Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

نبات رذاذ الكتلي هو أسلوب تحليل الكيميائي مباشر أن يقلل إعداد العينة ويلغي الفصل اللوني، مما يسمح للكشف السريع عن جزيئات صغيرة من الأنسجة النباتية.

Abstract

محطات إنتاج آلاف جزيئات الصغيرة التي تتنوع في خصائصها الكيميائية. الطيف الكتلي (MS) تقنية قوية لتحليل نواتج الأيض النباتية لأنها توفر الأوزان الجزيئية مع حساسية عالية وخصوصية. رش أوراق MS أسلوب تاين المحيطة حيث يتم استخدام الأنسجة النباتية للتحليل الكيميائي المباشر عبر اليكتروسبراي، القضاء على الفصل اللوني من العملية. يسمح هذا النهج لأخذ العينات من الأيض بمجموعة واسعة من فئات كيميائية الكشف عنها في وقت واحد من الأنسجة النباتية سليمة، التقليل من مقدار إعداد العينات اللازمة. عند استخدامها مع MS أسلحة ذات دقة عالية ودقيقة، رش أوراق MS يسهل الكشف السريع عن نواتج الأيض للفائدة. من الممكن أيضا جمع بيانات تجزئة tandem الشامل مع هذا الأسلوب لتسهيل تعريف مركب. الجمع بين قياسات أسلحة دقيقة وتجزئة مفيد في تأكيد الهويات المركبة. رش أوراق تقنية MS يتطلب تعديلات طفيفة فقط إلى مصدر تاين نانوسبراي، وهو أداة مفيدة لزيادة توسيع قدرات مطياف كتلة. هنا، يتم تحليل الأنسجة أوراق جديدة من تورتوسوم سسيليتيوم (بركانية)، النباتات طبية تقليدية من جنوب أفريقيا؛ تم الكشف عن عدة ميسيمبريني قلوانيات مع رش أوراق MS.

Introduction

نباتات تحتوي على مجموعة واسعة من الجزيئات الصغيرة ذات خصائص كيميائية متنوعة. مرض التصلب العصبي المتعدد تقنية قوية لتحليل المركبات النباتية لأنها توفر عنصري التراكيب مع حساسية عالية وخصوصية لكشف وتحديد نواتج الأيض1. الأكثر شيوعاً، هو إجراء مرض التصلب العصبي المتعدد على عينات استخراج المذيبات، والتي تكون مفصولة بواسطة اللوني قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد1. ومع ذلك، استخدام اللوني السائل (ش) يتطلب تحليل مطول مرات وغالباً ما يقترن إعداد عينة واسعة النطاق1. وفي المقابل، التحليل الكيميائي المباشر لانسجة سليمة أن تلتف اللوني تقنية سريعة جداً، التي تتطلب إعداد نموذج الحد الأدنى2. وهكذا، يمكن تحليل كيميائي مباشرة في الحالات حيث يمكن أن تكون الخطوات الكروماتوغرافي الضائعة، مفيد جداً.

LC-MS نموذجية لبحوث المنتجات وجميع الطبيعية يعتمد على عمليات الاستخراج المطولة الجزء الأكبر من المواد النباتية المجففة أو المجمدة التي تحتوي على العديد من الأنسجة والخلايا أنواع3. بدلاً من ذلك، يمكن عزل الخلية أنواع التحليل الكيميائي المباشر، مثل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد من نواتج الأيض من الأنسجة النباتية، وتجنب إعداد التحف4. رش أوراق MS، كما يشار إلى الأنسجة-رذاذ5،6، هو أسلوب تاين المحيطة مباشرة مرض التصلب العصبي المتعدد، التي تتطلب أساسا لا نموذج إعداد5،7. رش أوراق MS يرتبط ارتباطاً وثيقا بورقة رذاذ مرض التصلب العصبي المتعدد، أسلوب تاين المحيطة مع الخصائص للتأين اليكتروسبراي التي تسمح للكشف عن التحاليل التي تودع على ورقة7. وعلى الرغم من الاسم، ورذاذ أوراق MS تنطبق على أنواع مختلفة من الأنسجة النباتية، ليس فقط يترك، وقد برهنت على الفواكه والبذور والجذور، وأنسجة نباتية والدرنات، بين أمور أخرى،6،،من89 10،،من1112. وتسهل التقنية التأين من المواد الكيميائية النباتية المحلية مباشرة من المواد النباتية في مطياف الشامل للكشف عن8. يمكن رش أوراق MS أيضا معلومات عن التوزيع المكاني للمواد الكيميائية في أنواع مختلفة من الأنسجة في النباتات13. عند رش أوراق MS مقارنة بالاستخلاص بالمذيبات و LC-مرض التصلب العصبي المتعدد، تشير النتائج إلى رش أوراق MS يسمح للكشف السريع عن نواتج الأيض السطحية من أنواع خلايا فريدة مثل تريتشوميس13. ويبين الشكل 1 ليف رذاذ MS الإعداد التجريبية. يحدث التأين اليكتروسبراي مباشرة بعد التعديلات الطفيفة المصدر فقط. يتم تطبيق جهد العالي للأنسجة النباتية عن طريق المشبك معدني، وإنتاج رذاذ من قطرات مشحونة تشكيل مخروط تايلور الذي يحمل الأيونات إلى مدخل أيون من اليكتروسبراي السيدة يحدث التأين من السائل الطبيعي من المصنع أو من appl المذيبات العبوات الناسفة على سطح النبات. تلميح أشار في الأنسجة ويسهل اليكتروسبراي ويمكن بطبيعة الحال التي تحدث أو التي تم إنشاؤها عن طريق خفض.

