מאוזן בכמות החלבון αS הופך להיות מסיסים ולא המרה פתולוגי של קונפורמציה αS. זה מה מכתיב את צבירת. במקום זאת, הטכניקה שאנו מציגים כאן אינו משנה את רמת הביטוי של αS, אבל המניע חלבון נפוץ צבירה עקב הפנמת האמונה הסיבים אקסוגני. יתר על כן, היווצרות של אגרגטים αS דרך הממשל של הסיבים אקסוגני הוא תהליך ארוך הדורש ימים או שבועות כדי להיות ממצה שמאפשר לנו ללמוד בשלבים המוקדמים, ביניים היווצרות תכלילים αS אופנה זמן לשגות, כדי לתאם את זה עם שינויים ביוכימיים הסלולר. לכן, השיטה שלנו הוא יישום חשוב ליצירת דגמי הסלולר של מצבור αS כי הם מועילים ללמוד αS מערך fibril ברמה המיקרוסקופית ביחס פתופסיולוגיה הסלולר.
בנוסף למרות הניהול של המוח raw מחלצת αS חולה Transgenic (Tg) עכברים11,12 או אנושי PD המוח6,13 הוא מסוגל לגרום αS התצהיר Tg או פראי-סוג (WT) חיות, יישום של תרביות תאים באותו התהליך לא הוכיחה להיות מוצלחים, ואולי בגלל הכמות הנמוכה של אגרגטים הדגימות בשימוש וחוסר תהליך סטנדרטי כדי לבודד αS יליד מינים רעילים14. מסיבה זו, במבחנה שהופעתם בהם הסיבים (PFFs) של αS היה מקור אגרגטים של בחירה עד עכשיו עבור אינדוקציה של הכללות αS בתאים, חיה מודלים3,4,6,7 15, ,16. עם הפרוטוקול שלנו, עם זאת, אנו מראים αS microsomes-הקשורים מינים צבורים מבודד αS Tg עכברים ביעילות יכול לגרום להצטברות של תאיים כמו LB αS בקהילות נוירונים העיקרי.
במעבדה שלנו, αS microsomes-הקשורים מינים צבורים מבודדים מן הרקמה חוט השדרה (SpC) של העכברים Tg במחלה ביטוי אנושי ג'ין αS A53T תחת השליטה של העכבר פריון חלבון (PrP) ייצוג המקדם [A53T האנושי Prp αS Tg עכברים, קו G2-317]. הצג עכברים אלה פנוטיפ תלויי-גיל ניווניות הכוללת תפקוד מוטורי חזקים, היווצרות תכלילים במערכת העצבים המרכזית עשוי phosphorylated, ubiquitinated, αS לא מסיסים, החל אחרי 9 חודשים של גיל. ברגע בתפקוד מוטורי מופיע, פנוטיפ מתפתחת במהירות לתוך שיתוק, החל מגפיים האחוריים, המוביל אל מותו ב 2-3 שבועות. הצטברות של אגרגטים αS הקבלות גילוי המחלה. עכברים הקריבה מיד עם תחילת תפקוד מוטוריים הצג תואר חזקים של מצבור αS SpC, גזע המוח, מוח מאורך. יש צורך להמתין עד השיתוק להקריב את העכבר. עכברים presymptomatic נלקחים 9 חודשים לבעלי חיים שאינם מציגים בתפקוד מוטורי.
Protocol
השימוש בבעלי חיים WT ו- Tg היה מאושר, נענו מלא על ידי הלאומית, חוקים בינלאומיים עבור רווחת בעלי חיים מעבדה וניסוי (EEC המועצה הוראת 86/609, 12 בדצמבר 1987 ו דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי, 22 בספטמבר 2010). כל הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה פעל בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים של מוסדנו.
1. בידוד של אגרגטים הקשורים Microsomes αS מן A53T חולה αS Tg עכברים
- הכנת המאגר המגון אשר מורכב של סוכרוז 250 מ מ, 20 מ מ HEPES, 10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl2, 2 מ מ EDTA 1 x פוספטאז/פרוטאז-מעכבי. לשמור על המאגר על קרח.
- Homogenize הירוק טרי או קפוא רקמות 1:10 (w/v) נפח של מאגר המגון כקרח באמצעות ציפוי טפלון איחדו מהמגן, במשיחות 10-15.
