Summary
잎 스프레이 질량 분석 샘플 준비를 최소화 하 고 착 색 인쇄기, 식물 조직에서 작은 분자의 급속 한 탐지에 대 한 수를 제거 하는 직접적인 화학 분석 기술 이다.
Abstract
식물은 그들의 화학 속성에 다양 한 작은 분자의 수천을 생성 합니다. 질량 분석 (MS)는 높은 감도와 특이성 분자 중량을 제공 하기 때문에 식물 대사 산물을 분석 하기 위한 강력한 기술입니다. 잎 스프레이 MS 공장 조직 분무, 제거 과정에서 크로마토그래피를 통해 직접 화학 분석을 위해 사용 되는 주변 이온화 기법입니다. Metabolites 샘플링을이 이렇게 다양 한 화학 클래스에 대 한 샘플 준비 필요 최소화 그대로 식물 조직에서 동시에 검출 될 수 있습니다. 고해상도, 정확한 대량 MS와 함께 사용 하면 잎 스프레이 MS의 대사 산물의 급속 한 탐지를 촉진 한다. 그것은 또한 복합 식별을 용이 하 게이 기술 함께 탠덤 질량 조각화 데이터 수집 가능입니다. 정확한 질량 측정 및 조각화의 조합 복합 정체성 확인에 도움이 됩니다. 잎 스프레이 MS 기술 nanospray 이온화 소스에 약간의 수정만을 요구 하 고 더 질량 분석기의 기능을 확장 하는 유용한 도구입니다. 여기, Sceletium tortuosum (Aizoaceae), 남아 프리 카 공화국에서 전통적인 약용 식물에서에서 신선한 잎 조직을 분석 된다; 수많은 mesembrine alkaloids 잎 스프레이 MS와 검색 됩니다.
Introduction
식물에는 다양 한 화학 특성을 가진 작은 분자의 다양 한 포함 되어 있습니다. MS 검색 및 대사 산물1의 식별에 대 한 높은 감도와 특이성 원소 구성을 제공할 수 있습니다 때문에 식물 화합물을 분석 하기 위한 강력한 기술입니다. 가장 일반적으로, MS는 MS 분석1전에 크로마토그래피에 의해 구분 되는 용 매 추출 샘플에 수행 됩니다. 그러나, 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용 하 여 긴 분석 시간을 요구 하며 관련 된 광범위 한 샘플 준비1자주 됩니다. 반면, 크로마토그래피 circumvents 그대로 조직의 직접적인 화학 분석은 매우 빠른 기술, 요구 하는 최소한의 샘플 준비2. 따라서, 경우에 컬럼에 단계를 forgone 있습니다 어디, 직접 화학 분석 매우 유리한 수 있습니다.
천연 제품 및 대사체학 연구를 위한 전형적인 액정-MS 냉동 또는 말린 식물 재료를 포함 하는 여러 조직 및 세포 유형3의 긴 대량 추출에 의존 합니다. 또는 식물 조직에서 대사 산물의 MS 검출 등의 직접적인 화학 분석 종류를 분리 하 고 준비 유물4를 피할 수 있습니다. 잎 스프레이 MS, 조직-스프레이5,6, 라고도 본질적으로 아무 샘플 준비5,7필요로 하는 직접적인 주변 이온화 MS 기술입니다. MS는 밀접 하 게 종이 스프레이 MS, 종이7에 예금 된 analytes의 검출을 허용 하는 분무 이온화의 특성을 가진 주변 이온화 기술 관련이 잎 스프레이. 이름, 불구 잎 스프레이 MS는 다양 한 유형의 식물 조직에 적용, 아니라 나뭇잎, 그리고 되었습니다6,,89, 과일, 씨앗, 뿌리, 꽃, 조직과 tubers, 다른 사람 사이 시연 10,,1112. 기술은 탐지8질량 분석기로 공장 설비 재료에서 직접 생 phytochemicals의 이온화를 촉진 한다. 잎 스프레이 MS 또한 다른 조직 유형 식물13에서 화학 물질의 공간 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잎 스프레이 MS 용 매 추출 및 LC-MS와 비교 하는 경우 결과 잎 스프레이 MS trichomes13등 독특한 셀 형식에서 표면 대사 산물의 급속 한 탐지에 대 한 수 있습니다 제안 합니다. 그림 1 에서는 잎 스프레이 MS 실험 설정을 보여 줍니다. 직접 분무 이온화만 사소한 소스 수정 후 발생합니다. 금속 클램프를 통해 식물 조직에 적용 되는 높은 전압, 테일러 콘 운반 양 분무의 이온 유입에 이온을 형성 하는 고도로 청구 방울 스프레이 생산 이온화 발생 또는 용 매 appl에서 식물의 자연 액체에서 식물 표면에 폭발물입니다. 조직에 뾰족한 팁은 분무를 용이 하 게 하 고 자연스럽 게 발생 또는 수 만든 절단 하 여.
