Summary
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett cell-baserat system som replikerar bildandet av alfa-synuklein aggregerar i vivo. Intracellulära alfa-synuklein inneslutningar är seedad i primära nervceller genom internalisering och förökningen av exogena administreras infödda mikrosomer-associerade alfa-synuklein aggregat isolerade från sjuka alfa-synuklein transgena möss.
Abstract
I år varit oförmågan att replikera bildandet av olösliga alfa-synuklein (αS) inneslutningar i cellodlingar en stor begränsning i studien av αS aggregation i Parkinsons sjukdom (PD). Utvecklingen av nya djurmodeller genom exogena inympning av hjärnan extrakt från sjuka αS transgena möss eller PD patienter har nyligen gett nya förhoppningar till möjligheten att skapa mer adekvat cellmodeller av αS aggregation. Tyvärr, när det gäller celler i kulturer, administration av rå hjärnan extrakt har inte visat lika framgångsrikt som i möss och källan till val av exogena aggregat är fortfarande i vitro förformade αS fibriller.
Vi har utvecklat en metod för att inducera bildandet av intracellulära αS införanden i primära nervceller genom exogena förvaltning av infödda mikrosomer-associerad αS aggregat, en mycket giftig αS arter isolerade från sjuka områden av transgena möss. Denna fraktion av αS aggregat som associeras med de mikrosomer vesicles, är effektivt internaliseras och inducerar bildandet av intracellulära inneslutningar positivt för aggregerade och fosforyleras αS. Jämfört med i vitro-förformade fibriller som är gjorda av rekombinant αS, vår metod är snabbare och garantier som den patogena seedning görs med autentiska αS aggregat som utvinns ur sjuka djurmodeller av PD, härma mer nära typ av inneslutningar erhålls i vivo. Som ett resultat, är tillgänglighet av vävnader som är rik på αS inneslutningar obligatoriskt.
Vi anser att denna metod kommer att ge en mångsidig cell-baserad modell för att studera de mikroskopiska aspekterna av αS aggregation och den relaterade cellulära patofysiologi i vivo och kommer att vara en utgångspunkt för att skapa mer exakta och sofistikerade cell paradigm av PD.
Introduction
Ansamling av alfa-synuklein (αS) proteinhaltiga inneslutningar är en framstående och viktig funktion av Parkinsons sjukdom (PD) och alpha-synulceinopathies1. Tyvärr, medan djurmodeller har möjlighet att ge en tillräcklig cellulära och biokemiska miljö för att inducera aggregering stegen som krävs för bildandet av protein fibriller2, replikera bildandet av komplexa Lewy Body (LB)-gillar aggregat i cellkulturer är svårt och utmanande.
Här beskriver vi en metod för att inducera bildandet av αS inneslutningar, liknande protein aggregat erhållits i djurmodeller och PD patienter, i odlade celler, använder hjärnan isolerade mus primära nervceller. Våra protokollet är baserat på exogena administrationen av mikrosomer-associerad αS aggregat isolerad från αS symtomatisk transgena (Tg) möss i mus Hippocampus eller kortikal primära nervceller. Denna metod tar nytta av spridning och förökning möjligheten av αS giftiga arter som, när lagt till odlingsmediet, kunna bli internaliseras, och inducerar bildandet av mogen αS-positiv aggregat3,4, 5,6,7,8.
Ursprungligen, vanliga metoder för att erhålla bildandet av αS fibriller i cellodlingar baserades på överuttryck av den motsvarande αS cDNA genom regelbundna transfection protokoll eller viral-medierad infektion9. Medan i det första fallet att erhålla LB-liknande αS aggregat var slumpartade, visade låg effektivitet, och berodde på celltypen, det andra protokollet ledde till bildandet av olösliga fibriller, inklusive hög molekylvikt (HMW) arter i 24-48 h från infektion 10. i dessa metoder, bildandet av aggregat var antagligen på grund av en överdriven och obalanserad i αS protein belopp som blir olösliga snarare än en patologisk omvandling av αS konformation som dikterar aggregering. Istället den teknik som vi presenterar här ändrar inte αS uttryck nivån men inducerar utbredd protein aggregation på grund av internalisering av exogena fibriller. Dessutom bildandet av αS aggregat genom förvaltning av exogena fibriller är en långdragen process som kräver dagar eller veckor att bli uttömmande tillåter oss att studera tidiga skedena av αS inneslutningar bildning i en time-lapse mode och att korrelera det med de cellulära biokemiska förändringarna. Vår metod är således en värdefull för att skapa cellular-modeller av αS aggregation som är till hjälp för att studera αS fibrill bildandet mikroskopiskt i förhållande till cellulära patofysiologi.