- העברה הראשונית homogenate (1-2 מ"ל) microcentrifuge צינור ו צנטריפוגה-1000 g × 10 דקות ב 4 ° C בעזרת צנטריפוגה בקירור כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה בגדר וכתוצאה מכך (P1). להתעלם P1.
- להעביר את תגובת שיקוע (S1) צינור נקי microcentrifuge, צנטריפוגה S1 ב g × 10,000 למשך 20 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה בקירור על מנת לקבל את תגובת שיקוע השני (S10) ולא בגדר (P10).
הערה: P10 היא גלולה ממברנה גס המכיל המיטוכונדריה ואת synaptosomes. להתעלם P10. - להעביר את תגובת שיקוע (S10) בקבוק פוליקרבונט (> 1 מ"ל), צנטריפוגה S10-g × 100,000, עבור h 1 ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge של הרוטור זווית קבועה (90 Ti).
הערה: תגובת שיקוע הוא השבר ציטוזול טהור ואילו בגדר, P100, מכיל אגרגטים הקשורים microsomes αS. - Resuspend בגדר P100 עם 500 µL של המאגר המגון. העברת P100 צינור נקי microcentrifuge, צנטריפוגה ב 10,000 × g למשך 20 דקות ב 4 ° C ומפרידה בקירור.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend P100 עם µL 100 המגון המאגר.
הערה: fraction הזה מצרפי הקשורים microsomes αS. - Sonicate דוגמאות עבור 2 s על קרח [פלט ערכת צריכת החשמל 1 וואט (RMS)]. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
- יום אחרי, לקבוע את כמות חלבון באמצעות ניתוח BCA.
2. תספיג חלבון
הערה: איפיון ביוכימי של αS microsomes-הקשורים מצרפי מוערך על-ידי המערב כתם.
- הטלת צבע 4-20% טריס-גליצין לזיהוי ג'ל על מנגנון אלקטרופורזה אנכי.
- לטעון µg 1 αS microsomes-הקשורים שברים, מומס המאגר מדגם denaturing.
- בבאר שונים, טען µL 5 של סמן חלבון סטנדרטית.
- הפעל את הג'ל ב- 100 וולט ב- טריס/גליצין/מרחביות הפעלת מאגר עד סמן חלבון מגיעה לקו הסיום של הג'ל.
- להעביר חלבונים קרום ניטרוצלולוזה באמצעות מאגר בסיסי פחמתי (10 מ מ NaCO3, NaHCO 3 מ מ3, 20% מתנול) O/N ב 4 ° C, 200 mA, קבוע.
- לחסום הקרום עם PBS-nonionic חומרים פעילי שטח 0.05% (PBS-T) עם 5% שומן חלב יבש על תפקודי לב / נשימה למשך 30 דקות ב- RT.
- בקצרה, יש לשטוף את הקרום עם PBS-טי
- דגירה קרום Syn-1 (1:5, 000) או נוגדן pSer129-αS (1:5, 000) ב- 2.5% שומן חלב יבש ב- PBS-T, O/N ב- 4 מעלות צלזיוס על תפקודי לב / נשימה.
- לשטוף את הקרום 10 דקות ב RT עם PBS-T ב- תפקודי לב / נשימה.
- דגירה הקרום עם העכבר אנטי או ארנב אנטי מצומדת HRP משני נוגדנים (1:3, 000) ב- 2.5% שומן חלב יבש ב- PBS-T עבור h 1-RT.
- לשטוף את הקרום 10 דקות ב RT עם PBS-T ב- תפקודי לב / נשימה. חזור על 3 x.
- לקבל את האות באמצעות ערכות chemiluminescence רגיל.
3. ראשי תרבויות עצביים
הערה: תרבויות עצביים העיקרי הוכנו WT היילוד (P0) העכבר ההיפוקמפוס או קליפת המוח (קו C57BL/6). ההליך כולו, מינוס הצעדים צנטריפוגה, מתבצע תחת ברדס התרבות תאים, בתנאים סטריליים.
- מתייחסים coverslips (18 מ מ Ø) עם 65% חומצה חנקתית פתרון לפחות 12 שעות ב- RT.
- הסר את חומצה חנקתית. לשטוף coverslips פעמיים עם PBS 10 x וגם מספר פעמים עם מים מזוקקים.