잎 스프레이 MS은 다양 한 응용 프로그램에 대 한 유틸리티 있는 그대로 식물 조직의 질적 및 반 정량 분석에 대 한 빠른 방법입니다. 예를 들어 기술 관련된 종, 구별 하 고 다른 조건 하에서 성장 하는 동일한 종에서 변화를 평가 내 인 성 화합물을 검출 하기 위하여 사용 되었습니다. 이전 연구이 방법은 beautyberry (새 나) 대사 산물을 측정 하 여 12 및 미국 인삼 (Panax quinquefolium L.) 6. 후자의 예에서 ginsenosides, 아미노산, 및 oligosaccharides 검출 될 수 원시 인삼 조직 일로 후. 야생 및 재배 미국 인삼은 괴 조각6에서 분화 되었다. 삼 괴 무결성 성공 잎 스프레이 MS, 후속 형태학 및 현미경 검사6에 대 한 허용 되는 보존 되었다. 또한, 공장 샘플에 외 인 화합물도 감지할 수 있습니다. 농약 (acetamiprid, diphenylamine, imazalil, linuron, 및 thiabendazole) 수 껍질 또는 과일과 야채9의 펄프에서 발견 되었습니다. 이러한 연구와 많은 다른 다양 한 특정 목적을 위한 잎 스프레이 MS의 유틸리티를 표시는, 상세한 프로토콜 하지 이전 보고 되었습니다.
여기, 프로토콜 설명 방법 특정 조직에 대 한 또는 화합물의 최적화에 집중 하지 않습니다. Mesembrine 알 카 로이드에서 Sceletium tortuosum (나) N.E.Br (Aizoaceae)의 탐지 종족, 조직에 대 한 리프 스프레이 MS 실험을 설정할 때 수행 해야 하는 필요한 최적화 대책을 논의 하기 위해 예제로 사용은 오히려, 또는 처음으로 compound(s)입니다. S. tortuosum 는 남아 프리 카 공화국의 반건조 Karroo 지역에 즙이 발병입니다. San의 전통 의학 및 코 코 사람들, 식욕과 갈증을 억제 뿐만 아니라 그것의 정신 및 진통 효과14,15에 관해서는 위해 이용 되었다. 현재, 표준화 된 추출 물 정신병과 신경 심리적 장애16,17의 치료에 사용 됩니다. 관심의 주요 화합물에는 알칼로이드 mesembrine와 그 파생 상품, 어떤의 대부분은 또한 관련된 Sceletium 종15에 발견 포함 됩니다. S. tortuosum 의 야생 및 재배 인구는 mesembrine alkaloids의 가변 농도 따라서 품질 관리 도전18을 제시. Mesembrine 알 카 로이드, 잎 스프레이, MS 등의 급속 한 탐지 하는 방법 Sceletium 제품 모니터링에 유용할 수 있습니다. 때문에 이전에 잎 스프레이 MS 기술에 대 한 더 자세한 시각적 실험 프로토콜 왔다, 우리는 S. tortuosum의 예를 사용 하 여 메서드를 보여주는 것입니다 다음 설명: nanospray 소스 수정에 선택 및 식물 조직의 준비, 데이터 수집, 결과의 해석 및 MS 매개 변수의 최적화.
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Protocol
1. 잎에 대 한 Nanospray 소스 수정 스프레이 MS
- 잎 스프레이 MS에 대 한 수정된 nanospray 소스를 사용 합니다. 으로 유체 구성 잎 스프레이 MS, 소스에서 LC 프로브를 제거 하 여 소스를 수정 합니다.
- 조립 잎 스프레이 MS 철사를 소스에 연결에 대 한 적절 한 핀 식물 조직에는 전압을 적용 됩니다. 솔더 핀 절연된 전선;의 한쪽 끝을 솔더 와이어의 반대쪽 끝을 클램프.