Dessutom även om administrationen av rå hjärnan extrakt från sjuka αS Transgenic (Tg) möss11,är12 eller mänskliga PD hjärnor6,13 kunna inducera αS nedfall i Tg eller vildtyp (WT) djur, ansökan av samma förfarande att cellkulturer har inte visat sig vara så framgångsrik, möjligen på grund av den låga mängden ballastmaterial i de prover som används och avsaknaden av ett standardförfarande att isolera infödda αS giftiga arter14. På grund av detta, in vitro- förformade fibriller (PFFs) av αS har varit aggregat källan till val tills nu för induktion av αS inneslutningar i celler och djur modeller3,4,6,7 ,15,16. Med våra protokoll, men visar vi att mikrosomer-associerad αS aggregerade arter isolerade från αS Tg möss effektivt kan inducera ackumulering av intracellulära LB-liknande αS införanden i primära nervceller.
I vårt labb är mikrosomer-associerad αS aggregerade arter isolerade från ryggmärgen (SpC) vävnaden i sjuka Tg mössen uttrycker människors A53T αS genen kontrolleras av musen prion protein (PrP) arrangören [Prp mänskliga A53T αS Tg möss, linje G2-317]. Dessa möss visar en åldersberoende neurodegenerativa fenotyp som inkluderar robusta oralmotorisk dysfunktion och bildandet av inneslutningar i det centrala nervsystemet består av fosforyleras, ubiquitineras och olösliga αS, start efter 9 månaders ålder. När oralmotorisk dysfunktion visas, utvecklas fenotypen snabbt till förlamning, start från bakre extremiteterna, som leder till döden i 2-3 veckor. Ackumulering av αS aggregat paralleller visar sig sjukdomen. Möss som offras vid uppkomsten av motorisk dysfunktion visar en robust grad av αS aggregation i SpC, hjärnstammen och lillhjärnan. Det finns ingen anledning att vänta tills förlamning anger för att offra musen. Presymtomatiska möss tas vid 9 månader gamla djur som inte visar motorisk dysfunktion.
Protocol
Användning av WT och Tg djur godkändes och följt i sin helhet av nationellt och internationella lagar för laboratoriet djurskydd och experiment (EEG rådets direktiv 86/609, 12 December 1987 och direktiv 2010/63/EU, 22 September 2010). Alla de protokoll som beskrivs i detta dokument följer djurvård riktlinjer för vår institution.
1. isolering av mikrosomer-associerad αS aggregat från sjuka A53T αS Tg möss
- Förbereda den homogenisering buffert som består av 250 mM sackaros, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EDTA och 1 x fosfatas /-proteashämmare. Hålla bufferten på is.
- Homogenisera färsk eller fryst provmaterial i en 1:10 (w/v) volymen av iskallt homogenisering buffert med en Teflon mortelstöt Homogenisatorer, med 10-15 slag.
- Överföra inledande Homogenatet (1-2 mL) i en mikrocentrifug rör och centrifugera vid 1000 × g under 10 minuter vid 4 ° C med en kyld centrifug för att ta bort kärnor och obruten celler i den resulterande pelleten (P1). Kassera P1.
- Överför supernatanten (S1) till en ren mikrocentrifug rör och centrifugera S1 10 000 × g i 20 min vid 4 ° C med en kyld centrifug för att erhålla andra supernatanten (S10) och pelleten (P10).
Obs: P10 är en rå membran pellet som innehåller mitokondrier och synaptosomes. Kassera P10. - Överför supernatanten (S10) till en polykarbonat flaska (> 1 mL) och centrifugera S10 100.000 × g, för 1 h vid 4 ° C med en ultracentrifugen och en fast vinkel rotor (90 Ti).
