Summary
Målet med denne protokollen er å gi en celle-basert system som reproduserer dannelsen av alpha-synuclein samler i vivo. Intracellulær alpha-synuclein Inneslutninger er rangert i primære neurons av internalisering og overføring av eksogene administreres innfødt microsomes-assosiert alpha-synuclein-aggregater isolert fra syke alpha-synuclein transgene mus.
Abstract
For år, har manglende evne til å replikere dannelsen av uløselig alpha-synuclein (αS) inkludering i cellekulturer vært en stor begrensning i studiet av αS samling i Parkinsons sykdom (PD). Utviklingen av nye dyremodeller gjennom eksogene inoculation av hjernen ekstrakter fra syke αS transgene mus eller PD pasienter har nylig gitt nye håp til muligheten for å skape mer tilstrekkelig celle modeller av αS aggregering. Dessverre når det kommer til celler i kulturer, administrasjon av rå hjernen ekstrakter har ikke vist seg så vellykket som mus og valg av eksogene aggregater er fortsatt i vitro preformed αS fibrils.
Vi har utviklet en metode for å indusere dannelsen av intracellulær αS inkludering i primære neurons gjennom eksogene administrasjonen av innfødte microsomes-assosiert αS aggregat, en svært giftig αS Art isolert fra syke områder av transgene mus. Denne fraksjonen av αS aggregater som er forbundet med microsomes blemmer, er effektivt internalisert og induserer dannelsen av intracellulær Inneslutninger positivt for samlet og fosforylert αS. Forhold til in vitro-preformed fibrils som er laget av rekombinant αS, vår metode er raskere og garanterer at sykdomsfremkallende seeding gjøres med autentiske αS aggregat utvunnet fra syke dyr modeller av PD, etterligne mer tett typen Inneslutninger innhentet i vivo. Som et resultat, er tilgjengeligheten av vev rik på αS inkluderinger obligatorisk.
Vi tror at denne metoden vil gi en allsidig cellen-basert modell for å studere mikroskopiske aspekter av αS aggregering og beslektede cellulær patofysiologi i vivo og vil være et utgangspunkt for å lage mer nøyaktige og sofistikert celle paradigmet av PD.
Introduction
Akkumulering av alpha-synuclein (αS) proteinaceous inkluderinger er en fremtredende og viktig funksjon av Parkinsons sykdom (PD) og alpha-synulceinopathies1. Dessverre, mens dyremodeller er kjøpedyktig skaffe et tilstrekkelig mobilnettet og biokjemiske miljø å indusere aggregering trinnene nødvendig for dannelsen av protein fibrils2, replikere dannelsen av komplekse Lewy Body (LB)-som aggregater i cellekulturer er vanskelig og utfordrende.
Her beskriver vi en metode for å indusere dannelsen av αS inkluderinger, ligner på protein aggregater innhentet i dyremodeller og PD pasienter, i kulturperler celler, bruker hjernen isolert musen primære nevroner. Våre protokollen er basert på eksogene administrasjonen av microsomes-assosiert αS aggregater isolert fra αS symptomatisk transgene (Tg) mus til mus hippocampus eller kortikale primære neurons. Denne metoden tar fordel av at sprer seg og forplantning αS giftig arter som når lagt til kultur medium, er blir internalisert og indusere dannelsen av eldre αS-positive aggregater3,4, 5,6,7,8.
Opprinnelig var standard metoder å få dannelsen av αS fibrils i cellekulturer basert på overuttrykte det tilsvarende αS cDNA gjennom vanlige transfection protokoller eller viral-mediert infeksjon9. Mens i det første tilfellet skaffe LB-lignende αS aggregater var tilfeldig, viste lav effektivitet, og avhengig av hvilken celle, andre protokollen førte til dannelsen av uløselig fibrils, inkludert høy molekylvekt (HMW) arter i 24-48 h fra infeksjon 10. i disse metodene, dannelsen av aggregater var sannsynligvis på grunn av en overdreven og ubalanserte αS protein beløpet som blir uløselig i stedet for en patologisk konvertering av αS konformasjon som styrer aggregering. I stedet, teknikken som vi presenterer her endrer ikke αS uttrykk nivået men induserer utbredt protein samling på grunn av internalization eksogene fibrils. Videre dannelsen av αS aggregater gjennom administrasjonen av eksogene fibrils er en lengre prosess som krever dager eller uker å bli fullstendig tillater oss å studere tidlig og mellomliggende stadier av αS Inneslutninger formasjon i en time-lapse mote og til relatere det med cellular biokjemiske endringene. Dermed er vår metode en verdifull program å lage mobilnettet modeller av αS aggregering som er nyttig å studere αS fibril formasjon mikroskopisk i forhold til mobilnettet patofysiologi.