رش أوراق MS هو طريقة سريعة للتحليل النوعي والكمي شبه من الأنسجة النباتية سليمة التي وجدت فائدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على سبيل المثال، استخدمت التقنية للكشف عن المركبات الذاتية التمييز بين الأنواع ذات الصلة، وحتى لتقييم التغييرات في نفس الأنواع التي نمت تحت ظروف مختلفة. وقد أظهرت الدراسات السابقة هذا النهج عن طريق قياس نواتج الأيض في بيوتيبيري (Callicarpa L.) 12 وأمريكا الجنسنغ (Panax quinquefolium ل.) 6-في المثال الأخير، يمكن اكتشاف جينسينوسيديس والأحماض الأمينية أوليجوساكتشاريديس بعد ترطيب الأنسجة الجنسنغ الخام. كانت متباينة الجنسنغ الأمريكية البرية والمزروعة من درنة شرائح6. وكان الحفاظ على سلامة درنة الجنسنغ رذاذ ليف خلفا مرض التصلب العصبي المتعدد، الذي يسمح ل تفتيش المورفولوجية والمجهرية لاحقة6. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا اكتشاف المركبات الخارجية على عينات النبات. تم اكتشاف عدد من مبيدات الآفات (اسيتامبريد، ديفينيلاميني، إيمازاليل، لينورون، وثيابندازول) قشر أو لب الفواكه والخضروات9. عدم ذكر سابقا بينما أظهرت هذه الدراسات وغيرها الكثير فائدة رش أوراق MS لأغراض محددة مختلفة، بروتوكول مفصل.

هنا، وصف البروتوكول لن يركز على الاستفادة المثلى الأسلوب لنسيج معين أو مركب. بدلاً من ذلك، يستخدم في الكشف عن قلويدات ميسيمبريني من N.E.Br تورتوسوم سسيليتيوم (لام)-(بركانية) كمثال لمناقشة تدابير التحسين اللازمة التي ينبغي اتخاذها عند إعداد تجربة أوراق MS رذاذ لأنواع، الأنسجة، أو compound(s) للمرة الأولى. تورتوسوم س. المتوطنة النضرة إلى منطقة كارو شبه القاحلة في جنوب أفريقيا. طب التقليدي سان والشعوب الخوي خوي، وأنه كان يستخدم لقمع الشهية والعطش، وكذلك المؤثرات العقلية ومسكن14،15. حاليا، ومقتطفات موحدة تستخدم لعلاج الاضطرابات النفسية العصبية والعصبية16،17. وتشمل المركبات الأولية لمصلحة ميسيمبريني قلويد ومشتقاته، وكثير منها موجودة أيضا في الأنواع ذات الصلة في سسيليتيوم 15. لدى سكان المناطق البرية والمزروعة من س. تورتوسوم تركيزات متغيرة من قلويدات ميسيمبريني، مما يخلق تحديا مراقبة الجودة18. طريقة للكشف السريع عن قلويدات ميسيمبريني، مثل نبات رذاذ مرض التصلب العصبي المتعدد، قد تكون مفيدة في رصد المنتجات سسيليتيوم . لأن سابقا، كان هناك أي بروتوكول تجريبي البصرية التفصيلية لرش أوراق تقنية MS، نحن سيتم توضيح طريقة استخدام مثال س. تورتوسوم، وهو وصف ما يلي: تعديل مصدر نانوسبراي، اختيار وإعداد الأنسجة النباتية، والحصول على البيانات، وتفسير النتائج، والتحسين من المعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إدخال تعديلات على مصدر نانوسبراي لنبات رذاذ MS