Obs: Supernatanten är det ren cytosol bråket medan pelleten, P100, innehåller mikrosomer-associerad αS aggregat. - Återsuspendera pelleten P100 med 500 µL av den homogenisering buffert. Överföring P100 till en ren mikrocentrifug rör och centrifugera vid 10 000 × g i 20 min vid 4 ° C i en kyld centrifug.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera P100 med 100 µL av homogenisering buffert.
Obs: Denna fraktion är mikrosomer-associerad αS aggregaten. - Sonikera prover för 2 s på is [set uteffekt 1 watt (RMS)]. Lagra prover vid-80 ° C.
- Dagen efter, bestämma protein med BCA analys.
2. Western Blot
Obs: Biokemisk karakterisering av mikrosomer-associerad αS aggregaten utvärderas genom Western Blot.
- Kasta en lutning 4-20% Tris-glycin polyakrylamidgel på en vertikal elektrofores apparatur.
- Ladda 1 µg av mikrosomer-associerad αS fraktioner, upplöst i denatureringen prov bufferten.
- I en annan brunn, Ladda 5 µL protein standard markör.
- Kör gelen vid 100 V i ett Tris/glycin/SDS köra buffert tills protein markören når slutet av gelen.
- Överföra proteiner till en nitrocellulosa membran med en grundläggande karbonat buffert (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, 20% metanol) O/N vid 4 ° C, 200 mA, konstant.
- Blockera membranet med PBS-icke-jonaktivt ytaktivt ämne 0,05% (PBS-T) med 5% fettfri torr mjölk i orbitalskak i 30 min på RT.
- Kort, skölj membranet med PBS-T.
- Inkubera membranet med Syn-1 (1:5, 000) eller pSer129-αS-antikropp (1:5, 000) i 2,5% fettfri torr mjölk i PBS-T, O/N vid 4 ° C i orbitalskak.
- Tvätta membranet i 10 min på RT med PBS-T i orbitalskak.
- Inkubera membranet med antimus eller anti-kanin HRP-konjugerad sekundär antikropp (1:3, 000) i 2,5% fettfri torr mjölk i PBS-T för 1 h på RT.
- Tvätta membranet i 10 min på RT med PBS-T i orbitalskak. Upprepa 3 x.
- Få signalen via den vanliga chemiluminescence kit.
3. primära neuronala kulturer
Obs: Primära neuronala kulturer var beredda från WT nyfödda (P0) mus hippocampus eller cortex (linje C57BL/6). Hela proceduren, minus centrifugering stegen, genomförs under en cell kultur huva, i sterila förhållanden.
- Behandla coverslips (18 mm Ø) med 65% salpetersyralösning för minst 12 h på RT.
- Ta bort salpetersyra. Skölj coverslips två gånger med PBS 10 x och flera gånger med destillerat vatten.
- Infoga coverslips i 24-väl rätter och belägga dem med poly-D-lysin (0,1 mg/mL i sterilt destillerat vatten eller PBS 1 x) för 1 h vid 37 ° C.
- Ta bort poly-D-lysin och tvätta coverslips tre gånger med destillerat vatten. Lagra dem vid 4 ° C tills den behövs.
- Avliva musungar genom halshuggning och separata huvuden från kroppar. Placera huvudet på rätter och dissekera försiktigt huden.
- Genom att använda fina sax, öppna skallen genom att göra ett snitt på baserna av hjärnor. Separera de två halvorna av skallar och ta bort dem försiktigt.
- Med hjälp av tången, nyp av hjärnor från baserna och isolera hjärnbarken och hippocampus. Överföra dem i två separata rätter som innehåller Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) medium som innehåller 1% penicillin/streptomycin.
- Upprepa steg 3.6 och 3.7 för varje djur. Tänk på att hela processen inte bör ta mer än 30-45 min.
- Finhacka de insamlade vävnaderna och överföra dem till två 50 mL koniska rör (en för hippocampus) och en för cortex med 10 mL HBSS medium innehållande Trypsin 0,1%. Inkubera i vattenbad under 7 minuter vid 37 ° C.
Obs: Ingen agitation krävs. - Tillsätt 1 mL DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 10 µg/mL DNAS till Homogenatet att blockera trypsin.