I tillegg selv om administrasjon av rå hjernen ekstrakter fra syke αS Transgenic (Tg) mus11,er12 eller menneskelig PD hjerner6,13 kjøpedyktig indusere αS avsettelse i vs eller vill-type (WT) dyr, program av den samme fremgangsmåten til cellekulturer har ikke vist seg for å være så vellykket, muligens på grunn av lav beløpet av aggregater i utvalgene brukt og mangel på en standard prosedyre å isolere innfødt αS giftig arter14. Derfor i vitro preformed fibrils (PFFs) av αS har vært aggregater kilden valg før nå for induksjon av αS inkludering i celler og dyr modeller3,4,6,7 ,15,16. Med våre protokollen, men viser vi at microsomes-assosiert αS samlet arter isolert fra αS vs mus effektivt kan indusere opphopning av intracellulær LB-lignende αS inkludering i primære neurons.
I vår lab er microsomes-assosiert αS samlet arter isolert fra ryggmargen (SpC) vev av syke vs mus uttrykke menneskelige A53T αS gen under kontroll av musen prion protein (PrP) selskapet [Prp menneskelig A53T αS vs mus, linje G2-317]. Disse mus viser en alder-avhengige nevrodegenerative fenotypen som inkluderer robust motor dysfunksjon og dannelse av inkludering i sentralnervesystemet laget av fosforylert, ubiquitinated og uløselig αS, starter etter 9 måneder av alderen. Når motor dysfunksjon vises, fenotypen raskt utvikler seg til lammelse, fra bakre lemmer, som fører til død i 2-3 uker. Oppsamling av αS aggregater paralleller sykdommen seg. Mus ofret ved utbruddet av motor dysfunction viser en robust grad av αS samling i SpC, hjernestammen og lillehjernen. Det er ikke nødvendig å vente til lammelse angir ofre musen. Presymptomatic mus er tatt på 9 måneder gamle dyr som ikke viser motor dysfunksjon.
Protocol
Bruk av WT og vs dyr ble godkjent og overholdt i full av nasjonale og internasjonale lover for laboratoriet dyrevelferd og eksperimentering (EØF rådets direktiv 86/609, 12 desember 1987 og direktivet 2010/63/EU, 22 September 2010). Alle protokollene beskrevet i denne hvitboken følger retningslinjene for dyr omsorg i institusjon våre.
1. isolering av Microsomes-assosiert αS aggregater fra syke A53T αS vs mus
- Forberede homogenisering bufferen som består av 250 mM sukrose, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA og 1 x fosfatase /-proteasehemmere. Holde bufferen på is.
- Homogenize friskt eller frosne vev i en 1:10 (w/v) volumet av iskalde homogenisering buffer ved hjelp en Teflon støter homogenizer, med 10-15 strøk.
- Overføre første homogenate (1-2 mL) til en microcentrifuge rør og sentrifuge 1000 × g for 10 min på 4 ° C med en nedkjølt sentrifuge for å fjerne kjerner og ubrutt celler i den resulterende pellet (P1). Kast P1.
- Overføre nedbryting (S1) til en ren microcentrifuge rør og sentrifuge S1 10.000 × g for 20 min på 4 ° C med en nedkjølt sentrifuge for å få andre nedbryting (S10) og pellets (P10).
Merk: P10 er råolje membran pellets som inneholder mitokondrier og synaptosomes. Kast P10. - Overføre nedbryting (S10) til en polykarbonat flaske (> 1 mL) og sentrifuge S10 100.000 × g, 1t på 4 ° C ved hjelp av en ultracentrifuge og en fast vinkel rotor (90 Ti).