  1. استخدام مصدر نانوسبراي معدلة لرش أوراق MS. كما لا توجد مكونات فلويديك اللازمة للرش أوراق MS، تعديل المصدر عن طريق إزالة المسبار LC من المصدر.
  2. تجميع الأسلاك MS رذاذ ليف التي سيتم تطبيق الجهد على الأنسجة النباتية مع دبوس المناسبة لتوصيل المصدر. لحام pin لواحدة من نهاية الأسلاك المعزولة؛ لحام المشبك للطرف الآخر من السلك.
    ملاحظة: المشبك (نوع القصاصة التمساح) قد أو قد لا يكون لديك الأسنان. للنسيج الصغيرة، يفضل المشبك دون أسنان. يمكن إضافة ذراع فليكس اختياري مع المشبك بمصدر نانوسبراي للمساعدة في تحديد المواقع الأنسجة النباتية. علما بأن هذا البروتوكول تحديداً توضح كيفية إجراء الرش أوراق MS على هجين الرباعي أيون فخ شامل محلل نظام MS (انظر الجدول للمواد)؛ ومع ذلك، قد يكون تغيير أنظمة مايكروسوفت الأخرى لتنفيذ هذا الأسلوب6. اقتران رش أوراق MS مع تحليل كيميائي مطياف كتلة محمولة في الوقت الحقيقي يمكن أن يؤديها في الموقع دون الحاجة إلى نقل المواد النباتية إلى مختبر19،20.
  3. ضع حصيرة الكلمة مكافحة ساكنة على الكلمة أدناه المصدر للحد من تصريف الكهربائية التي قد تحدث من المصدر عند استخدام الفولتية العالية.

2-إعداد نظام MS MS رذاذ ليف

  1. إذا كان النظام في الآونة الأخيرة في استخدام، تسمح لها ببارد للمس وإزالة أي مصدر بديل والمخروط الاجتياح. إرفاق مصدر MS رذاذ ليف نانوسبراي.
  2. قم بإنشاء ملف انسجاما مع المعلمات المناسبة التأين تعيين كما يلي: غمد، ومساعدة، واكتساح الغاز إلى 0؛ الجهد الرذاذ إلى 2-5 كيلو فولت؛ درجة الحرارة الشعرية إلى 150-250 درجة مئوية؛ ومستوى RF عدسة S إلى 50. حفظ الملف انسجاما مع المعلمات المطلوبة8،13. تحسين الجهد ودرجة الحرارة للتأين أفضل من الأنسجة و compound(s) للفائدة.
    ملاحظة: نقطة انطلاق جيدة هي 4 كيلو فولت و 200 درجة مئوية.
  3. جعل ملف أسلوب بما في ذلك الملف لحن رذاذ MS ليف مع: MS كامل الإيجابية والسلبية؛ قرار قوامه 70 ألفا؛ هدفا AGC 1 × 106؛ كحد أقصى من 200 مرض التصلب العصبي المتعدد؛ و نطاق الفحص المطلوب m/z. بدلاً من ذلك، استخدام الأقطاب 1 فقط.

3-إعداد الصك، والمذيبات، والأنسجة النباتية

ملاحظة: دائماً ارتداء القفازات، وعدم استخدام الأنسجة النباتية التي تم التعامل معها بأيديهم العارية. وبخلاف ذلك، سوف تهيمن على أيونات الملوث مثل البولي إثيلين غليكول الأطياف.

  1. تجلب الأنسجة النباتية للتحليل لنفس الغرفة نظام MS للسماح بسرعة لأخذ عينات.
  2. للأنسجة النباتية التي ليس لديها معلومات سرية بطبيعة الحال أشار، استخدم شفرة حلاقة على شريحة زجاج لقص نقطة مدبب (الشكل 2). تحديد كمية الأنسجة اللازمة للتحليل القائم على حساسية الصك ونوع النسيج، و compound(s) للفائدة (مثلاً، شباب تورتوسوم س. نبات هو ~ 5 مم في الطول).
    1. قطع تورتوسوم س. يترك فترة عشرة أسابيع بعد الإنبات إلى شرائح رقيقة، كل منها مع نهاية مدبب لتشكيل نقطة.
  3. استخدام الملقط لتحديد الأنسجة النباتية في النهاية التي سوف تكون فرضت بلطف. القابضة الأنسجة مع الملقط، نقلها بعناية إلى المشبك.
    تنبيه: لا تلمس مصدر الصك إذا كان الجهد على.
  4. ضبط ذراع مرنة والسلك مع المشبك لوضع الأنسجة تمشيا مع مدخل MS حيث المسافة بين الأنسجة النباتية ومدخل أيون من MS 5-10 ملم للرباعي الثلاثي (مثلاً، تسق) واعتراض خطي الرباعي (لتق) و 10 --50 مم ل محلل الشامل (مثلاً، أوربيتراب) فخ أيون8.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من السلك المصدر. إذا كانت المحاولات الأولى التي تنتج كثافة إشارة منخفضة، نقل الأنسجة النباتية أقرب إلى مدخل أيون (الرجوع إلى مناقشة للتحسين).
  5. تحميل ملف طريقة؛ اسم ملف البيانات وقم بتعيين موقع تخزين الملف. تشغيل نظام MS بالنقر فوق تشغيل ثم انقر فوق ابدأ لبدء الحصول على البيانات.
  6. تطبيق مادة مذيبة (مثلاً، والميثانول) استخدام بيبيت مع تلميح تحميل لجل لتحقيق أقصى قدر من المسافة بين الأيدي والجهد العالي لحماية المستخدم.
    ملاحظة: حجم المذيب المطلوبة يعتمد على حجم، وجفاف، ونسيج من الأنسجة، عادة ما يترك ~ 2-20 ميليلتر. تورتوسوم س. لا تتطلب أي مذيب المراد إضافتها. تطبيق المذيبات بعناية ولا تلمس مصدر الصك عند الجهد. استخدام المذيبات الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد والأواني الزجاجية التي تم غسلها حمض وهو خال من المنظفات. في بعض الأنسجة، يمكن ملاحظة إشارة دون إضافة مادة مذيبة بسبب محتوى المياه الطبيعية للأنسجة النباتية. ومع ذلك، يتحقق عادة كثافة إشارة أكبر وانخفاض S/N بتطبيق مادة مذيبة للأنسجة.
  7. الحصول على بيانات طالما استمرت الإشارة أو حتى تم جمع الأطياف كافية، عادة من 30-60 ثانية. إذا لزم الأمر، تطبيق المذيبات إضافية الاحتفاظ كثافة عالية إشارة لفترة أطول من الزمن. إيقاف الحصول على البيانات وتوقف نظام MS.
  8. إزالة الأنسجة وتغسل المشبك مع 100 ٪ الميثانول ومسح خالية من الوبر. تنظيف مدخل أيون مللي ثانية بعد حوالي 1-2 ساعة للحصول على برش أوراق MS طبقاً للمواصفات الخاصة بالمورد. أيضا، قم بتنظيف مدخل أيون مرض التصلب العصبي المتعدد بين تحليلات لأنواع مختلفة من الأنسجة.