- הכנס coverslips במנות 24-ובכן, מעיל אותם עם פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל מים מזוקקים סטריליים או PBS 1 x) עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
- להסיר את פולי-D-ליזין ולשטוף את coverslips שלוש פעמים עם מים מזוקקים. לאחסן אותם ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
- המתת חסד הגורים העכבר ע י עריפת ראשו, להפריד את ראשי בין הגופים. להניח את ראשי על מנות ומנתחים בעדינות את העור.
- באמצעות מספריים בסדר, לפתוח את הגולגולת על ידי ביצוע חתך על הבסיסים של המוח. להפריד את שני החצאים של הגולגלות ולהסיר אותם בקפידה.
- באמצעות מלקחיים, לצבוט את המוח של הבסיסים ולבודד על קליפת המוח לבין ההיפוקמפוס. מעבירים לתוך שני כלים נפרדים המכילים בינוני מאוזנת פתרון מלח (HBSS) של האנק המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- חזור על שלבים 3.6 ו- 3.7 עבור כל בעל חיים. להיות מודע כי כל התהליך לא אמור לקחת יותר מ 30-45 דקות.
- מינצ הרקמות שנאספו ולהעביר אותם לתוך שני 50 מ ל חרוט צינורות (אחד עבור ההיפוקמפוס) ואחד עבור קליפת עם 10 מ"ל של מדיום HBSS המכיל טריפסין 0.1%. דגירה באמבט מים במשך 7 דקות ב 37 º C.
הערה: עצבנות לא נדרש. - להוסיף 1 מ"ל של DMEM המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 10 µg/mL DNase homogenate כדי לחסום את פעילות טריפסין.
- Centrifuge את הרקמה dissociated הנוצרת ב g × 200 עבור 5 דקות ב RT-צנטריפוגה ולהסיר את תגובת שיקוע.
הערה: בגדר מייצג את התאים גזור מן הרקמה. - Resuspend התאים במדיום יופיצ, המכיל 2% B27, גלוטמין 2 מ מ, גלוקוז 6 מ"ג/מ"ל, 10% FBS, 12.5 גלוטמט מיקרומטר ו גנטמיצין 10 µg/mL.
- צלחת הפומבית נוירונים על coverslips זכוכית אקרילית-D-ליזין ב 24 צלחות טוב לפי היחס: בארות קליפת 1/12 ווולס ההיפוקמפוס 1/6, וכתוצאה מכך כ- 150,000/200,000 תאים לכל טוב. לשמור על התאים בחממה ב 37 º C.
- יום אחרי (יום במבחנה, DIV 1), החלף את המדיום ציפוי עם המדיום המכיל 2% B27, 10 µg/mL גנטמיצין עד 2 מ מ גלוטמין.
- -DIV 2, להסיר את 1/3 בינוני ומוסיפים 1/3 של המדיום טריים המכילים 2.5 מיקרומטר ציטוזין arabinoside במשך 48 שעות לצמצם את זיהום גליה.
- לשמור על נוירונים ב 37 ° C ולהחליף חצי של המדיום כל שלושה ימים.
4. נוירונים טיפול
הערה: הטיפול בוצע ב-7 DIV. כל השלבים נישאות על ברדס תרבות תא בתנאים סטריליים. דוגמה של תרבות העצבית בקליפת המוח צפיפות-DIV 7 מודגם באיור1.
- בריכת αS microsomes-הקשורים אגרגטים המתקבל חוט השדרה של שלושה עכברים Tg ולכוונו שונים על מנת לקבל פתרון µg/µL 1, באמצעות המאגר המגון המקורי עבור הדילול.
- להסיר את 1/3 של המדיום ולהחליף אותו בעדינות עם המדיום טריים המכיל 2% B27, 1 x גלוטמין גנטמיצין ו- 2 מ מ.
- להוסיף 1 µg αS microsomes-הקשורים במאגר האגרגטים המדיום התא. להחזיר את הנוירונים בחממה ב 37 º C.
- כל 3 ימים בשבוע 1, מוסיפים 1/3 בינוני טריים. מחליף המדיום. רק להוסיף אותו.