Merk: Nedbryting er rene stoffer brøken mens pellets, P100, inneholder microsomes-assosiert αS aggregat. - Resuspend P100 pellets med 500 µL av homogenisering bufferen. Overføre P100 til en ren microcentrifuge rør og sentrifuge 10.000 × g for 20 min på 4 ° C i en nedkjølt sentrifuge.
- Forkast nedbryting og resuspend P100 med 100 µL homogenisering bufferen.
Merk: Denne fraksjonen er microsomes-assosiert αS-aggregater. - Sonicate eksempler for 2 s på is [Angi utgangseffekt 1 watt (RMS)]. Lagre prøver på-80 ° C.
- Dagen etter, finne ut hvor protein BCA analyse.
2. Western Blot
Merk: Biokjemiske karakterisering av microsomes-assosiert αS-aggregater vurderes ved Western Blot.
- Kastet en gradient 4-20% Tris-glycine polyakrylamid gel på en loddrett geleelektroforese apparater.
- Legg 1 µg av microsomes-assosiert αS fraksjoner, oppløst i denaturing eksempel bufferen.
- I en annen brønn, laste 5 µL av protein standard merketråden.
- Kjøre gel på 100 V i en Tris/glysin/SDS kjører buffer til protein markør når slutten av gel.
- Overføre proteiner til en nitrocellulose membran med en grunnleggende karbonat buffer (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, 20% metanol) O/N ved 4 ° C, 200 mA, konstant.
- Blokkere membranen med PBS-ikke-ionisert surfactant 0,05% (PBS-T) med 5% ikke-fett tørr melk på en orbital shaker i 30 min på RT.
- Kort, skyll membranen med PBS-T.
- Inkuber membranen Syn-1 (1:5, 000) eller pSer129-αS antistoff (1:5, 000) 2,5% ikke-fett tørr melk i PBS-T, O/N på 4 ° C på en orbital shaker.
- Vask membranen i 10 min på RT med PBS-T på en orbital shaker.
- Inkuber membranen med anti-mus eller anti-kanin HRP-konjugerte sekundære antistoff (1:3, 000) i 2,5% ikke-fett tørr melk i PBS-T 1t på RT.
- Vask membranen i 10 min på RT med PBS-T på en orbital shaker. Gjenta 3 x.
- Få signalet gjennom de vanlige chemiluminescence kits.
3. primære Neuronal kulturer
Merk: Primære neuronal kulturer ble utarbeidet fra WT nyfødte (P0) musen hippocampus eller cortex (linje C57BL/6). Hele prosedyren, minus sentrifugering trinnene, utføres under celle kultur hette, sterile forhold.
- Behandle coverslips (18 mm Ø) med 65% salpetersyre løsning for minst 12 h på RT.
- Fjern salpetersyre. Skyll coverslips to ganger med PBS 10 x og flere ganger med destillert vann.
- Sett inn coverslips i 24-vel retter og pels dem med poly-D-lysine (0,1 mg/mL steril destillert vann eller PBS 1 x) 1t på 37 ° C.
- Fjerne poly-D-lysine og vask coverslips tre ganger med destillert vann. Lagre dem på 4 ° C inntil nødvendig.
- Euthanize musen valpene ved halshogging og separate hodene av likene. Plasser hodet på retter og forsiktig dissekere huden.
- Med fine saks, åpne skallen ved å gjøre et snitt på grunnlaget for hjernen. Skille de to halvdelene av hodeskaller og fjerne dem nøye.
- Ved hjelp av pinsett, knipe av hjernen fra baser og isolere cortex og hippocampus. Overføre dem i to separate retter som inneholder Hanks balansert Salt løsning (HBSS) medium som inneholder 1% penicillin/streptomycin.
- Gjenta trinn 3.6 og 3.7 for hvert dyr. Vær oppmerksom på at hele prosessen ikke bør ta mer enn 30-45 minutter.
- Hakke samlet vev og overføre dem i to 50 mL konisk rør (ett for hippocampus) og én for cortex med 10 mL av HBSS medium som inneholder Trypsin 0,1%. Inkuber i vannbad i 7 min på 37 ° C.
Merk: Det kreves ingen agitasjon. - Legg 1 mL av DMEM som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 10 µg/mL DNase til homogenate blokkere trypsin aktivitet.