4-بيانات نوعية التقييم

  1. فتح ملف البيانات وبصريا تفقد تاريخ الشامل قاعدة الذروة. تحقق من أن كثافة إشارة ~1.0 x 107 إلى 5.0 × 108. إذا كانت الإشارة أقل، نقل الأنسجة أقرب إلى مدخل أيون. إذا كان أعلى، سوف تصبح الأمامية لنظام MS القذرة، حتى نقل الأنسجة أبعد عن مدخل أيون.
  2. استناداً إلى وجود أو عدم وجود أيونات مصلحة في الأطياف الشامل المنتجة، تغيير المعلمات.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

5. تجزئة الشامل جنبا إلى جنب

  1. أن تقرر ما أيونات من الفائدة لتجزئة الشامل جنبا إلى جنب (MS/MS)؛ إشارة أطياف شامل > 1.0 × 105 يعتبر كافياً لاختيار أيونات MS/MS.
  2. جعل ملف أسلوب جديد مع قائمة إدراج من m/z خارجاً إلى 4 أماكن عشرية. انقر فوق القوائم العمومية والشمول. ضمن خصائص PRM، حدد الطاقة تجزئة [مثلاً، الطاقة الاصطدام تطبيع (NCE) من 30-50 مجموعة جيدة لتبدأ] وغيرها من المعالم MS/MS.
    1. للحصول على بيانات MS/MS للقلويات ميسيمبريني، تجزئة الأيونات التالية، 276.1583 m/z, 290.1742 m/z، و 292.1897 m/z، في 35 الامتحانات التنافسية الوطنية.
      ملاحظة: يمكن أن يؤديها اقتناء البيانات MS/MS فورا بعد مرض التصلب العصبي المتعدد، أو في وقت لاحق. النسيج نفسه يمكن غالباً ما تظل فرضت بعد كامل من مرض التصلب العصبي المتعدد، ويمكن إعادة استخدامها للحصول على بيانات MS/MS. ومع ذلك، إذا لم توفر إشارة كافية ريسبرايينج، استخدام أنسجة جديدة.
  3. تحميل ملف طريقة MS/MS وملف بيانات مسماة. قم بتشغيل نظام MS، والبدء في الحصول على بيانات، وإضافة مادة مذيبة إذا لزم الأمر. عندما تم جمع أطياف كافية، عادة بعد 30-60 ثانية، التوقف عن اقتناء.
  4. جمع التجزئة في كثير من الطاقات المختلفة عند تعيين أيونات يفتت.
    ملاحظة: حيث أن رش أوراق MS يفتقر إلى فصل الكروماتوغرافي، الأطياف التجزؤ من المحتمل أن تحتوي على أيونات كثيرة، ويتشرذم في الطاقات المختلفة سوف تساعد في تحقيق الوضوح.

6-المفترضة الجثث بالتفكك الشامل وسائل دقيقة وجنبا إلى جنب

  1. جعل التعريفات المفترضة بالرجوع إلى قياسات دقيقة أسلحة من قواعد البيانات المتاحة للعموم المستقلب مثل ميتلين21، قاعدة بيانات ميتابولومي البشرية22، مصرف الشامل23، "خرائط الدهن"24، المعهد الوطني المعايير والتكنولوجيا ماجستير البحث25، احترام المواد الكيميائية النباتية26أو27من قومي.
  2. كما أن قواعد البيانات هذه ليست حصرية، إجراء استعراض أدب إضافية على الأنواع النباتية تتميز كيميائيا حسب الضرورة.
  3. رذاذ تطابق تجزئة الأيونات من أوراق MS/MS لقواعد البيانات المذكورة أعلاه عندما تتوفر معلومات MS/MS أو الأدب. وبدلاً من ذلك، استخدم تفسيراً يدوي من أيونات يفتت MS/MS أو تجزئة معيار أصيلة يؤديها بالحقن المباشر أو LC-MS/MS.