- Centrifugera den resulterande dissocierade vävnaden på 200 × g i 5 min på RT på en centrifug och avlägsna supernatanten.
Notera: Pelleten representerar cellerna dissekeras från vävnaden. - Att resuspendera cellerna i bordläggningen medium, som innehåller 2% B27, 2 mM glutamin, 6 mg/mL glukos 10% FBS, 12,5 µM glutamat och 10 µg/mL gentamicin.
- Plattan dissocierade nervceller på poly-D-lysin coverslips i 24 plattor enligt förhållandet: 1 cortex/12 brunnar och 1 hippocampus/6 wells, vilket resulterar i ca 150 000/200 000 celler per brunn. Upprätthålla cellerna i inkubatorn vid 37 ° C.
- Dagen efter (dag i vitro, DIV 1), ersätta plätering medium med medium innehållande 2% B27, 10 µg/mL gentamicin och 2 mM glutamin.
- På DIV 2, ta bort 1/3 av medium och Lägg till 1/3 av färskt medium innehållande 2,5 µM cytosin arabinoside för 48 h att minska gliaceller kontaminering.
- Upprätthålla nervceller vid 37 ° C och ersätta hälften av medlet var tre dagar.
4. nervceller behandling
Obs: Behandlingen har utförts på DIV 7. Alla steg bedrivs under en cell kultur huv i sterila förhållanden. Ett exempel på kortikal neuronala kultur densitet vid DIV 7 illustreras i figur 1.
- Pool mikrosomer-associerad αS aggregat erhållits från ryggmärg från tre olika sjuka Tg möss för att ha en 1 µg/µL lösning, med den ursprungliga homogenisering buffert för utspädning.
- Ta bort 1/3 av medium och ersätta det försiktigt med den färska medium innehållande 2% B27, 1 x gentamicin och 2 mM glutamin.
- Lägg till 1 µg av poolade mikrosomer-associerad αS aggregat till cell medium. Returnera nervceller i inkubatorn vid 37 ° C.
- Varje 3 dagar för 1 vecka, Lägg till 1/3 av färskt medium. Ersätt inte mediet. Bara lägga.
- Efter 1 veckas behandling, ta bort 1/3 av medium och ersätta det försiktigt med färska medium innehållande 2% B27, 10 µg/mL gentamicin och 2 mM glutamin. Upprepa varje 3 dagar.
- Fixa nervceller efter 2 veckors behandling (DIV 21).
5. immunofluorescens
- Fixa nervceller med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS 1 x och 5% sackaroslösning i 15 min på RT utan skakningar, under en kemisk rök huva.
- Ta bort fastställande lösningen. Kort, tvätta med PBS 1 x, 3 gånger.
Obs: Att utföra alla tvätt steg försiktigt eftersom primära nervceller inte fastnar ordentligt poly-lysin coverslips. - Permeabilize nervceller med 0,3% av icke-jonaktivt ytaktivt ämne i PBS 1 x 5 min på RT.
- Kort, tvätta med PBS 1 x, 3 gånger.
- Inkubera nervceller med 3% FBS i PBS 1 x för 30 min vid RT, blockera ospecifikt bindande platser, i orbitalskak.
- Inkubera nervceller med lämplig primär antikropp upplöst i 3% FBS i PBS 1 x, O/N vid 4 ° C i orbitalskak.
Obs: syn303 (1:1, 000), mus αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000) och Tau (1:10 000) antikroppar användes. - Ta bort den antikropp lösningen och tvätta, kort, med PBS 1 x, 3 gånger.
- Inkubera nervceller med lämpliga fluorescerande sekundär antikropp upplöst i 3% FBS i PBS, för 1 h på RT i mörkret i orbitalskak.
- Ta bort den antikropp lösningen och tvätta, kort, med PBS 1 x, 3 gånger.
- Fläcken nervceller med DAPI lösning (0.1 µg/mL i PBS 1 x) under 15 minuter vid RT i mörkret i orbitalskak.
- Ta bort den antikropp lösningen och tvätta, kort, med PBS 1 x, 3 gånger.
- Montera coverslips på en bild genom att använda antifade monteringsmedium.