참고: 클램프 (악어 클립 타입) 되거나 치아를 없을 수 있습니다. 작은 조직에 대 한 치아 없이 클램프가 좋습니다. 클램프와 선택적 플렉스 팔 위치 식물 조직에 도움을 nanospray 소스에 추가할 수 있습니다. 이 프로토콜 특히 하이브리드 4 극 자 이온 함정 질량 분석기 MS 시스템에 잎 스프레이 MS를 수행 하는 방법을 설명 하는 참고 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오); 그러나, 다른 MS 시스템 수행이 기술은6을 변경할 수 있습니다. 잎 스프레이 커플링 MS 휴대용 질량 분석기 실시간 화학 분석을 수행할 수 있습니다 현장 실험실19,20공장 설비 재료를 수송 하는 필요 없이. - 소스는 소스에서 높은 전압을 사용 하는 경우 발생할 수 있는 전기 방전을 줄이기 위해 아래 바닥에는 정전기 방지 바닥 매트를 배치 합니다.
2. 잎 스프레이 ms MS 시스템의 준비
- 시스템 최근 사용 되었습니다, 그것은 냉각 하는 터치 하 고 대체 소스 및 스윕 콘 제거 허용 합니다. Nanospray 잎 스프레이 MS 소스를 첨부 합니다.
- 다음과 같이 설정 하는 적절 한 이온화 매개 변수 조정 파일을 만듭니다: 칼 집, 보조, 그리고 청소 가스 0; 2-5 kV; 스프레이 전압 모 세관 온도 150-250 ° c; 그리고 50 S 렌즈 RF 레벨. 원하는 매개 변수8,13조정 파일을 저장 합니다. 전압 및 온도 조직의 최고의 이온화와 관심의 compound(s)에 대 한 최적화.
참고: 좋은 시작 포인트는 4 kV와 200 ° C - 와 잎 스프레이 MS 조정 파일을 포함 하 여 방법 파일: 긍정적이 고 부정적인 전체 MS; 70000;의 해상도 1 x 106;의 AGC 대상 최대 200 ms;의 그것 그리고 원하는 스캔 범위 m/z. 또는, 1 극성을 사용 합니다.
3. 악기, 용 매, 및 식물 조직 준비
참고: 항상 장갑을 착용 하 고 맨 손으로 처리 된 식물 조직을 사용 하지 마십시오. 그렇지 않으면, 폴 리 에틸렌 글리콜 등 오염 이온 것 이다 스펙트럼을 지배 하 고 있다.
- MS 시스템 빠른 샘플링을 같은 방에 분석에 대 한 식물 조직을.
- 자연스럽 게 뾰족한 끝이 없는 식물 조직에 대 한 유리 슬라이드에 면도날을 사용 하 여 잘라 테이퍼 포인트 (그림 2). 악기 감도, 조직 유형, 그리고 관심의 compound(s)에 따라 분석에 필요한 조직의 양을 결정 (예를 들어, 젊은 S. tortuosum 잎 길이 즉 ~ 5 m m).
- 잘라 S. tortuosum 10 주에 각각 포인트를 테이퍼 끝을 얇은 스트립으로 후 발 아 나뭇잎.
- 집게를 사용 하 여 부드럽게 채워 것입니다 끝에 식물 조직을 선택 합니다. 조직 집게로 잡고, 신중 하 게 그것을 옮길 클램프.
주의: 경우에 전압은 악기 소스를 만지지 마십시오. - 유연한 팔과 와이어 클램프 식물 조직과 MS의 이온 입구 사이의 거리는 5-10 m m 3 배 4 중 극 (예를 들어, TSQ)에 대 한 MS 입구 라인 조직 위치 조정 및 선형 함정 4 중 극 (LTQ) 및 10 -이온 트랩 질량 분석기 (예를 들어, orbitrap)850 m m.
- 소스에는 와이어의 반대쪽 끝을 연결 합니다. 첫 번째 시도 낮은 신호 강도 생성 하는 경우 이온 입구 가까이 식물 조직 이동 (최적화에 대 한 논의 를 참조).
- 방법 파일; 데이터 파일의 이름을 지정 하 고 파일 저장 위치를 설정 합니다. 다음 MS 시스템에서 재생 을 클릭 하 여 설정 하 고 데이터 획득을 시작 하려면 시작 을 클릭 합니다.
- 용 매 (예를 들어, 메탄올) 적용 손과 사용자를 보호 하기 위해 높은 전압 사이의 거리를 최대화 하기 위해 젤 로드 팁을 피펫으로 사용 하 여.