7-بيانات التحليل

  1. تحويل ملفات raw مرض التصلب العصبي المتعدد للملفات مزكسمل باستخدام أداة مسكونفيرت من بروتيوويزارد28.
  2. استخدام حزمة البرامج XCMS نفذت في البحث والتطوير للانتقاء الذروة. استخدام جرعة مباشرة معالجة الأسلوب لرش أوراق تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على النصوص مشروحة جيدا المستخدمة لمعالجة البيانات في https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. للحصول على قياسات شبه كمي، تستأثر بتباين التجريبية، تطبيع كثافة كل المستقلب بايون المجموع الحالي (عرة)، كالرذاذ ورقة يمكن أن تختلف كثافة إشارة مرض التصلب العصبي المتعدد، جزئيا بسبب اختلافات طفيفة في موضع الورقة في المصدر والاختلافات في حجم وشكل أوراق.
  4. بدلاً من ذلك، استخدام البرمجيات المقدمة من البائعين لتحليل البيانات أو MZmine2 (للاطلاع على http://mzmine.github.io/)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في 10 أسابيع بعد الإنبات، وجمعها طازجة نابعة من الاحتباس الحراري تورتوسوم س يترك حللت برش أوراق MS. سير العمل التجريبي للكشف عن نواتج الأيض من س. تورتوسوم يترك استخدام الرش أوراق MS هو موضح في الرسم 2. تحديد ورقة، يقتطع شريحة رقيقة مع نهاية مدبب شكل نقطة، وفرضت مع رش أوراق MS أسلاك الجهاز المشبك. كان وضع الأنسجة النباتية ~ 30 ملم من مدخل أيون وتمشيا مع x--وياكسيس. عند البدء في رش أوراق يترك السيدة س. تورتوسوم ، تم الكشف عن أيونات دون أي تطبيق المذيبات. نباتات عائلة سسيليتيوم هي العصارة مع أوراق سميكة ذات محتوى مياه العالية التي تمكن التأين اليكتروسبراي برش أوراق MS دون تطبيق خارجي للمذيبات. ومع ذلك، معظم عادة, الأنسجة النباتية تتطلب تطبيق المذيبات للكشف عن أيونات.

أنتجت تاريخ جماعي والشامل الأطياف المكتظة بالأيونات بعد 30 ثانية لاقتناء في وضع إيجابي التأين (الشكل 3). تاريخ يمثل رذاذ أوراق نجاح تجربة مرض التصلب العصبي المتعدد حيث أبقى إشارة مستقرة لكامل مدة اقتناء. في هذه الدراسة، ما مجموعة تسعة ميسيمبريني قلوانيات تم الكشف عن طريق رش أوراق MS والجثث المفترضة كانت مصنوعة من كتلة الأيونات البروتونية للضبط سابقا تتميز مركبات (الجدول 1)30. مفيد لأداء رش أوراق MS ذات الدقة العالية، ودقة الجماهيري (حرام) شامل مطياف، مما يجعل من الممكن لحل جماهير مختلفة قليلاً. على سبيل المثال، يمكن تحديد m/z في 262.1794 مزعومة ديهيدروجوبيرتياميني بدلاً من ميسيمبرينوني-M (ديميثيل-ديهيدرو-)، الذي كان في m/z 262.1443.

وظلت أنسجة نبات فرضت لتجزئة (MS/MS) شامل جنبا إلى جنب من أيونات قليلة للفائدة (الجدول 1). ويبين الشكل 4 ثلاثة أمثلة من الأطياف تجزئة MS/MS من رش أوراق MS 276.1583 m/z, 290.1742 m/zو 292.1897 m/z. يتم التحقق من شظايا الشامل الهويات المفترضة وأكدت مع30من الشظايا التي سبق تحديدها. واعتبرت أيون البروتونية من 276.1583 m/z ايزومرات مختلفة اثنين من ميسيمبريني-M (ديميثيل) وآخر من ايزومرات اثنين من ميسيمبرينوني-م بسبب وجود شظايا التشخيصية لكل أيزومر (الجدول 1).

ميسيمبريني وميسيمبريني-M (-ديهيدرو) الكشف عن طريق رش أوراق MS ومزعومة وحدد وسائل الضبط وكذلك تجزئة جماعية. أيون البروتونية من ميسيمبريني في 290.1742 m/z واحد من الأيونات الأكثر وفرة في الطيف؛ لذلك، قد يكون مرشح المحتمل كالعلامات البيولوجية للدراسات المستقبلية. هي قلويدات الرئيسية اثنين من تورتوسوم س. ميسيمبريني وميسيمبرينوني، اللتين تم اكتشاف سهولة برش أوراق MS. العديد من المركبات الكشف عنها بواسطة رش أوراق MS قد تكون مفيدة في رصد المواد النباتية سسيليتيوم والمنتجات المشتقة.