Representative Results
Efter protokollet beskrivs ovan och som sammanfattas i figur 2, vi renat mikrosomer-associerad αS aggregat från tre sjuka A53T αS Tg möss (figur 3). Mikrosomer är rå membran pellet fraktioner som innehåller det endoplasmatiska retiklet och Golgi små synaptiska vesikler. Renhetsgrad av mikrosomala pelleten jämfört med andra fraktioner utvärderades tidigare använda specifika organell markörer18.
När isolerade, bedöms biokemisk karakterisering av αS aggregat genom denaturering SDS-Page, följt av inkubation med Syn-1 eller fosforylerade αS på Serine 129 (pSer129-αS) antikropp. Jämfört med presymtomatiska (PreS) och åldersmatchade icke-Tg (nTg) möss, mikrosomer isolerade från sjuka möss samtidig fällning med αS aggregat. Mikrosomer-associerad αS arter Visa typiskt för αS aggregat, såsom ansamling av HMW tvättmedel-resistenta arter, fosforylering på Serin 12919 och C- och N-terminala trunkeras fragment (för en fullständig karakterisering av mikrosomer-associerad αS aggregat se referens18,20,21). Dessa är de grundläggande kraven eftersom monomer αS inte få effektivt internaliseras och inte inducerar αS nedfall7,15,22. Det är viktigt att inte använda något rengöringsmedel (Joniska eller icke-joniska) att resuspendera P100 pellets eftersom det kan vara skadligt för celler. Också, undvika prov variation, mikrosomer-associerad αS aggregat från tre olika sjuka möss kommer poolas för neuronal behandling.
Administrering av 1 µg av poolade mikrosomer-associerad αS aggregat från sjuka A53T möss till odlingsmediet av kortikala eller Hippocampus nervceller inducerar en tidsberoende bildandet av αS inneslutningar, positiva för aggregat-specifika αS antikroppar som Syn303 (figur 4, 5) eller pser129-αS (figur 5). Efter två dagar (2d) behandling dessa aggregat visas som små, spridda puncta som blir rikligare vid senare tidpunkter. Efter två veckor, αS inneslutningar likna länge och mogen pärlor-liknande strukturer, tungt spridda över hela den neuronala kulturer, efter ett neurite mönster och delvis Co lokalisera med presynaptiska och neuriter markörer (figur 5). Nybildade αS inneslutningar kan ibland ses samtidig lokalisera och färga den cell soma eller täcka hela processen, som liknar nekrotisk neuriter.
Även om mikrosomer-associerad αS aggregat fraktioner kan effektivt sprida i neuronala kulturer, måste deras belopp vara noggrant lyhörd för antalet neuroner pläterade (figur 1). I själva verket överstiger rekommenderade förhållandet, µg av mikrosomer-associerade aggregat: antal nervceller, kommer att framkalla för tidig celldöd inom några dagar (figur 6), medan en otillräcklig mängd mikrosomer-associerad αS aggregat kommer att leda till en knappa och minskat antal inneslutningar efter två veckors behandling, liknar vad erhölls vid tidigare tidpunkter (figur 4A).
Figur 1 . Kortikala neuronala kulturer. Representativ bild visar densitet på DIV 7 i kortikala neuronala kulturer. Bilder är tagna med ett inverterat ljusmikroskop, 10 X-objektiv. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Isolering av mikrosomer-associerad αS aggregat från mus SpC. Flödesschema över protokollet rening av mikrosomer-associerad αS aggregat från SpC sjuka möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Isolering av mikrosomer fraktioner från sjuka, presymtomatiska A53T αS Tg och nTg möss. Western blot analys visar renat mikrosomer-associerad αS aggregat isolerade från tre sjuka (sjuka), presymtomatiska (PreS) och äldre-matchade nTg möss. Sjuka möss är A53T αS Tg möss som visar den motoriska och neurologisk dysfunktion, inklusive ackumulering av αS inneslutningar, medan presymtomatiska djuren är friska A53T αS Tgs 9 månader av ålder som inte visar ännu någon αS patologi relaterade fenotyp. nTg möss är kullsyskon sjuka möss som bär inte den αS transgenens och därför inte utveckla αS inducerad patologi. 