- לאחר שבוע של טיפול, להסיר את 1/3 של המדיום ולהחליף אותו בעדינות עם המדיום טריים המכיל 2% B27, 10 µg/mL גנטמיצין עד 2 מ מ גלוטמין. חזור על כל 3 ימים.
- לתקן את הנוירונים לאחר 2 שבועות של טיפול (DIV 21).
5. immunofluorescence
- לתקן את הנוירונים עם 2% paraformaldehyde ב- PBS 1 x ו- 5% פתרון סוכרוז למשך 15 דקות ב RT מבלי לרעוד, תחת חומר כימי מנדף כימי.
- הסר את הפתרון תיקון. בקצרה, לשטוף עם PBS 1 x, 3 פעמים.
הערה: בצע את כל השלבים כביסה בעדינות כי נוירונים העיקרי לא מקל בחוזקה על coverslips זכוכית אקרילית-ליזין. - Permeabilize נוירונים 0.3% nonionic חומרים פעילי שטח ב- PBS 1 x עבור 5 דקות ב- RT.
- בקצרה, לשטוף עם PBS 1 x, 3 פעמים.
- דגירה נוירונים עם 3% FBS ב- PBS 1 x במשך 30 דקות ב- RT, לחסום אתרי קישור לא ספציפי, על תפקודי לב / נשימה.
- דגירה נוירונים עם נוגדן ראשוני המתאים מומס 3% FBS ב- PBS 1 x, O/N ב- 4 מעלות צלזיוס על תפקודי לב / נשימה.
הערה: syn303 (1:1, 000), העכבר αS (1:200), pser129-αS (1:1, 000) וטאו (1:10, 000) נוגדנים שימשו. - הסר את פתרון נוגדן ואת שטיפת, בקצרה, עם PBS 1 x, 3 פעמים.
- דגירה נוירונים עם נוגדן המתאים פלורסנט משני מומס 3% FBS ב- PBS, עבור h 1 ב RT בחושך על תפקודי לב / נשימה.
- הסר את פתרון נוגדן ואת שטיפת, בקצרה, עם PBS 1 x, 3 פעמים.
- כתם נוירונים עם פתרון דאפי (0.1 µg/mL ב- PBS 1 x) למשך 15 דקות ב RT בחושך על תפקודי לב / נשימה.
- הסר את פתרון נוגדן ואת שטיפת, בקצרה, עם PBS 1 x, 3 פעמים.
- הר coverslips בשקופית באמצעות הרכבה antifade בינונית.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול שתוארו לעיל, מסוכמות באיור2, אנחנו מטוהר αS microsomes-הקשורים אגרגטים של שלוש חולות A53T αS Tg עכברים (איור 3). Microsomes הם שברים צניפה גולמי ממברנה המכילים את רשתית תוך-פלזמית גולג'י, הסינפטיות קטן. דרגת טוהר בגדר microsomal לעומת שברים אחרים הוערך בעבר באמצעות סמנים אברון ספציפי18.
מבודדת בעבר, איפיון ביוכימי של אגרגטים αS מוערך באמצעות denaturing מרחביות-דף, ואחריו הדגירה Syn-1 או αS phosphorylated-נוגדן סרין 129 (pSer129-αS). לעומת presymptomatic (פרס) ועכברים תואם גיל הלא-Tg (nTg), microsomes מבודד מן התמיסה שיתוף עכברים חולה עם אגרגטים αS. ΑS microsomes-הקשורים מינים להראות את תכונות אופייניות של אגרגטים αS, כגון הצטברות של מינים עמידים בפני חומרי ניקוי HMW, זרחון סרין 12919 , C- ו N-מסוף נחתך רסיסים (אפיון מלא של αS microsomes-הקשורים אגרגטים ראה הפניה18,20,21). אלה הן הדרישות הבסיסיות מאז monomeric αS לא לקבל ביעילות הפנימו, לא לגרום αS התצהיר7,15,22. חשוב לא לשימוש חומרי ניקוי (יוניים או ללא יונית) כדי resuspend P100 כדורי מאז זה יכול להזיק לתאים. כמו כן, כדי להימנע לדוגמה השתנות, איחדו αS microsomes-הקשורים אגרגטים של שלושה עכברים נגועים שונים לטיפול עצביים.