- Sentrifuge resulterende dissosiert vevet 200 × g for 5 min på RT til en sentrifuge og fjerne nedbryting.
Merk: Pellet representerer cellene dissekert fra vevet. - Resuspend cellene i plating medium, som inneholder 2% B27, 2 mM glutamin, 6 mg/mL glukose, 10% FBS, 12.5 µM glutamat og 10 µg/mL gentamicin.
- Plate dissosiert neurons på poly-D-Lysine coverslips i 24 godt platene ifølge forholdet: 1 cortex/12 brønner og 1 hippocampus/6 brønner, noe som resulterer i ca 150 000/200 000 celler per brønn. Opprettholde cellene i kuvøse på 37 ° C.
- Dagen etter (dag i vitro, DIV 1), erstatte plating mediet med mediet som inneholder 2% B27, 10 µg/mL gentamicin og 2 mM glutamin.
- DIV 2, Fjern 1/3 av middels og tilsett 1/3 av ferske mediet som inneholder 2,5 µM cytosine arabinoside 48 h å redusere glial forurensning.
- Opprettholde neurons på 37 ° C og erstatte halvparten av mediet hver tredje dag.
4. neurons behandling
Merk: Behandling er utført på DIV 7. Alle trinnene er gjennomført på under celle kultur hette i sterile forhold. Et eksempel på kortikale neuronal kultur tetthet på DIV 7 er illustrert i figur 1.
- Pool microsomes-assosiert αS aggregater innhentet fra ryggmargen tre forskjellige syke vs mus for å få en 1 µg/µL løsning, bruker den opprinnelige homogenisering bufferen for fortynning.
- Fjern 1/3 av mediet og erstatte den forsiktig med fersk mediet som inneholder 2% B27, 1 x gentamicin og 2 mM glutamin.
- Legge til 1 µg av grupperte microsomes-assosiert αS aggregater celle medium. Returnere nerveceller i kuvøse på 37 ° C.
- Hver 3 dager for 1 uke, Legg til 1/3 av ferske medium. Ikke Erstatt medium. Bare legg den.
- Etter en uke med behandling, fjerne 1/3 av mediet og erstatte den forsiktig med fersk mediet som inneholder 2% B27, 10 µg/mL gentamicin og 2 mM glutamin. Gjenta hver tredje dag.
- Fastsette neurons etter 2 uker med behandling (DIV 21).
5. immunofluorescence
- Fastsette neurons med 2% paraformaldehyde i PBS 1 x og 5% sukrose løsning for 15 min på RT uten riste, under en kjemisk fume hette.
- Fjern feste løsningen. Kort, vask med PBS 1 x, 3 ganger.
Merk: Utføre alle trinnene som vask forsiktig fordi primære neurons ikke stikke fast til poly-lysine coverslips. - Permeabilize neurons med 0,3% av ikke-ionisert surfactant i PBS 1 x i 5 min på RT.
- Kort, vask med PBS 1 x, 3 ganger.
- Inkuber neurons med 3% FBS i PBS 1 x i 30 min på RT, blokkere uspesifikke bindende områder, på en orbital shaker.
- Inkuber neurons med riktig primære antistoff oppløst i 3% FBS i PBS 1 x, O/N på 4 ° C på en orbital shaker.
Merk: syn303 (1:1, 000), mus αS (1:200), pser129-αS (1:1, 000) og Tau (1:10, 000) antistoffer ble brukt. - Fjerne antistoff løsningen og vask, kort, med PBS 1 x, 3 ganger.
- Inkuber neurons med riktig fluorescerende sekundære antistoff oppløst i 3% FBS i PBS, 1t på RT i mørket på en orbital shaker.
- Fjerne antistoff løsningen og vask, kort, med PBS 1 x, 3 ganger.
- Stain neurons med DAPI løsning (0,1 µg/mL i PBS 1 x) i 15 min på RT i mørket på en orbital shaker.
- Fjerne antistoff løsningen og vask, kort, med PBS 1 x, 3 ganger.
- Montere coverslips på et lysbilde ved hjelp av antifade montering medium.
Representative Results
Følger protokollen beskrevet ovenfor og oppsummert i figur 2, vi renset microsomes-assosiert αS aggregater fra tre syke A53T αS vs mus (Figur 3). Microsomes er råolje membran pellet brøker som inneholde endoplasmatiske retikulum, Golgi og små synaptic blemmer. Graden av renhet av mikrosomale pellet sammenlignet med andre fraksjoner var tidligere vurdert ved hjelp av bestemte organelle markører18.
Isolerte vurderes biokjemiske karakterisering av αS aggregater gjennom denaturing SDS-side, etterfulgt av inkubasjon Syn-1 eller fosforylert αS på Serine 129 (pSer129-αS) antistoff. Forhold til presymptomatic (PreS) og alder-matchet ikke-vs (nTg) mus, microsomes isolert fra syk mus co precipitate med αS aggregat. Microsomes-assosiert αS Art Vis de typiske egenskapene til αS-aggregater, som opphopning av HMW vaskemiddel-resistente arter, fosforylering serine 12919 og C- og N-terminal avkortet fragmenter (for en full analyse av microsomes-assosiert αS aggregater se referanse18,20,21). Dette er grunnleggende krav siden monomerisk αS ikke få effektivt internalisert og ikke få αS avsettelse7,15,22. Det er viktig ikke å bruke noen vaskemiddel (ioniske eller ikke-ioniske) til resuspend P100 pellets siden det kan være skadelig for celler. For å unngå prøve variasjon, vil også microsomes-assosiert αS aggregater fra tre forskjellige syke mus samordnes for neuronal behandling.
Administrasjon av 1 µg av grupperte microsomes-assosiert αS aggregater fra syke A53T mus til kultur medium kortikale eller hippocampus neurons induserer en tidsavhengige dannelsen av αS inkluderinger, positivt for aggregater-spesifikke αS antistoffer som Syn303 (Figur 4, 5) eller pser129-αS (figur 5). Etter to dager (2d) behandling disse aggregater vises som små, spredte puncta som blir mer rikelig på senere tidspunkt. Etter to uker, αS Inneslutninger ligner lenge og modne perler-lignende strukturer, tungt spredt over hele neuronal kulturer, etter et neurite mønster og delvis co lokalisere med presynaptic og neurites markører (figur 5). Noen ganger sees nyopprettede αS Inneslutninger co lokalisere og flekken celle soma eller dekke hele prosessen likner nekrotisk neurites.
Selv om microsomes-assosiert αS aggregater fraksjoner kan effektivt spredt i neuronal kulturer, har deres stilles fint til antall nevroner belagt (figur 1). Faktisk, overstiger den anbefalte forholdet, µg av microsomes-assosiert aggregater: mange neurons, vil indusere tidlig celledød innen få dager (figur 6), mens en tilstrekkelig mengde microsomes-assosiert αS aggregatene vil føre til en knappe og redusert antall inkluderinger etter to uker med behandling, nærmere ble oppnådd på tidligere tidspunkt (Figur 4A).