1 µg av varje renat fraktioner var körs på en denatureringen SDS-Page, överförs på ett nitrocellulosa membran och utplånas med Syn-1 eller pSer129-αS antikropp. Bara mikrosomer fraktioner isolerade från sjuka möss innehöll HMW tvättmedel-resistenta αS aggregat som fosforyleras på Serin 129 och visade C- och N-terminala trunkering. Denna siffra har anpassats från Colla o.a. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Tidsberoende induktion av αS nedfall efter administrering av mikrosomer-associerad αS aggregat. (A) immunofluorescens av primära Hippocampus nervceller behandlas med 1 µg mikrosomer-associerad αS aggregat fraktioner som poolats från tre olika sjuka möss. Nervceller har åtgärdats på 2 dagar (2d), 1 vecka (1w) eller 2 veckor (2w) behandling och immunostained med syn303 (S303, 1: 1000), en antikropp som är specifik för oxiderade och samlad αS. Cellerna var counterstained med DAPI. Confocal bilder togs med hjälp av en laser skanning confocal Mikroskop, 63 X-objektiv. Skalstapeln = 50 µm. (B) kvantitativ analys av total fluorescence, efter bakgrunden subtraktion, gjordes med hjälp av partiklar greve plugin av programvaran Image J. Värden var normaliserade för antalet kärnor per fält (DAPI count) och uttryckt i procent av S303 fluorescens signalen på 2D. Värdet anges som det medelvärde ± SD (n = 5). ** p < 0,001, *** p < 0,00001, envägsavgift ANOVA, följt av Fishers LSD post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Intracellulära αS inneslutningar colocalize med kortikala neuriter nätverk. Representativa confocal bilder av kortikala nervceller behandlas med mikrosomer-associerad αS aggregat från sjuka Tg möss. Efter 2 veckor av behandling nervceller var fasta och dubbel fläckade aggregat-specifika antikroppar [S303 (A, B) eller pser129-αS, 1:1,000 (C)] och neurite markörer [mus αS, 1: 200 (A, B) eller Tau, 1:10,000 (C)]. Co märkning av fluorescerande signalerna visade partiell samtidig lokalisering av nybildade αS pärla-liknande strukturer med neuriter nätverket. Ibland ackumuleras αS inneslutningar inom den neuronala soma (A, B, pilspetsar). Staplade bilder förvärvades med laser skanning confocal Mikroskop, 63 X-objektiv. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Colla o.a. 20. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Tillsats av suboptimal mängd mikrosomer-associerad αS aggregat är giftigt för nervceller. DAPI färgning av nervceller som behandlats med ökande koncentration av mikrosomer-associerad αS aggregat leder till celldöd. (A) kortikala nervceller behandlades med 1, 2 µg av mikrosomer-associerad αS aggregat utvinns från sjuka möss eller bara buffert som inte innehåller aggregat (B) och fläckade DAPI. Fluorescerande bilder förvärvades med ett epi-fluorescens Mikroskop använder ett 20 X-objektiv. Skalstapeln = 100 µm.(B) DAPI-positiva celler räknades med programvaran Image J. Diagrammet visar en minskning av antalet kärnor med ökande koncentration av mikrosomer-associerad αS aggregat till neuronala media. Värdena uttrycks som procent av b och ges som den medelvärde ± SD (n = 5), *** p < 0,0001, envägsavgift ANOVA, följt av Fishers LSD post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi beskrivs en metod för att erhålla bildandet av αS inneslutningar i hjärnan som härrör primära neuronala kulturer från WT möss, genom tillägg av renat mikrosomer-associerad αS aggregat isolerade från αS Tg djurmodeller.
Kritiska steg i detta protokoll är följande: förhållandet mellan µg mikrosomer-associerad αS aggregat/nervceller och källan av αS aggregat. Som visas i resultaten sessionen, är det viktigt att optimera förhållandet mellan µg för mikrosomer-associerad αS aggregat/antal nervceller eftersom arbetar under suboptimala förhållanden kan leda till för tidig celldöd eller alltför knappa intracellulära aggregation (se den Representativa resultat avsnitt). På grund av detta är det mycket viktigt att bedöma tätheten av neuronala kulturen på DIV 7 (visas i figur 1) innan behandlingen inleds. Dessutom har αS aggregat som renas från sjuka αS Tg möss, dvs. från djurmodeller som ansamlas kännetecknas LB-liknande inneslutningar av fosforyleras och tvättmedel olösliga αS HMW fibriller.