מינהל µg 1 של αS microsomes-הקשורים במאגר אגרגטים של עכברים נגועים A53T למדיום תרבות של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס גורם היווצרות תלויי-זמן של הכללות αS, בבדיקת נוגדנים ספציפיים אגרגטים αS כגון Syn303 (איור 4, 5) או pser129-αS (איור 5). לאחר יומיים (2d) של טיפול אגרגטים אלה מופיעים puncta קטן, פזורים שיהפכו שופע יותר בנקודות זמן מאוחר יותר. אחרי שבועיים, תכלילים αS דומים זמן ולומדים מבנים דמויי-חרוזים, בכבדות להתפשט בכל התרבויות עצביים, בעקבות דפוס neurite, חלקית לוקליזציה בשיתוף עם presynaptic neurites סמנים (איור 5). לעיתים, ניתן לראות αS שהוקם תכלילים לשפה משותפת, כתם של סומה תא או לכסות את התהליך כולו, הדומה neurites נמק.
למרות αS microsomes-הקשורים אגרגטים שברים יכול להפיץ ביעילות בתרבויות עצביים, הכמות שלהם צריך להיות מכוונן למספר של נוירונים מצופה (איור 1). למעשה, העולה על היחס המומלץ, µg microsomes-הקשורים האגרגטים: מספר הנוירונים, יניעו מוקדמת של תאים מוות תוך ימים ספורים (איור 6), ואילו כמות מספיקה של αS microsomes-הקשורים אגרגטים יוביל נדיר, צמצום במספר inclusions לאחר שבועיים של טיפול, הדומה מה הושג בנקודות זמן קודמות (איור 4א).
איור 1 . תרבויות עצביים בקליפת המוח. תמונה ייצוגית מציג צפיפות בשבע DIV של תרבויות עצביים בקליפת המוח. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ אור הפוך, המטרה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . בידוד של αS microsomes-הקשורים אגרגטים מן SpC העכבר. תרשים זרימה של פרוטוקול טיהור של αS microsomes-הקשורים אגרגטים מן SpC של עכברים נגועים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . בידוד microsomes שברים של חולה, presymptomatic A53T αS Tg ו- nTg עכברים. בסה כ מציג ניתוח תספיג חלבון מטוהרים αS microsomes-הקשורים אגרגטים מבודד שלוש חולות (חולה), presymptomatic (פרס) ועכברים מתאימים בגילאי nTg. עכברים נגועים. הם עכברים Tg αS A53T המציגים את תפקוד מוטורי והעצבים, כולל ההצטברות של הכללות αS, אמנם presymptomatic חיות A53T בריא αS טי של 9 חודשים של גיל שאינם מציגים עדיין שום פתולוגיה αS הקשורים פנוטיפ. nTg עכברים הם הארנבונים מאותה של עכברים נגועים אשר אינם נושאים את transgene αS, ולכן אינם מפתחים αS המושרה פתולוגיה. µg 1 כל שברים מטוהרים היו בניהול בדף מרחביות denaturing, שהועברו על קרום ניטרוצלולוזה, מחק עם נוגדן Syn-1 או pSer129-αS. רק שברים microsomes מבודד עכברים חולה כלולות אגרגטים עמידים בפני חומרי ניקוי αS HMW היו phosphorylated-סרין 129, הראה C- וחיתוך N-מסוף. איור זה כבר ממאמרו של בני קויה. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . אינדוקציה תלויי-זמן של αS התצהיר לאחר מתן של אגרגטים הקשורים microsomes αS. (א) Immunofluorescence של נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי שטופלו 1 µg של αS microsomes-הקשורים אגרגטים שברים איחדו בין שלושה עכברים נגועים שונים. נוירונים תוקנו ב 2 ימים (2d), שבוע 1 (1w) או 2 שבועות (2w) של טיפול, immunostained עם syn303 (S303, 1:1000), נוגדן ספציפי מחומצן ומצטברים αS. התאים היו counterstained עם דאפי. תמונות קונאפוקלית צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, המטרה X 63 סורק לייזר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) אנליזה כמותית של fluorescence סה כ, אחרי הרקע חיסור, נעשה באמצעות התוסף ספירת חלקיקים של התוכנה תמונה J. הערכים היו מנורמל עבור מספר גרעינים לכל שדה (דאפי ספירה), באחוזים של האות S303 זריחה ב- 2D. ערכים מקבלים גם זאת אומרת ± SD (n = 5). * * p < 0.001, * * * p < של 