참고: 용 매 볼륨 필요한 크기, 건조, 및 직물의 질감에 따라 달라 집니다, 일반적으로 잎 2 ~ 20 µ L. S. tortuosum 필요 하지 않습니다 추가 하는 어떤 용 매. 신중 하 게 용 매를 적용 하 고 때에 전압은 악기 소스를 만지지 마십시오. LC MS 학년 용 매 및 산 세척 되었습니다 하 고 세제의 무료로 유리를 사용 합니다. 일부 조직에서 신호 식물 조직의 자연 물 콘텐츠 인 용 매를 추가 하지 않고 관찰할 수 있습니다. 그러나, 더 큰 신호 강도 및 감소 된 S/N 일반적으로 조직에 용 매를 적용 하 여 달성 된다. - 신호 지속으로 또는 적절 한 스펙트럼이 수집 될 때까지 데이터를 수집 일반적으로 30-60 s. 필요한 경우, 추가 용 매는 더 긴 시간 동안 높은 신호 강도 유지 하기 위해 적용 됩니다. 데이터 수집을 중지 하 고 MS 시스템 일시 중지.
- 조직을 제거 하 고 세척 100% 메탄올과 보풀 지우기와 클램프. 공급 업체의 사양에 따라 잎 스프레이 MS에 의해 약 1-2 h 인수 후 MS 이온 입구 청소. 또한, 다른 조직 유형 분석 사이 MS 이온 입구 청소.
4. 데이터 품질 평가
- 데이터 파일을 열고 기본 피크 대량 chronogram를 육안으로 직접 검사 합니다. 신호 강도 5.0 x 10 ~1.0 x 107 인지 확인8. 신호가 낮은 경우에, 이온 유입에 조직 가까이 이동 합니다. 높은, MS 시스템의 프런트 엔드는 더러운 될 것 이다, 그래서 이온 입구에서 조직을 이동 합니다.
- 생산 하는 질량 스펙트럼의 이온의 유무에 따라, 매개 변수를 변경 합니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
5. 협동 대량 파편
- 이온 탠덤 대량 조각 (MS/MS);에 대 한 관심은 결정 > 1.0 x 10은 질량 스펙트럼 신호5 MS/MS에 대 한 이온의 선택에 대 한 충분 하다.
- 4 소수 자릿수 밖으로 m/z 의 포함 목록으로 새로운 방법 파일을 만듭니다. 전역 목록 및 포함을 클릭합니다. PRM의 속성선택 조각화 에너지 [예를 들어, 30-50의 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터)에 좋은 범위는 시작] 및 다른 MS/MS 매개 변수.
- Mesembrine 알 카 로이드에 대 한 MS/MS 데이터를 얻기 위해 다음 이온, 276.1583 m/z, 290.1742 m/z및 292.1897 m/z, 후부 터 35 조각화.
참고: MS 후 즉시 또는 나중에 MS/MS 데이터 수집을 수행할 수 있습니다. 동일한 조직 수 자주 채워 후 전체 MS 고 MS/MS 데이터를 다시 사용할 수 있습니다. 그러나, respraying는 충분 한 신호를 제공 하지 않으면, 새로운 조직을 사용 합니다.
- Mesembrine 알 카 로이드에 대 한 MS/MS 데이터를 얻기 위해 다음 이온, 276.1583 m/z, 290.1742 m/z및 292.1897 m/z, 후부 터 35 조각화.
- MS/MS 방법 파일 명명 된 데이터 파일을 로드 합니다. 켜고 MS 시스템 데이터 획득, 필요한 경우 용 매를 추가 시작 합니다. 적절 한 스펙트럼이 수집 하는 때 일반적으로 30-60 s 후 중지 인수.
- 조각 이온을 할당할 때 많은 다른 에너지 조각을 수집 합니다.
참고: 이후 잎 스프레이 MS 컬럼에 분리 부족, 조각화 스펙트럼 많은 이온을 포함과 선명도가지고 도움이 될 것입니다 다른 에너지에서 분할 합니다.
6. 상 상속 식별 정확한 질량과 탠덤 질량 조각화 하 여
- Metlin21, 인간의 대사체 데이터베이스22, 대량 은행23, 지질 지도24, 국립 연구소의 공개적으로 사용 가능한 대사 산물 데이터베이스에서 정확한 질량 측정을 참조 하 여 상 상속 신원 확인 표준 및 기술 MS 검색25, Phytochemicals26또는 GNPS27에 대 한 존중.