Figure 1
رقم 1: أوراق رذاذ MS الرسم التخطيطي للإعداد. رش أوراق MS هو المستقلب التنميط الأسلوب الذي يسمح لأخذ العينات السريع للأنسجة النباتية سليمة. يظهر الرسم التخطيطي رذاذ أوراق MS مع كيلوفولط عالية الجهد المطبق المشبك والخيار لتطبيق مادة مذيبة للأنسجة النباتية. رش أوراق MS يسهل تاين اليكتروسبراي مباشرة من الأنسجة النباتية في مدخل MS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تجربة سير العمل لرش أوراق MS. الأنسجة النباتية المحددة، نبات تورتوسوم سسيليتيوم ، قص، ثم نقلها باستخدام الملقط فرضت، وثم وضع أمام مدخل أيون قبل الحصول على البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: المستقلب التنميط من تورتوسوم سسيليتيوم برش أوراق MS مع التأين إيجابية. (أ) هذا الفريق يظهر رذاذ أوراق MS أيون مجموع عدد (عرة) تاريخ الشامل. لكل ذروة، أعلى رقم هو الوقت (دقيقة) والأسفل m/z. (ب) هذا الفريق يظهر رش أوراق MS المستقلب الشخصية من طائفة تورتوسوم سسيليتيوم الجماعي الإيجابي. اقحم يعرض 260-295 m/z. ترد الجماهير دقيقة إلى 4 منازل عشرية مع خطأ < 6 جزء في المليون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: أوراق رذاذ MS التأين إيجابية جنبا إلى جنب الأطياف الشامل من تورتوسوم سسيليتيوم قص أوراق. إظهار هذه اللوحات جنبا إلى جنب الأطياف الشامل (MS/MS) التي تم جمعها في وضع إيجابي التأين مع رش أوراق هويات Putative السيدة من قلوانيات مصنوعة من كتلة دقيقة وتجزئة الشامل لما يلي: (أ) ميسيمبريني-وميسيمبرينوني-متر مربع الايزومرات وميسيمبريني (ب) (ج) ميسيمبريني-M (ديهيدرو-). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مجمع الصيغة الجزيئية قياس الكتلة مونويسوتوبيك m/z [M + H] خطأ في صفحة في الدقيقة الشظايا
ديهيدروجوبيرتياميني ج16ح23لا2 262.1794 5.0 N/A
ميسيمبرينوني-M (س-ديميثيل-) ج16ح19لا3 274.1431 4.5 N/A
ميسيمبريني-M (س-ديميثيل-) ج16ح21لا3 276.1583 5.9 121، 152، 195، 201، 218، 219، 258
ميسيمبريني-M (N-ديميثيل-) ج16ح21لا3 276.1583 5.9 109، 121، 138، 189، 201، 218، 247
ميسيمبرينوني-M (س-ديميثيل-ديهيدرو-) ج16ح21لا3 276.1583 5.9 124، 205، 218، 227، 245
ميسيمبرينوني-M (N-ديميثيل-ديهيدرو-) ج16ح21لا3 276.1583 5.9 120، 151، 210، 229، 241
ميسيمبرينوني ج17ح21لا3 288.1587 4.3 124، 151، 191، 199، 226، 230، 257، 270
ميسيمبريني ج17ح23لا3 290.1742 4.9 110، 121، 134، 152، 201، 215، 219، 232، 233، 241، 259، 260، 272
ميسيمبريني-M (ديهيدرو-) ج17ح25لا3 292.1897 5.2 151، 177، 201، 217، 243، 259، 274

الجدول 1: التعريفات المفترضة من تورتوسوم سسيليتيوم قلويدات ميسيمبريني برش أوراق السيدة هذا الجدول تقارير عن الجماهير التأين إيجابية دقيقة والايونات جزء للقلويات ميسيمبريني تورتوسوم سسيليتيوم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول يعتمد على الاستفادة المثلى الخطوات المختلفة للأنواع النباتية ونوع النسيج، والهدف compound(s) للفائدة. المعلمات الموصوفة في البروتوكول توفر نقطة انطلاق جيدة. المقررات التجريبية التالية تحتاج إلى بذل واختبارها: أم لا باستخدام (1) قص أو الأنسجة تقطيعه والمذيبات (2) أو لا مذيب، (3) ما هي المذيبات لاستخدام وما هو حجم، (4) ما مسافة الأنسجة من مدخل أيون ينبغي ، و (5) السعة الجهد. والهدف الأمثل هو إيجاد الظروف التي تنتج إشارة متواصلة التي استمرت لمدة على الأقل 30 ثانية إلى بضع دقائق. ينبغي توفير الظروف كثافة إشارة كافية واستنساخه، تلزم لتنفيذ وسائل الضبط وقياسات MS/MS. ويتحقق إشارة عالية الكثافة عبر رذاذ ناجحة وموثوقة من الأيونات من الأنسجة. نوعية الرش مرهون بحدة غيض الأنسجة مشيراً نحو مدخل أيون، المسافة بين غيض مدخل أيون والأنسجة، والجهد الكهربائي المطبق. رذاذ ناجحة تعتمد اعتماداً كبيرا على حدة وجهة نصيحة الأنسجة، وفي بعض الحالات، وينبغي قطع الأنسجة شكل تلميح أشار. على وجه الخصوص، تعديلات طفيفة في الحدة من زاوية الشكل مدبب في غيض من قطع الأنسجة تكون لها آثار كبيرة على نوعية الناتج من التأين وهكذا تنتج كثافة إشارة7. في الحالات حيث أشار الأنسجة الفعل، ثم لا قطع ضروري، كما الحال بالنسبة لشفرات العشب أو أوراق على شكل مجلة لانسيت5،13.