Eventuella ändringar i detta protokoll betraktar vävnaden, frysta eller färska, från vilka mikrosomer kan isoleras och utgångsbeloppet. Medan vi använde SpC av Tg möss på grund av det höga innehållet av αS olösliga aggregat, är protokollet lämplig att isolera mikrosomer-associerade aggregat från alla vävnader, förutsatt att området har ett högt innehåll i αS aggregat. Frysta prover kan också användas eftersom frysning inte påverkar reningssteg mikrosomer-associerade aggregat eller de aggregat i sig. Medan de rekommenderade startvikt för vävnader är ca 100-150 mg, detta protokoll är lämplig för att erhålla mikrosomer från så lågt som 50 mg råvara (ingen maximal viktgräns). När det gäller beloppet som är lägre än 100 mg, dock kommer att lämpliga homogenisering förhållandet vara 1:20 (w/v) för att ha minst 1 mL av supernatanten S10 att ladda på polykarbonat flaskan för ultracentrifugen utfällningen. I själva verket kan lastning volymer mindre än 1 mL resultera i kollapsen av röret och prov förlust. Öka volymen homogenisering kommer att leda till en mer utspädda supernatant men koncentrationen av mikrosomala pelleten förblir opåverkad.
En begränsning av detta protokoll gäller den ineffektiva cross-sådd i bildandet av αS inneslutningar som nyligen har rapporterats i fall administrationen av αS PFFs av mänskligt ursprung murina neuronala kulturer i motsats till mus αS PFFs24. Eftersom öka mängden av exogena αS fibriller ges till murina kulturer kan kringgå det här problemet, rekommenderar vi att fint justera mängden mikrosomer-associerade aggregat vid administrering av fibriller som erhållits från andra αS varianter eller från olika arter att musen neuronala kulturer än vad vi beskrivit.
Exogena αS aggregat till kultur media kan vara från olika källor. In vitro αS PFFs har tidigare använts som sådd mall av intracellulära αS aggregat i cellkulturer, primära nervceller och djurmodeller3,7,8,15. Jämfört med vår metod där mikrosomer-associerad αS aggregat kan isoleras i några timmar, är bildandet av PFFs lång och mödosam, som kräver flera steg av reningar, följt av ytterligare analyser att kontrollera αS aggregerar confomations25 . Dessutom PFFs erhålles från bakteriell-uttryckta mänskliga eller mus αS, dvs saknar posttranslationell ändringar typiska för Eukaryoter, kan presentera olika konformationer, med selektiv sådd och patogena egenskaper, enligt protokollen kärnbildning följt (dvs band vs fibriller)5,8 leder till olika resultat och slutsatser. I stället garanterar engångsadministrering av i vivo renat αS aggregat överföring av mer autentiska patogena mallar, härma nära processen för bildandet av αS inneslutningar i djurmodeller och PD-patienter.
Som en framtida tillämpning av denna teknik tror vi att detta protokoll kan användas framgångsrikt isolera αS patogena frön från hjärnan av PD patienter eller andra αS Tg djurmodeller, förutsatt att sjuka området varav mikrosomer är isolerade är rika på αS inneslutningar.
Till vår kunskap är detta den första metoden som gör att rening av inhemska giftiga arter av αS från i vivo PD-modeller för att användas som seedning mall för att erhålla bildandet av αS införanden i primära nervceller.
Vi anser att denna metod är extremt mångsidig och kan erbjuda en enastående cell-baserad modell för att studera olika aspekter av αS aggregation och dess påverkan på cell patofysiologin. Eftersom bildandet av αS inneslutningar representerar en komplex process som har varit svårt att replikera i odlade celler, har vi gott hopp att denna modell kommer att ge stora insikter i akut patogena mekanismer, svårt att identifiera i kronisk och mer genomarbetade system är som djurmodeller.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av det italienska ministeriet för universitet och forskning (MIUR) genom karriär återanpassning grant systemet (RLM Program för unga forskare) och från Scuola Normale Superiore. Vi tackar Prof Michael Lee från University of Minnesota, USA, för att ge den Prp mänskliga A53T αS Tg möss, som aggregat är isolerade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