0.00001, One-way ANOVA, ואחריו LSD פוסט-הוק הבדיקה פישר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . תכלילים αS תאיים colocalize עם הרשת neurites קורטיקלית. להחליפן בתמונות קונאפוקלית של נוירונים בקליפת המוח שטופלו αS microsomes-הקשורים אגרגטים המתקבל עכברים נגועים Tg. לאחר שבועיים של טיפול נוירונים היו קבועים וכפול מוכתם עם נוגדנים ספציפיים אגרגטים [S303 (A, B) או pser129-αS, 1:1,000 (ג)] וסמנים neurite [העכבר αS, 1:200 (A, B) או טאו, 1:10,000 (ג)]. Labelling משותפת של האותות פלורסנט הפגינו לוקליזציה שותף חלקי של αS שהוקם מבנים דמויי-חרוז עם הרשת neurites. מדי פעם αS תכלילים לצבור בתוך סומא עצביים (A, B, ראשי חץ). תמונות מוערמות נרכשו עם מיקרוסקופ קונפוקלי, המטרה X 63 סורק לייזר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מקויה. et al. 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . תוספת של שיוצרת כמות αS microsomes-הקשורים אגרגטים רעיל נוירונים. דאפי מכתים של נוירונים מטופלים עם הגדלת ריכוז של αS microsomes-הקשורים אגרגטים מובילה למוות תא. (א) נוירונים בקליפת המוח טופלו עם 1, 2 µg αS microsomes-הקשורים האגרגטים מופק עכברים נגועים או המאגר היחיד שאינו מכיל אגרגטים (B) , מוכתם דאפי. תמונות פלורסנט נרכשו עם מיקרוסקופ epi-זריחה באמצעות מטרה X 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.(B) תאים דאפי-חיוביות נספרו שימוש בתוכנה התמונה J. התרשים מראה ירידה במספר גרעינים עם הגדלת ריכוז של אגרגטים הקשורים microsomes αS הוסיף את התקשורת העצבית. ערכים מבוטא % b ניתנת גם זאת אומרת ± SD (n = 5), * * * p < 0.0001, One-way ANOVA, ואחריו LSD פוסט-הוק הבדיקה פישר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
אנחנו תיאר שיטה להשיג היווצרות תכלילים αS המוח-derived תרבויות עצביים העיקרי של עכברים WT, באמצעות התוספת של αS microsomes-הקשורים מטוהרים אגרגטים מבודד αS Tg חייתיים.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הן הבאות: היחס של µg של αS microsomes-הקשורים אגרגטים/נוירונים ואת המקור של אגרגטים αS. כפי שמוצג במהלך ההפעלה של תוצאות, זה הכרחי כדי למטב את היחס של µg של αS microsomes-הקשורים אגרגטים או המספר של נוירונים מאז לעבוד בתנאים שיוצרת יכול להוביל מות תאים מוקדמת או צבירת תאיים גם נדיר (לראות התוצאות נציג מדור). מסיבה זו, חשוב מאוד להעריך את הצפיפות של התרבות עצביים בשבע DIV (המוצג באיור1) לפני תחילת הטיפול. בנוסף, אגרגטים αS חייב להיטהר מן αS חולה Tg עכברים, כלומר. דגמים בעלי חיים שנצברים LB דמוי תכלילים מאופיין αS לא מסיסים phosphorylated, דטרגנט הסיבים HMW.
שינויים אפשריים פרוטוקול זה רואים את הרקמה, קפוא או טרי, מן microsomes אשר ניתן לבודד הסכום ההתחלתי. בזמן שהשתמשנו עכברים SpC של Tg בגלל תכולה גבוהה של אגרגטים לא מסיסים αS, הפרוטוקול זה מתאים לבודד microsomes-הקשורים אגרגטים של הטלוויזיה, ובלבד באזור יש תכולה גבוהה של אגרגטים αS. דוגמאות קפוא יכול לשמש גם מאז ההקפאה אינה משפיעה על המדרגות טיהור של אגרגטים הקשורים microsomes ' או ' של אגרגטים כשלעצמה. אמנם המשקל ההתחלתי המומלץ בשביל לרקמות כ 100-150 מ"ג, פרוטוקול זה מתאים להשגת microsomes מ נמוך כמו 50 מ"ג של חומר גלם (אין מגבלת משקל מקסימלי). במקרה סכום נמוך יותר 100 מ ג, עם זאת, היחס המתאים המגון תהיה 1:20 (w/v) על מנת לקבל לפחות 1 מ"ל של S10 supernatant כדי לטעון על פוליקרבונט הבקבוק משקעים ultracentrifuge. למעשה, טעינת אמצעי אחסון קטן יותר 1 מ"ל עלולה לגרום להתמוטטות של אובדן צינור ולדגום. מעלה את הנפח המגון יוביל תגובת שיקוע מדולל יותר אך ריכוז בגדר microsomal יישאר מעושה.