- 이러한 데이터베이스는 완전 한, 필요에 따라 화학적 특징 식물 종에 추가 문학 검토를 수행 합니다.
- 잎에서 일치 조각화 이온 스프레이 MS/MS MS/MS 정보는 때 상기 데이터베이스 또는 문학. MS/MS 조각 이온의 수동 해석 또는 직접 분사 또는 LC-MS/MS에 의해 수행 하는 정통 표준의 조각화를 또는 사용.
7. 데이터 분석
- Proteowizard28에서 msConvert 도구 mzXML 파일을 MS raw 파일을 변환 합니다.
- 최대 따기에 대 한 R에서 구현 XCMS 소프트웨어 패키지를 사용 합니다. 사용 하 여 직접 주입 처리 잎 스프레이 MS 분석 방법.
참고: 잘 주석 스크립트 데이터 처리에 사용 되는 https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code에서 찾을 수 있습니다. - 반 정량적 측정, 실험 가변성에 대 한 회계 표준화 각 대사 산물의 강도 총 이온 전류 (TIC)에 의해 잎 스프레이 MS 신호 강도 다를 수 있습니다, 일부의 위치에서 약간의 변화 때문으로 소스와 잎 모양과 크기 차이에 잎.
- 또는 사용 하 여 데이터 분석 또는 MZmine2에 대 한 공급 업체에서 제공한 소프트웨어 (http://mzmine.github.io/에서 찾을 수)29.
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Representative Results
10 주 후 발 아, 갓 수집 온실 재배 S. tortuosum 단풍 잎 스프레이 MS에 의해 분석 되었다. S. tortuosum 에서 대사 산물을 검출 하기 위한 실험 워크플로 MS는 그림 2에 나와 있는 잎 스프레이 사용 하 여 나뭇잎. 잎 선정, 테이퍼 끝 포인트를 형성 하는 얇은 스트립으로 잘라 되었고 잎 스프레이 MS 와이어 클램프 기구와 고정. 식물 조직 이온 입구에서와 x 축 및 y 축의 ~ 30 mm은 배치 했다. S. tortuosum 의 MS 단풍 잎 스프레이의 시작 시 이온 용 응용 프로그램 없이 발견 했다. Sceletium 가족의 식물 succulents 분무 이온화 용 매의 외부 응용 프로그램 없이 잎 스프레이 MS에 의해 가능 하 게 높은 함량으로 두꺼운 잎은. 그러나, 가장 일반적으로 식물 조직 이온 검출 용 응용 프로그램이 필요 합니다.
대량 chronogram 및 무 겁 게 이온 채워집니다 질량 스펙트럼 30 후 제작 s 긍정적인 이온화 모드 (그림 3)에서 인수. chronogram MS 실험 안정적인 신호 취득의 전체 기간 동안 유지 했다 성공적인 잎 스프레이 나타냅니다. 본이 연구에서는 총 9 mesembrine 미치 죠 잎 스프레이 MS 및 상 상속 식별의 protonated 이온의 정확한 질량에서 이전 되었다에 의해 발견 된 화합물 (표 1)30특징. 잎 스프레이 MS는 고해상도, 정확한 질량 (HRAM) 질량 분석기, 약간 다른 대 중을 해결 하기 위해 가능 하 게 하에 수행에 유리 하다. 예를 들어, m/z 262.1794에서 확인 될 수 있었다 상 mesembrenone m dihydrojoubertiamine의 대신으로 (-dihydro-demethyl)는 m/z 262.1443에 되었을 것 이다.
잎 조직이 남아 관심 (표 1)의 몇 가지 이온의 탠덤 질량 (MS/MS) 조각화에 대 한 채워 있었다. 그림 4 잎 스프레이 MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/z, 그리고 292.1897 m/z에서 MS/MS 조각화 스펙트럼의 세 가지 예제를 보여 줍니다. 상 상속 신원은 대량 파편에 의해 확인 되었고 이전 확인 된 조각30에 확인. 276.1583 m/z 의 protonated 이온 mesembrine M의 2 개의 다른이 성체로 확인 되었다 (demethyl)와 mesembrenone-M 각 이성질체 (표 1)에 대 한 진단 파편의 존재의 또 다른 2 개의 성체.