Figur 1 . Kortikale neuronal kulturer. Representativt bilde viser tetthet på DIV 7 kortikale neuronal kulturer. Bildene ble tatt med en invertert lys mikroskop, 10 X mål. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Isolasjonen av microsomes-assosiert αS samler fra musen SpC. Flytskjema for rensing protokollen for microsomes-assosiert αS samler fra SpC syke mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Isolering av syke, presymptomatic A53T αS vs og nTg mus microsomes fraksjoner. Western blot analyse viser renset microsomes-assosiert αS aggregater isolert fra tre syk (syk), presymptomatic (PreS) og alderen-matchet nTg mus. Syke mus er A53T αS vs mus som viser motor og Nevrologisk dysfunction, inkludert akkumulering av αS inkluderinger, mens presymptomatic dyr er sunt A53T αS Tgs 9 måneder av alderen som ikke viser noen αS patologi relatert fenotypen. nTg mus er littermates av syke mus som ikke bære αS transgene og derfor ikke utvikle αS indusert patologi. 1 µg av hver renset fraksjoner var kjører på en denaturing SDS-side, overføres på en nitrocellulose membran og strøket med Syn-1 eller pSer129-αS antistoff. Bare microsomes fraksjoner isolert fra syk mus inneholdt HMW vaskemiddel-resistente αS aggregater som var fosforylert på serine 129 og viste C- og N-terminal trunkering. Dette tallet er tilpasset fra Colla et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Tidsavhengige induksjon av αS avsettelse etter administrasjon av microsomes-assosiert αS aggregater. (A) Immunofluorescence av primære hippocampus neurons behandlet med 1 µg av microsomes-assosiert αS samler fraksjoner samlet fra tre forskjellige syke mus. Neurons er løst på 2 dager (2d), 1 uke (1U) eller 2 uker (2U) behandling og immunostained med syn303 (S303, 1:1000), et antistoff som er spesifikke for oksidert og samlet αS. Cellene ble counterstained med DAPI. AC confocal bilder ble tatt med en laserskanning AC confocal mikroskop, 63 X mål. Skala bar = 50 µm. (B) kvantitativ analyse av totale fluorescence, etter bakgrunn subtraksjon, ble gjort med partikler antall plugin bilde J programvaren. Normalisert for antall kjerner per felt (DAPI antall) var og uttrykt som en prosentandel av S303 fluorescens signalet på 2D. Verdiene er angitt som den gjennomsnittlig ± SD (n = 5). ** p < 0,001, *** p < 0,00001, enveis ANOVA, etterfulgt av Fisher's LSD innlegg-hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Intracellulær αS Inneslutninger colocalize med kortikale neurites nettverk. Representant AC confocal bilder av kortikale nevroner behandlet med microsomes-assosiert αS aggregater fra syke vs mus. Etter 2 uker med behandling neurons var faste og doble farget med aggregater-spesifikke antistoffer [S303 (A, B) eller pser129-αS, 1:1,000 (C)] og neurite markører [mus αS, 1:200 (A, B) eller Tau, 1:10,000 (C)]. Co merking fluorescerende signaler vist delvis co lokalisering av nydannede αS perle-lignende strukturer med neurites nettverket. Noen ganger akkumuleres αS Inneslutninger i den neuronal soma (A, B, pilspisser). Stablet bilder ble kjøpt med en laserskanning AC confocal mikroskop, 63 X mål. Skala bar = 50 µm. Dette tallet har blitt endret fra Colla et al. 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Tillegg av suboptimal mengde microsomes-assosiert αS aggregater er giftig å neurons. DAPI farging av neurons behandlet med øker konsentrasjonen av microsomes-assosiert αS aggregater fører til celledød. (A) kortikale nevroner ble behandlet med 1, 2 µg av microsomes-assosiert αS aggregater utdraget fra syke mus eller bare buffer som ikke inneholder samler (B) og farget med DAPI. Fluorescerende bilder ble kjøpt med en epi-fluorescens mikroskopet ved hjelp av en 20 X-målet. Skala bar = 100 µm.(B) DAPI-positive celler ble regnet med bilde J-programvaren. Diagrammet viser en reduksjon i antall kjerner med økende konsentrasjon av microsomes-assosiert αS aggregater lagt til nevronale media. Verdiene uttrykkes som en prosentandel av b og gis som den gjennomsnittlig ± SD (n = 5), *** p < 0,0001, enveis ANOVA, etterfulgt av Fisher's LSD innlegg-hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi beskrev en metode for å få dannelsen av αS inkludering i hjerne-avledet primære neuronal kulturer fra WT mus, gjennom tillegg av renset microsomes-assosiert αS aggregater isolert fra αS vs dyremodeller.
Avgjørende skritt i denne protokollen er følgende: forholdet mellom µg microsomes-assosiert αS aggregater/neurons og kilden til αS aggregat. Som vist i resultatene økten, er det avgjørende å optimalisere forholdet mellom µg av microsomes-assosiert αS aggregater/antall nevroner siden arbeider i suboptimal forhold kan føre til tidlig celledød eller for knappe intracellulær aggregasjon (se den Representant resultatinndelingen). Derfor er det svært viktig å vurdere tettheten av neuronal kulturen på DIV 7 (vist i figur 1) før du starter behandlingen. I tillegg har αS aggregater å bli renset fra syke αS vs mus, dvs. fra dyr modeller som akkumuleres preget LB-lignende inneslutninger av fosforylert og vaskemiddel uløselig αS HMW fibrils.
Endres til denne protokollen anser vevet, frosne eller friske, som microsomes kan isoleres og starter beløpet. Mens vi brukte SpC vs mus på grunn av det høye innholdet av αS uløselig aggregater, er protokollen egnet til å isolere microsomes-assosiert aggregater fra alle vev, forutsatt at området har en høy innhold i αS aggregat. Frosne prøvene kanne likeledes bli brukt siden frysing ikke påvirker punktene rensing av microsomes-assosiert tilslag eller det aggregater per se. Den anbefalte startvekt for vev er ca 100-150 mg, denne protokollen er egnet for å skaffe microsomes fra så lite som 50 mg råvarer (ingen maksimal vektgrense). Når det gjelder hvor lavere enn 100 mg, men vil riktig homogenisering forholdet være 1:20 (w/v) for å få minst 1 mL av supernatant S10 laste på polykarbonat flasken for ultracentrifuge nedbør. Faktisk kan laste volumer mindre enn 1 mL resultere i sammenbruddet av rør og prøve tap. Øke homogenisering volumet vil føre til en mer utvannet nedbryting men konsentrasjonen av mikrosomale pellet vil forbli upåvirket.
En begrensning av denne protokollen gjelder ineffektiv kryss-frø i dannelsen av αS inclusions som er nylig rapportert i tilfelle administrasjonen av αS PFFs av menneskets opprinnelse murine neuronal kulturer i motsetning til musen αS PFFs24. Siden økende mengden av eksogene αS fibrils gitt murine kulturer kan omgå dette problemet, anbefaler vi for å fininnstille hvor mye microsomes-assosiert aggregater ved administrasjon av fibrils innhentet fra andre αS varianter eller annen arter musen neuronal kulturer enn hva vi beskrev.
Ytre αS aggregater lagt til kultur media kan være fra ulike kilder. In vitro αS PFFs har tidligere blitt brukt som seeding mal av intracellulær αS aggregater i cellekulturer, primære nevroner og dyremodeller3,7,8,15. Sammenlignet med vår metode hvor microsomes-assosiert αS aggregater kan bli isolert i timene, er dannelsen av PFFs lang og arbeidskrevende, krever flere trinn av rene, etterfulgt av flere analyser sjekke αS samler confomations25 . I tillegg PFFs utvinnes av bakteriell-uttrykt menneske eller mus αS, dvs mangler posttranslational modifikasjoner typisk for eukaryoter, kan presentere ulike konformasjonen, med selektiv såing og patogene egenskaper, ifølge protokollene som nucleation fulgte (i.e. bånd vs fibrils)5,8 fører til ulike resultater og konklusjoner. I stedet garanterer enkelt administrasjon av i vivo renset αS aggregater overføring av mer autentisk patogene maler, etterligne tett prosessen med dannelsen av αS inkludering i dyremodeller og PD pasienter.
Som en fremtidig anvendelse av denne teknikken tror vi at denne protokollen kan med hell brukes å isolere αS patogene frø fra hjernen av PD pasienter eller andre αS vs dyr modeller, forutsatt at syke området som microsomes er isolert er rik på αS inkluderinger.
Vi vet er dette den første metoden som lar rensing av giftige arter av αS fra i vivo PD modeller som seeding mal for å få dannelsen av αS inkludering i primære neurons.
Vi tror at denne metoden er svært allsidig og kan gi en eksepsjonell cellen-basert modell for å studere de ulike aspektene ved αS aggregering og dens innflytelse på cellen patofysiologi. Fordi dannelsen av αS Inneslutninger representerer en komplisert prosess som har vært vanskelig å gjenskape i kulturperler celler, er vi håpefull at denne modellen vil gi stor innsikt i akutt patogene mekanismer, vanskelig å identifisere i kronisk og mer forseggjort systemer er som dyr modeller.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har vært støttet av den italienske departementet av University og forskning (MIUR) gjennom karriere reintegrasjon grant ordningen (RLM Program for unge forsker) og fra Scuola Normale Superiore. Vi takker professor Michael Lee fra University of Minnesota, USA, for å gi Prp menneskelig A53T αS vs mus, som aggregater er isolert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