מגבלה של פרוטוקול זה מדאיג את לא יעיל הצלב זורעות היווצרות תכלילים αS לאחרונה דווח כי בניהול תיק של αS PFFs ממקור אנושי לתרבויות עצביים מאתר בניגוד העכבר αS PFFs24. מאז להגדיל את כמות הסיבים αS אקסוגני שגבה תרבויות מאתר יכולים לעקוף בעיה זו, אנו ממליצים לכוון דק את כמות microsomes-הקשורים אגרגטים במקרה של הממשל של הסיבים שהושג גרסאות אחרות αS או שונה מינים לתרבויות עצביים עכבר מאשר מה שהסברנו.
אגרגטים אקסוגני αS הוסיף את התקשורת תרבות יכול להיות ממקורות שונים. במבחנה αS PFFs שימשו בעבר כתבנית זריעה של אגרגטים תאיים αS תרביות תאים, נוירונים העיקרי, מודלים בעלי חיים3,7,8,15. לעומת השיטה שלנו איפה αS microsomes-הקשורים אגרגטים יכול להיות מבודדת בעוד כמה שעות, היווצרות של PFFs הוא ארוך, מפרך, הדורשות מספר השלבים של purifications, ואחריו מבחני נוספים כדי לבדוק αS אגרגטים confomations25 . בנוסף, PFFs להיות המתקבל האדם הביע בקטריאלי או בעכבר αS, כלומר חסר posttranslational שינויים אופייניים פרוקריוטים, יכול להציג הייצורים החיים שונה, עם זריעת סלקטיבי ומאפיינים פתוגניים, על פי הפרוטוקולים התגרענות בעקבות5,(כלומר סרטים vs. הסיבים)8 שמוביל לתוצאות שונות ומסקנות. במקום זאת, ניהול יחידה של ויוו מטוהר αS אגרגטים ערבויות השידור של תבניות פתוגניים יותר אותנטי, מחקה מקרוב את תהליך היווצרות αS בקהילות חייתיים, החולים במחלה.
כיישום העתידי של טכניקה זו, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש בהצלחה לבודד αS זרעים פתוגניים המוח של החולים במחלה או αS Tg בעלי חיים דגמים אחרים, ובלבד האזור הפגוע שממנו microsomes מבודדים עשירים αS הכללות.
לידע שלנו, זו השיטה הראשונה המאפשרת הטיהור של זנים רעילים מקומיים של αS ויוו PD דגמים כדי לשמש זריעה תבנית להשגת היווצרות αS בקהילות נוירונים העיקרי.
אנו מאמינים כי שיטה זו רב-תכליתי במיוחד, יכול לספק מודל מבוססת תא יוצאת דופן כדי לחקור את ההיבטים השונים של צבירת αS והשפעתו על פתופיזיולוגיה התא. כיוון היווצרות של הכללות αS לייצג תהליך מורכב זה היה קשה לשכפל בתאים בתרבית, אנו תקווה כי מודל זה יספק תובנות נהדר במנגנונים פתוגניים חריפה, קשה לזהות כרונית, משוכלל יותר מערכות הן כגון מודלים בעלי חיים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו היא נתמכה על ידי משרד איטלקי של אוניברסיטת מחקר (MIUR) באמצעות ערכת מענק הקריירה אפשרות (תוכנית RLM עבור חוקר צעיר) מ בית נורמל סופריורה. אנו מודים לי מיכאל פרופ מ אוניברסיטת מינסוטה, ארה ב, למתן αS A53T האנושי Prp עכברים Tg, שממנו אגרגטים מבודדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