يمكن قمعها إشارة أيون ووضع غير مستقر عند حدوث تفريغ البلازما من الأنسجة نتيجة لكونها قريبة جداً إلى مدخل أيون أو الجهد الكهربائي مرتفعة للغاية. لتحديد المواقع المناسبة من الأنسجة ومجموعة مختارة من الجهد الكهربائي مطلوبة لضمان رذاذ مستقرة وثابتة بين العينات. مسافة الأنسجة من مدخل أيون MS يؤثر أيضا على نوعية وكمية من الإشارات التي تنتجها. وبصفة عامة، عينة أنسجة أصغر يجب وضع أقرب إلى المدخل، على الرغم من أن النسيج الصغيرة قد لا ينتج كثافة إشارة منخفضة إذا كانت الغاية يشير التلميح أو المركبات تكون مركزة بشكل كبير. ينبغي أن يكون الأمثل بكثافة والاتساق بين أطياف تجريبيا بمقارنة عدة مناصب التوظيف على طول محور ع. من الأهمية بمكان لتأين مناسبة اتساق الأنسجة النباتية مع مدخل أيون مرض التصلب العصبي المتعدد في العاشر--وياكسيس. ومع ذلك، إذا كان غير معقول الأنسجة النباتية قريبة من مدخل أيون، هذا تتطلب التنظيف أكثر تواترا من بصريات أيون والأمامية لنظام MS.

حجم المذيب المطبقة على رأس الأنسجة يمكن أن تتراوح من 0-50µL اعتماداً على محتوى الماء وحجم عينة الأنسجة. في الحالات حيث الأنسجة مرتفعة للغاية في محتوى الماء وهو قطع، كما في حالة النضرة سسيليتيوم، ويمكن إضافة لا مذيب. ومع ذلك، أنها أكثر نموذجية لاستخدامها على الأقل 5-10 ميليلتر من المذيبات لتطبيق واحد على الأقل. من الضروري إضافة مذيب عند استخدام أنسجة المجففة أو الأنسجة الطازجة ذات محتوى المائي المنخفض تيسيرا للرش. إذا تم استخدام كمية صغيرة من المذيب على قطعة كبيرة من المواد النباتية، فإنه سيتم استيعاب المحتمل دون إنتاج رذاذ كافية. على العكس من ذلك، إذا كان يتم استخدام وحدة تخزين عالية جداً، يمكن أن تضعف المركبات أو ديسولفيشن السليم لا بسهولة وكفاءة سيحدث. خيار بديل يدوياً بيبيتينج المذيبات باستمرار تطبيق المذيبات للأنسجة عن طريق مضخة الحقن حيث زف يضمحل الإشارات الملحوظة كدالة للزمن كالمجمع من المواد النباتية10. يجب أن يحاكم بأنواع مختلفة من المواد المذيبة، ومقارنة الأطياف الناتجة للتحقق من أي تحسن في كمية والاتساق من ion(s) compound(s) للفائدة. إضافة مذيب لا تنتج رذاذ بل يمكن أيضا أن توفر انتقائية لاستخراج مركبات مختلفة. وقد تم مقارنة المذيبات العضوية مع قطبية مختلفة (الميثانول والميثان، هيكسانيس، الاسيتو الانيتريل، كلوروفورم والاسيتون) وينتج أيونات مختلفة إلى حد كبير موجودة في الأطياف من بذور الفول السوداني8. وبصفة عامة، الميثانول خيار المذيبات أولى جيدة، كما أنه ثبت للعمل للعديد من الأنسجة النباتية ومجموعة واسعة من المواد الكيميائية النباتية، بما في ذلك الأحماض الأمينية والقلويات و flavonols، الكربوهيدرات، الأحماض العضوية، والأحماض الدهنية وفوسفوليبيدات8. تطبيق الماء 100% على الأنسجة النباتية تقطيعه عادة يعمل بشكل جيد ولكن يمكن تحسينها بإضافة أملاح10. في كثير من الحالات، بالإضافة إلى الأيونات البروتونية المركب، adducts أخرى وفيرة يتم الكشف عنها مثل الصوديوم والبوتاسيوم أدوكتس. أن وجود هذه الأملاح adducts هو حتى أكثر انتشارا عند الملح يتم إضافة المذيب ويمكن أن يكون مفيداً. على سبيل المثال، لوحظ زيادة الحساسية والانتقائية من جليكوسيدات الفينولية من الأنواع حور بالإضافة إلى أيونات الصوديوم والبوتاسيوم ل المذيبات التطبيقية10.