Mesembrine와 mesembrine-M (dihydro-) 잎 스프레이 MS에 의해 발견 되었고 상 대량 조각 뿐만 아니라 정확한 질량을 식별. Mesembrine 290.1742 m/z 에 protonated 이온 스펙트럼;에서 가장 풍부한 이온 중 하나입니다. 따라서, 그것은 미래 연구를 위한 바이오 마커 후보 가능성이 있을 수 있습니다. S. tortuosum 의 두 가지 주요 알 카 로이드는 mesembrine mesembrenone, 둘 다 쉽게 잎 스프레이 MS에 의해 감지 되었다. 몇 잎 스프레이 MS Sceletium 및 파생된 제품의 식물 재료의 모니터링에 유용할 수 있습니다에서 검색 하는 화합물의.
그림 1: 설정의 잎 스프레이 MS 다이어그램. 잎 스프레이 MS 프로 파일링 방법을 그대로 식물 조직의 급속 한 샘플링에 대 한 허용 하는 대사 산물 이다. 다이어그램 kV의 높은 전압 클램프와 식물 조직에 용 매를 적용할 옵션 적용 잎 스프레이 MS를 보여 줍니다. 잎 스프레이 MS는 MS에 식물 조직에서 직접 분무 이온화를 촉진 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 잎 스프레이 MS의 워크플로 실험. 선택 된 식물 조직, Sceletium tortuosum 잎, 다음 집게를 고정 하 고, 데이터 수집 전에 이온 입구 앞에 배치 됩니다 전송 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대사 산물 잎 스프레이 MS 긍정적인 이온화에 의해 Sceletium tortuosum 프로 파일링. (A)이이 패널 표시 잎 스프레이 MS 총 이온 수 (TIC) 대량 chronogram. 각 피크에 대 한 최고 수 시간 (분) 이며 아래쪽은 m/z. (B)이이 패널 잎 스프레이 Sceletium tortuosum 긍정적인 질량 스펙트럼의 MS 대사 산물 프로필을 보여 줍니다. 삽입 된 260-295 m/z를 표시합니다. 정확한 대 중 4 소수 자릿수는 오류 < 6 ppm으로 밖으로 보고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 잎 스프레이 MS 긍정적인 이온화 탠덤 질량 스펙트럼 Sceletium tortuosum 에서 잘라 잎. 이러한 패널 표시 탠덤 질량 스펙트럼 (MS/MS) 알 카 로이드의 양 Putative 식별 정확한 질량 및 다음에 대 한 대량 조각에서 만들어진 잎 살포로 긍정적인 이온화 모드로 수집: (A) mesembrine-M 및 mesembrenone-M 이 성체, (B) mesembrine, 그리고 (C) mesembrine-M (dihydro-). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화합물 | 분자 공식 | 측정된 Monoisotopic 질량 m/z [M + H] | ppm 오류 | 조각 |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23없음2 | 262.1794 | 5.0 | N/A |
| Mesembrenone M (O-demethyl-) | C16H193 | 274.1431 | 4.5 | N/A |
| Mesembrine M (O-demethyl-) | C16H213 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine M (N-demethyl-) | C16H213 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone M (O--dihydro-demethyl) | C16H213 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone M (N--dihydro-demethyl) | C16H213 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H213 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H233 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (dihydro-) | C17H253 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
표 1:의 Putative 식별 Sceletium tortuosum mesembrine 알 카 로이드 잎 스프레이 양 여 이 테이블은 긍정적인 이온화 정확한 질량 및 Sceletium tortuosum mesembrine alkaloids의 조각 이온에 보고합니다.
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Discussion
이 프로토콜의 성공적인 사용은 식물 종, 조직 유형, 및 관심의 대상 compound(s)에 대 한 다양 한 단계의 최적화에 의존합니다. 프로토콜에서 설명 하는 매개 변수는 좋은 시작 지점을 제공 합니다. 필요가 다음과 같은 실험 결정을 만든 테스트: 여부 사용 (1) 절단 또는 포경된 조직 (2) 용 매 없는 용 매, 사용 하는 (3) 용 매 그리고 어떤 볼륨, (4) 이온 입구에서 조직의 거리 있어야 합니다 (5) 전압 진폭. 최적화의 목표는 적어도 30에 대 한 지속 되는 연속 신호를 생성 하는 조건을 찾을 수 몇 분 s. 조건 정확한 질량 및 MS/MS 측정을 수행 하는 데 필요한 적절 하 고 재현할 수 신호 강도 제공 해야 합니다. 높은 신호 강도 조직에서 이온의 성공적이 고 신뢰할 수 있는 스프레이 통해 이루어집니다. 스프레이 질 이온 입구, 조직 및 이온 입구의 팁과 전기 전압 적용 거리를 가리키는 조직 팁의 선명도에 따라 달라 집니다. 성공적인 스프레이 매우 조직 팁의 포인트의 선명도에 따라 이며, 어떤 경우에 조직 뾰족한 팁 형태로 절단 한다. 특히, 컷 조직의 끝에 테이퍼 모양 각도의 선명도에서 약간의 변경 이온화의 결과 품질에 대 한 중요 한 효력이 있고 따라서 신호 강도7생산. 경우 조직 이미 지적 했다, 다음 절단이 필요한 경우 잔디 블레이드 또는 바소 모양의 잎5,13.
이온 신호를 억제 수 있습니다 하 고 플라즈마 방전 되 고 결과로 조직에서 발생 하는 때 불안정 한 이온 입구 나 너무 높은 전기 전압에 너무 가까이 배치. 조직과 전기 전압의 선택의 적절 한 위치 샘플 사이의 안정적이 고 일관 된 스프레이 보장 하기 위해 필요 합니다. MS 이온 입구에서 조직의 거리 또한 신호 생산의 양과 품질에 미치는 영향. 일반적으로, 작은 조직 샘플 두어야 한다, 입구에 가까이 있지만 팁은 매우 지적 또는 화합물은 매우 집중 하는 경우 소규모 조직 하지 낮은 신호 강도 발생할 수 있습니다. 강도 및 스펙트럼의 z 축 따라 여러 개의 배치 위치를 비교 하 여 경험적으로 최적화 되어야 합니다. 그것은 식물 조직 x-및 y 축의 MS 이온 유입에 맞춰집니다 적당 한 이온화 중요 합니다. 그러나, 식물 조직 부당하 게 이온 입구 가까이 있는 경우이 이온 광학 및 MS 시스템의 프런트 엔드의 더 빈번한 청소를 요구할 수 있습니다.
용 매는 조직 위에 적용의 볼륨 0-물 내용 및 조직 샘플의 크기에 따라 50µL에서에서 배열할 수 있다. 경우에는 조직 함량이 매우 높은, 즙이 많은 Sceletium의 경우 잘라 아니 용 매를 추가할 수 있습니다. 그러나, 하나 이상의 응용 프로그램에 대 한 적어도 5-10 µ L의 용 매를 사용 하 여 더 일반적입니다. 용 매에의 추가를 사용 하 여 말린된 조직 또는 신선한 조직의 낮은 함량으로 스프레이 용이 하 게 필요 하다. 식물 재료의 큰 부분에 적은 양의 용 매를 사용 하는 경우 충분 한 스프레이 생산 하지 않고 흡수 될 가능성이 것 이다. 반대로, 너무 높은 볼륨을 사용 하는 화합물을 희석 수 있습니다 또는 적절 한 desolvation 쉽게 그리고 효율적으로 이루어지지 않습니다. 대체 옵션 수동으로 용 매를 pipetting을 지속적으로 화합물으로 시간의 기능으로 관찰 된 신호 부패 한다 식물 소재10에서 고갈 되는 주사기 펌프를 통해 조직에 용 매에 적용 됩니다. 다양 한 종류의 용 매를 시도 한다, 그리고 결과 스펙트럼 비교 수량 어떤 개선과 관심의 compound(s)에 대 한 ion(s)의 일관성을 확인 하. 솔벤트의 추가 뿐만 아니라 스프레이 생산 하지만 다른 화합물의 추출에 대 한 한 선택도 제공할 수 있습니다. 다른 극성 (메탄올, dichloromethane, hexanes, 이기, 클로 프롬, 및 아세톤)와 유기 용 매는 비교를 크게 다른 이온 땅콩 씨앗8에서 스펙트럼에 존재. 일반적으로, 메탄올은 좋은 첫번째 용 매 선택으로 많은 식물 조직 및 phytochemicals, 아미노산, 알 카 로이드, flavonols, 탄수화물, 유기 산, 지방산, 그리고 인지질8을 포함 하 여 다양 한 작업을 보여줘 왔다. 100% 물 포경된 식물 조직에의 응용 프로그램 일반적으로 잘 작동 하지 않습니다 하지만 소금10의 추가 함께 향상 될 수 있습니다. 다른 풍부한 adducts protonated 이온 화합물의 외 대부분의 경우에는 나트륨과 칼륨 같은 검색 adducts. 이러한 소금의 존재 adducts 때 더욱 널리 소금 용 매에 추가 되 고 유리할 수 있다. 예를 들어 한 감도 증가 및 Populus 종에서 페 놀 배당 체의 선택 적용 용 매10나트륨과 칼륨 이온의 추가 함께 관찰 되었다.
MS 기술 리프 스프레이의 두 가지 주요 제한이 있습니다 (1) 낮은 동적 범위와 과제 (2) 정량. 일반적으로, 가장 풍부한 화합물 이온화 되며 기술에 의해 감지. 극적으로 컬럼에 분리의 부재에서 발생 하는 이온 억제로 인해 이온화 효율 감소는 풍부한 대사와 함께 문제가 있습니다. 이 제한을 우회 하 스캔 범위는 m/z 의 범위에 초점을 조정할 수 있습니다. 그러나, 낮은 풍부한 화합물 여전히 수 있습니다 감지 되지 않을 분리 및 농도 크로마토그래피에 의해 제공 하지 않고. 추출 물에서 화합물의 일반적인 정량와 달리 내부 기준 수 없습니다 수 제대로 혼합 잎 스프레이 이전 공장 설비 재료에 양 Semi-quantitative 측정 및 상대 농도 알려진 배치 하 여 얻은 조직 표면 및 다음 수 있도록 잎 스프레이 MS 분석8,,931전에 건조에 표준 솔루션의 농도. 예를 들어 정량 표준 추가 방법은 상대 수량32결정의 이온을 내부 표준에 대 한 대표적인 이온의 비율을 계산 하기 위해 사용 되었다. 보정 곡선 상대 농도 견적 하기 위하여 사용 되었다. 이 메서드를 사용 하 여 내부 표준, 감자 D에 다양 한 배당 체의 비율을 비교 하 고 있으 나 특정 배당 체의 상대 농도 잎33통해 Ste내 다음 계산 될 수 있습니다. 또는, 더 정확한 정량 상업적인 가용성은 도전 수 있지만 관심, 화합물의 isotopically 분류 표준 가능 하다. Metabolically 레이블이 식물 조직의 사용에는이 방법34와 정량 향상 시킬 수 있습니다.
기존의 LC-MS/MS 광범위 한 샘플 준비 및 컬럼에 분리를 필요로, 분석을 위한 다른 방법은 원하는 종종 있습니다. 잎 살포 MS는 쉽게 적용 될 수 있습니다 및 단순, 정밀, 정확도 빠른 대사 산물 검출 및 반 정량 제공 하는 직접적인 화학 분석 기술. 이러한 이유로, 우리 리프 스프레이 S. tortuosum, chemotaxonomic 도구 생화학에 따라 Sceletium 속의 종 분화를 위한 기초를 제공할 수 있습니다의 화학 내용을 모니터링 하는 MS의 적합성 조사 서명입니다. 이 식물의 여러 가지 해 부 속성 잎 스프레이 MS에 대 한 이상적인 테스트 견본 할. 그것은 물, 유리 스프레이 용 매와의 응용 프로그램 없이 생성 될 수의 높은 금액을 포함 하는 succulent. Sceletium 잎 idioblasts (방광 같은 셀)15 특별된 대사 산물 축적 수 있습니다 스토리지 보유 역할을 포함 합니다. 잎 스프레이 MS 빠른 방식으로 식물 조직 하 비보에 분석 기술입니다. 일반적인 기술은 많은 식물 종, 조직 유형, 그리고 화합물의 클래스에 적용 됩니다. 식물 화합물에 대 한 정보를 캡처하는 기술을 인간의 사용 하는 건강, 영양, 농업 및 에너지35공장 기본 및 특수 물질 대사를 이해 하는 큰 관심입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF 식물 게놈 연구 프로그램 그랜트 IOS-1238812와 박사 친목 생물학 IOS-1400818에 의해 투자 되었다. 작품 또한 캐서린 A. Sammons에 몬산토 대학원 학생 친교에 의해 투자 되었다. 풀브라이트 아프리카 연구원 학자 프로그램 (2017-2018) Nokwanda P. Makunga에 게 수 여 하는 자금에 대 한 감사입니다. 우리는 크게 제시카 Prenni에서 nanospray 소스의 기부와 콜로라도 주립 대학에서 Proteomics, Metabolomics 시설 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
References
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
- Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
- Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
- Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
- National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
- ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
- GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