هي القيود الرئيسية اثنين من رش أوراق تقنية MS (1) منخفض النطاق الديناميكي والتحديات (2) مع كوانتيتيشن. بشكل عام، إلا أن المركبات الأكثر وفرة المتأين والكشف عنها بواسطة التقنية. نقصان في كفاءة التأين نتيجة قمع أيون تحدث في شكل كبير في غياب الفصل الكروماتوغرافي أقل من قضية مع وفرة من الأيض. للالتفاف حول هذا القيد، يمكن تعديل نطاق المسح إلى التركيز على نطاق m/z فقط للفائدة. بيد المركبات منخفضة-وفرة لا يزال قد لا يمكن الكشف عنها دون فصل وتركيز تقدمها اللوني. على عكس كوانتيتيشن نموذجي للمركبات من مستخرج، المعايير الداخلية لا يمكن أن يكون بشكل صحيح مختلطة إلى المواد النباتية قبل رش أوراق القياسات سيميكوانتيتاتيفي السيدة وتركيزات النسبية تم الحصول عليها عن طريق وضع المعروف تركيز حلاً القياسية على سطح النسيج، وثم السماح لها لتجف قبل رذاذ أوراق MS التحليل8،،من931. على سبيل المثال، استخدم الأسلوب القياسي بالإضافة كوانتيتاتيون لحساب نسبة أيون الممثل للمعيار الداخلي لايون الفائدة لتحديد الكميات النسبية32. استخدم منحنى معايرة لتقدير تركيز نسبي. باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن مقارنة نسبة جليكوسيدات مختلف إلى داخلية قياسية، ريباوديوسيدي د ومن ثم يمكن حساب تركيز نسبي من جليكوسيدات محددة في مجالي العلوم والتكنولوجياعبر أوراق33. بدلاً من ذلك، كوانتيتيشن أكثر دقة ممكن مع معيار نظير مسماة لمجمع الفائدة، على الرغم من توافر التجارية قد يكون تحديا. يمكن تحسين استخدام الأنسجة النباتية أيضي المسمى أيضا كوانتيتاتيون مع هذا الأسلوب34.

نظراً لأن التقليدية LC-MS/MS يتطلب إعداد عينة واسعة والفصل الكروماتوغرافي، غالباً ما المرغوب فيها أساليب أخرى للتحليل. رش أوراق MS هو أسلوب تحليل الكيميائي مباشر التي يمكن تطبيقها بسهولة، ويقدم البساطة والدقة، والدقة والكشف السريع المستقلب وشبه كوانتيتيشن. لهذا السبب، فإننا التحقيق في مدى ملاءمة رش أوراق MS لرصد مضمون س. تورتوسوم، التي يمكن أن تشكل أساسا لأدوات تشيموتاكسونوميك التفريق بين الأنواع من جنس سسيليتيوم استناداً إلى الكيمياء الحيوية الكيميائية تواقيع. تجعل من العديد من الخصائص التشريحية لهذا النبات عينة اختبار مثالي لرش أوراق MS. وهو النضرة، التي تحتوي على كميات كبيرة من المياه، ومفيدة كما يمكن أن تتولد الرش دون تطبيق المذيبات. يحتوي نبات سسيليتيوم إيديوبلاستس (مثل المثانة الخلايا)15 التي تعمل كاحتياطيات التخزين حيث قد تتراكم الايضات المتخصصة. رش أوراق MS أسلوب تحليل في فيفو تميز الأنسجة النباتية بطريقة سريعة. الأسلوب العام الذي ينطبق على العديد من الأنواع النباتية وأنواع الأنسجة، وفئات المركبات. تقنيات التقاط المعلومات حول مصنع مركبات ذات أهمية كبيرة لفهم الأيض النباتية الأساسية والمتخصصة للاستخدامات البشرية للصحة والتغذية، والزراعة، والطاقة35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه برنامج أبحاث الجينوم المصنع NSF دائرة الرقابة الداخلية--1238812 و "زمالات ما بعد الدكتوراه" في "علم الأحياء" دائرة الرقابة الداخلية--1400818. كما مولت الأعمال "زمالة الطلاب الخريجين مونسانتو" إلى كاثرين سامونز ألف. وشكر "أفريقيا الباحث علماء برنامج فولبرايت" (2017-2018) هو التمويل الممنوح ماكونجا ص نكوندا. ونحن نقدر تقديراً كبيرا التبرع بمصدر نانوسبراي من برني جيسيكا ومرفق البروتيوميات وجميع في جامعة ولاية كولورادو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 136، رش أوراق MS، الكتلي، التأين اليكتروسبراي، التأين المحيطة، تورتوسوم سسيليتيوم، ميسيمبريني قلويدات، المنتجات الطبيعية، النباتية والايضات، صغيرة الجزيئات
نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter