Summary
Espectrometria de massa de pulverizador de folha é uma técnica de análise química direta que minimiza a preparação da amostra e elimina a cromatografia, permitindo a detecção rápida de pequenas moléculas de tecidos vegetais.
Abstract
As plantas produzem milhares de pequenas moléculas que são diversas em suas propriedades químicas. Espectrometria de massa (MS) é uma técnica poderosa para a análise de metabólitos da planta porque ele fornece pesos moleculares com alta sensibilidade e especificidade. Spray de folha MS é uma técnica de ionização ambiente onde o tecido de planta é usado para análise química direta via electrospray, eliminando a cromatografia do processo. Esta abordagem de metabólitos de amostragem permite uma grande variedade de classes químicas para ser detectado simultaneamente de tecidos vegetais intactos, minimizando a quantidade de preparação de amostra necessária. Quando usado com uma MS em massa de alta resolução, precisas, spray de folha MS facilita a rápida detecção de metabólitos de interesse. Também é possível coletar dados de fragmentação de massa em tandem com esta técnica para facilitar a identificação de compostos. A combinação de medições precisas em massa e a fragmentação é benéfica em confirmando identidades compostas. O spray de folha técnica MS requer apenas pequenas modificações a uma fonte de ionização de nanospray e é uma ferramenta útil para expandir ainda mais os recursos de um espectrômetro de massa. Aqui, o tecido de folhas frescas de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), uma planta medicinal tradicional da África do Sul, é analisado; numerosos alcaloides de mesembrine são detectados com spray de folha MS.
Introduction
As plantas contêm uma grande variedade de pequenas moléculas com propriedades químicas diferentes. MS é uma técnica poderosa para analisar compostos de plantas, porque pode fornecer composições elementares com uma alta sensibilidade e especificidade para a detecção e identificação de metabólitos1. Mais comumente, MS é realizada em amostras extraídas por meio de solvente, que são separadas por cromatografia antes o MS análise1. No entanto, o uso de cromatografia líquida (LC) requer vezes análise longa e é frequentemente associado com uma amostra extensa preparação1. Em contraste, direto de análise química de tecidos intactos que contorna a cromatografia é uma técnica muito rápida, exigindo a amostra mínima preparação2. Assim, em casos onde as etapas cromatográficas podem ser cobradas, uma análise química direta pode ser altamente vantajosa.
LC-MS típico para pesquisa de produtos e metabolomics natural depende de extrações demoradas em massa de materiais secos ou congelados planta contendo vários tecidos e células tipos3. Alternativamente, análise química direta, tais como a detecção de MS de metabolitos do tecido de planta, pode isolar os tipos de células e evitar artefatos de preparação4. Spray de folha MS, também conhecida como tecido-pulverizador5,6, é uma técnica de ionização ambiente direto MS, que requer essencialmente, sem preparação amostra5,7. Pulverizador de folha que MS está intimamente relacionada com spray de papel MS, uma técnica de ionização ambiente com características de ionização electrospray que permite a detecção dos analitos que são depositadas em papel7. Apesar do nome, folha spray MS é aplicável para vários tipos de tecidos vegetais, não nos deixa e tem sido demonstrado em frutos, sementes, raízes, tecidos florais e tubérculos, entre outros,6,8,9, 10,11,12. A técnica facilita a ionização de fitoquímicos endógenas directamente a partir dos materiais de planta para o espectrômetro de massa para a deteção de8. Spray de folha MS também pode fornecer informações sobre a distribuição espacial dos produtos químicos em tipos diferentes de tecidos em plantas13. Quando o pulverizador folha MS é comparado com a extração de solvente e LC-MS, os resultados sugerem pulverizador folha que MS permite a rápida detecção de metabólitos de superfície de tipos de células únicas tais como tricomas13. A Figura 1 ilustra a montagem experimental de folha pulverizador MS. Ionização electrospray direta ocorre após apenas modificações de fonte menor. Uma alta tensão é aplicada no tecido vegetal através de uma pinça de metal, produzindo um spray de gotas altamente carregadas, formando um cone de Taylor que transporta os íons para a entrada de iões de Electrospray a Sra. ionização ocorre a partir do líquido natural da planta ou o solvente appl IED para a superfície da planta. Uma ponta pontiaguda no tecido facilita a electrospray e pode ser naturalmente natural ou criado por um corte.
Spray de folha MS é um método rápido de análise qualitativa e semi-quantitativa de tecidos de planta intacta que achei utilidade para uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, a técnica tem sido usada para detectar compostos endógenos para distinguir espécies relacionadas e até mesmo para avaliar alterações na mesma espécie cultivada em diferentes condições. Estudos anteriores mostraram esta abordagem medindo metabolitos em beautyberry (Callicarpa L.) 12 e ginseng americano (Panax quinquefolium L.) 6. no último exemplo, ginsenósidos, aminoácidos e oligossacarídeos poderiam ser detectados depois de molhar o tecido cru ginseng. Ginseng americano selvagens e cultivado foram diferenciadas de tubérculo fatias6. Integridade do tubérculo de ginseng foi preservada sucedendo spray de folha MS, que permitiu uma inspeção morfológica e microscópico subsequente6. Além disso, compostos exógenos em amostras de plantas também podem ser detectados. Um número de pesticidas (acetamipride, Difenilamina, imazalil, linurão e tiabendazol) foram detectado na casca ou polpa de frutas e legumes9. Enquanto estes estudos e muitos outros têm mostrado a utilidade do pulverizador folha MS para várias finalidades específicas, um protocolo detalhado não foi anteriormente relatado.
Aqui, a descrição do protocolo não incidirá sobre a otimização do método para um determinado tecido ou composto. Em vez disso, a detecção de alcaloides de mesembrine de Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) é usada como um exemplo para discutir as medidas necessárias de otimização que devem ser tomadas ao preparar um experimento de MS de pulverizador de folha para uma espécie, tecido, ou Compound(s) pela primeira vez. S. tortuosum é uma suculenta endêmicas para a região semi-árida de Karoo, na África do Sul. Uma medicina tradicional de San e Khoi Khoi povos, foi usada para supressão apetite e sede, bem como quanto aos seus efeitos psicotrópicos e analgésicos14,15. Atualmente, os extratos padronizados são utilizados para o tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos e neuropsicológicos16,17. Os principais compostos de interesse incluem o alcaloide mesembrine e seus derivados, muitos dos quais também são encontrados em relacionados Sceletium espécies15. Populações selvagens e cultivadas de S. tortuosum têm concentrações variáveis de alcaloides mesembrine, apresentando, assim, um desafio de controle da qualidade18. Um método para a detecção rápida de mesembrine alcaloides, tais como spray de folha MS, pode ser útil na monitorização Sceletium produtos. Porque anteriormente, não tinha havido nenhum protocolo experimental visual pormenorizado pelo spray de folha técnica do MS, nós ilustraremos o método usando o exemplo da S. tortuosum, e é descrita a seguir: a modificação de uma fonte de nanospray, o seleção e preparação dos tecidos da planta, a aquisição dos dados, a interpretação dos resultados e a otimização dos parâmetros de MS.
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Protocol
1. modificações a fonte Nanospray para folha pulverizador MS
- Use uma fonte de nanospray modificada para spray de folha MS. Como não fluídico componentes são necessários para spray de folha MS, modificar a fonte, removendo a sonda LC da fonte.
- Monte o fio de MS de pulverizador de folha que aplicará a tensão no tecido da planta com o pino apropriado para conectar a fonte. Solde o pino para uma extremidade de um fio isolado; uma pinça para a extremidade oposta do fio de solda.
Nota: A braçadeira (alligator clip tipo) pode ou não ter dentes. Para o pequeno tecido, uma braçadeira sem dentes é preferencial. Um braço flex opcional com uma pinça pode ser adicionado à fonte de nanospray para auxiliar no posicionamento do tecido de planta. Nota que este protocolo especificamente descreve como executar o pulverizador folha MS em um híbrido quadrupole ion trap massa analisador sistema MS (ver a Tabela de materiais); no entanto, outros sistemas de MS podem ser alterados para executar esta técnica6. Acoplamento de spray de folha MS com uma análise química em tempo real de espectrômetro de massa portátil pode ser executada no local sem a necessidade de transportar o material de planta para o laboratório de19,20. - Posicione um tapete anti-estático no andar abaixo a fonte para reduzir a descarga elétrica que pode ocorrer da fonte usando altas tensões.
2. preparação do sistema MS para folha Spray MS
- Se o sistema foi recentemente em uso, deixe-o esfriar ao toque e remova qualquer fonte alternativa e o cone de varredura. Anexe a fonte de MS de pulverizador de folha de nanospray.
- Criar um arquivo de música com os parâmetros adequados de ionização definidos da seguinte forma: bainha, auxiliar e gás de varredura para 0; a tensão de pulverização de 2 a 5 kV; a temperatura capilar a 150-250 ° C; e o nível de RF de S-lente para 50. Salve o arquivo de música com os parâmetros desejados8,13. Otimize a tensão e a temperatura para a melhor ionização do tecido e compound(s) de interesse.
Nota: Bons pontos de partida são 4 kV e 200 ° C. - Fazer um arquivo de método, incluindo o arquivo de música de pulverizador MS folha com: MS completo positivos e negativos; uma resolução de 70.000; um alvo AGC de 1 x 106; um máximo de 200 ms; e o intervalo de varredura desejado m/z. Como alternativa, use apenas 1 polaridade.
3. preparação do instrumento, solventes e tecido de planta
Nota: Sempre use luvas e não use tecido de planta que tem sido tratado com as próprias mãos. Caso contrário, íons de contaminantes, tais como o glicol de polietileno dominará os espectros.
- Trazer os tecidos da planta para a análise para o mesmo quarto que o sistema de MS para permitir uma rápida amostragem.
- Para tecido de planta que não tem uma ponta naturalmente aguçada, use uma lâmina de barbear sobre uma lâmina de vidro para cortar um ponto afilado (Figura 2). Determinar a quantidade de tecido necessário para a análise com base na sensibilidade do instrumento, tipo de tecido e compound(s) de interesse (por exemplo, um jovem S. tortuosum folha ou seja ~ 5 mm de comprimento).
- Corte S. tortuosum sai às 10 semanas pós-germinação em tiras finas, cada um com uma extremidade pontiaguda para formar um ponto.
- Use fórceps para selecionar suavemente o tecido de planta no final que irá ser fixado. Segurando o tecido com fórceps, cuidadosamente transferi-lo para o grampo.
Cuidado: Não toque a fonte do instrumento se a tensão for na. - Ajuste o braço flexível e o fio com a pinça para posicionar o tecido em consonância com a entrada da MS para que a distância entre o tecido de planta e a entrada de iões do MS é de 5-10 mm para o triplo quadrupolo (por exemplo, TSQ) e armadilha linear quadrupolo (LTQ) e 10 -50 milímetros para o ion trap analisador de massa (por exemplo, orbitrap)8.
- Conecte a extremidade oposta do cabo da fonte. Se as primeiras tentativas produzem uma intensidade de sinal baixo, mova o tecido de planta mais perto da entrada do íon (referir-se a discussão para otimização).
- Carregar o arquivo de método; o nome do arquivo de dados e definir o local de armazenamento de arquivo. Em seguida, ligue o sistema de MS clicando em jogar e clique em Iniciar para iniciar a aquisição de dados.
- Aplicar um solvente (por exemplo, metanol) utilizando uma pipeta com uma ponta de gel de carregamento para maximizar a distância entre as mãos e a alta voltagem para proteger o usuário.
Nota: O volume de solvente necessária depende do tamanho, secura e textura do tecido, geralmente ~ 2-20 µ l. S. tortuosum folhas não exigem qualquer solvente a ser adicionado. Aplique cuidadosamente o solvente e não tocar a fonte de instrumento quando a tensão está em. Use solventes grau de LC-MS e suas obras que tem sido ácido lavado e é livre de detergentes. Em alguns tecidos, um sinal pode ser observado sem a adição de um solvente devido ao teor de água natural do tecido vegetal. No entanto, uma maior intensidade de sinal e reduzida S/N normalmente é conseguido através da aplicação de um solvente para o tecido. - Aquisição de dados, enquanto o sinal persiste ou até os espectros adequados foram recolhidos, tipicamente 30-60 s. Se necessário, aplique o solvente adicional para manter uma intensidade de sinal elevado por um longo período de tempo. Impedir a aquisição de dados e pausar o sistema de MS.
- Remova o tecido e lave a braçadeira com 100% de metanol e uma limpeza de fiapos. Limpe a entrada do íon de MS após aproximadamente 1-2 h de aquisição por spray folha MS de acordo com as especificações do fornecedor. Também, limpe a entrada de iões de MS entre as análises de tipos diferentes de tecido.
4. avaliação de qualidade de dados
- Abra o arquivo de dados e inspecione visualmente o cronograma de massa base de pico. Verifique a intensidade do sinal é ~1.0 x 107 -5.0 x 108. Se o sinal for baixo, mova o tecido mais perto da entrada do íon. Se superior, o front-end do sistema MS se tornará sujo, então mova o tecido mais longe da entrada do íon.
- Com base na presença ou ausência dos íons de interesse em espectros de massa produzida, altere os parâmetros.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. fragmentação de massa em tandem
- Decidir quais íons são de interesse para a fragmentação de massa em tandem (MS/MS); um sinal de espectros de massa que é > 1,0 x 105 é suficiente para a seleção de íons para MS/MS.
- Fazer um novo arquivo de método com uma lista de inclusão de m/z para fora com 4 casas decimais. Clique em listas globais e inclusão. Em Propriedades do PRM, selecione a energia de fragmentação [por exemplo, energia de colisão normalizado (NCE) de 30-50 é um bom intervalo para começar] e outros parâmetros de MS/MS.
- Para obter dados de MS/MS para alcaloides mesembrine, fragmentar os seguintes íons, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, em 35 NCE.
Nota: A aquisição de dados de MS/MS pode ser realizada imediatamente após a MS ou em um momento posterior. O mesmo tecido pode muitas vezes permanecer preso após uma completa MS e pode ser reutilizado para adquirir dados de MS/MS. No entanto, se um constatados não fornecem um sinal suficiente, use um tecido novo.
- Para obter dados de MS/MS para alcaloides mesembrine, fragmentar os seguintes íons, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, em 35 NCE.
- Carrega o arquivo de método de MS/MS e um arquivo de dados nomeado. Ligue o sistema MS e, em seguida, iniciar a aquisição de dados, adicionando um solvente se necessário. Quando foram coletados espectros adequados, normalmente após 30-60 s, pare a aquisição.
- Recolha a fragmentação em muitas energias diferentes ao atribuir fragmento íons.
Nota: Desde que o spray de folha MS carece de uma separação cromatográfica, os espectros de fragmentação são susceptíveis de conter muitos íons e fragmentando-se em energias diferentes vai ajudar a trazer clareza.
6. putativos identificações por fragmentação de massa massa exata e Tandem
- Fazer as identificações putativos referenciando medições precisas em massa de bancos de dados disponíveis publicamente metabólito como Metlin21, humano de banco de dados Metabolome22, banco de massa23, mapas de lipídios24, Instituto Nacional de Normas e tecnologia MS busca25, respeito pelos fitoquímicos26, ou dos PNB27.
- Como esses bancos de dados não são exaustivos, realizar uma revisão de literatura adicional sobre as espécies de planta caracterizadas quimicamente conforme necessário.
- Íons de fragmentação de correspondência da folha pulverização-MS/MS para os bancos de dados acima mencionados quando MS/MS informação está disponível, ou à literatura. Como alternativa, use uma interpretação manual de íons de fragmento de MS/MS ou uma fragmentação de uma autêntica norma realizada pela injeção direta ou LC-MS/MS.
7. análise de dados
- Converta os arquivos raw de MS para mzXML arquivos com a ferramenta de msConvert de Proteowizard28.
- Use o pacote de software XCMS implementado em R para a colheita de pico. Use uma infusão direta método pelo spray de folha MS análise de processamento.
Nota: Os scripts bem anotados, usados para processamento de dados podem ser encontrados no https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - Para obter medições semi-quantitativa, representando a variabilidade experimental, normalizar a intensidade de cada metabólito pelo íon total atual (TIC), como o spray de folha MS intensidade de sinal pode variar, em parte devido a pequenas variações no posicionamento dos a folha na fonte e as diferenças em tamanho e forma de folha.
- Como alternativa, use o software fornecido pelo fornecedor para a análise de dados ou MZmine2 (para ser encontrado em http://mzmine.github.io/)29.
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Representative Results
Em 10 semanas que pós-germinação, recém coletados com efeito de estufa-crescido S. tortuosum folhas foram analisados por spray folha MS. O fluxo de trabalho experimental para a detecção de metabólitos de S. tortuosum deixa usar spray de folha que MS é ilustrada na Figura 2. Uma folha foi selecionada, cortar uma tira fina com uma extremidade pontiaguda para formar um ponto e fixada com o spray de folha MS aparelhos de grampo de arame. O tecido de planta foi posicionado ~ 30 mm a partir da entrada do íon e em consonância com o x e y. Após a iniciação do spray folha que folhas de MS da S. tortuosum , íons foram detectados sem qualquer aplicação de solvente. As plantas da família Sceletium são plantas suculentas com folhas grossas, com um alto teor de água que permite a ionização electrospray por spray de folha MS sem a aplicação externa de um solvente. No entanto, mais tipicamente, tecidos vegetais requerem uma aplicação solvente para detectar íons.
Um cronograma de massa e espectros de massa fortemente preenchidos com íons foram produzidos após 30 s de aquisição no modo de ionização positiva (Figura 3). O cronograma representa um spray de sucesso folha MS experimento onde um sinal estável foi mantido para toda a duração da aquisição. Neste estudo, um total de nove mesembrine alcaloides foram detectados por spray de folha MS e putativos identificações foram feitas a partir a massa exata dos íons protonados de anteriormente caracterizada compostos (tabela 1)30. É vantajoso para realizar pulverizador folha MS em um alta resolução, massa exata (HRAM) espectrômetro de massa, que torna possível resolver massas ligeiramente diferentes. Por exemplo, o m/z no 262.1794 podem ser presumidamente identificados como dihydrojoubertiamine em vez de como mesembrenone-M (demethyl - dihidro-), que teria sido em m/z 262.1443.
O tecido foliar permaneceu preso por fragmentação (MS/MS) em massa em tandem de alguns íons de interesse (tabela 1). A Figura 4 mostra três exemplos de espectros de MS/MS fragmentação de spray de folha MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z. Putativos identidades foram verificadas por fragmentos em massa e confirmadas com fragmentos identificados anteriormente30. O íon protonados de 276.1583 m/z foi identificado como duas diferentes isômeros de mesembrine-M (demethyl) e outro dois isômeros de mesembrenone-M, devido à presença de fragmentos de diagnósticos para cada isômero (tabela 1).
Ambos mesembrine e mesembrine-M (dihidro-) foram detectados pelo spray de folha MS e presumidamente identificados pela massa exata, bem como pela fragmentação em massa. O íon protonados de mesembrine em 290.1742 m/z é um dos íons mais abundantes no espectro; Portanto, pode ser um candidato provável como um biomarcador para futuros estudos. Os dois principais alcaloides da S. tortuosum são mesembrine e mesembrenone, ambos os quais foram detectados prontamente por spray folha MS. Vários dos compostos detectados pelo spray de folha que MS pode ser útil na monitorização de materiais vegetais de Sceletium e produtos derivados.
Figura 1: diagrama de pulverizador MS folha de set-up. Spray de folha MS é um metabólito perfilação método que permite a amostragem rápida do tecido de planta intacta. O diagrama mostra um spray de folhas MS com kV alta tensão aplicada com uma pinça e a opção de aplicar um solvente para o tecido de planta. Spray de folha MS facilita a ionização electrospray directamente a partir do tecido de planta na entrada de MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: experimento de fluxo de trabalho do pulverizador folha MS. Tecido de planta selecionada, uma folha de Sceletium tortuosum , foi cortado e, em seguida, transferido com fórceps para ser apertada e em seguida, posicionado na frente da entrada do íon antes da aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Metabólito de criação de perfil de Sceletium tortuosum por spray de folhas MS com ionização positiva. (A), este painel mostra um spray de folha MS cronograma de massa total íon contagem (TIC). Para cada pico, o primeiro número é o tempo (min) e a parte inferior é a m/z. (B), este painel mostra o spray de folha MS perfil de metabólito de um espectro de massa positivo Sceletium tortuosum . O baixo-relevo exibe 260-295 m/z. Massas exatas são relatadas para fora com 4 casas decimais com um erro < 6 ppm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Folha pulverizador MS ionização positiva em tandem espectros de massa de Sceletium tortuosum corta folha. Estes painéis mostram espectros em massa em tandem (MS/MS) coletados no modo de ionização positiva com spray de folha MS. Putative identificações de alcaloides são feitas da massa exata e fragmentação em massa para o seguinte: (A) mesembrine-M e mesembrenone-M isômeros, mesembrine (B) e (C) mesembrine-M (dihidro-). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto | Fórmula molecular | Medido em massa monoisotópico m/z [M + H] | erro de ppm | Fragmentos de |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23não2 | 262.1794 | 5.0 | N/A |
| Mesembrenone-M (O - demethyl-) | C16H19sem3 | 274.1431 | 4.5 | N/A |
| Mesembrine-M (O - demethyl-) | C16H21não3 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine-M (N - demethyl-) | C16H21não3 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-demethyl - dihidro-) | C16H21não3 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone-M (N-demethyl - dihidro-) | C16H21não3 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H21não3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H23não3 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (dihidro-) | C17H25não3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Tabela 1: putativos identificações de Sceletium tortuosum alcaloides de mesembrine por spray folha MS. Esta tabela informa sobre massas exatas de ionização positiva e íons de fragmento de Sceletium tortuosum mesembrine alcaloides.
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Discussion
O uso bem sucedido do presente protocolo baseia-se sobre a otimização de várias etapas para as espécies de plantas, tipo de tecido e compound(s) de alvo de interesse. Os parâmetros descritos no protocolo fornecem um bom ponto de partida. As seguintes decisões experimentais precisam ser feitas e testadas: ou não para uso (1) corte ou tecido sem cortes e (2) solventes ou sem solvente, (3) o solvente para usar e em que volume, (4) qual a distância do tecido a partir da entrada do íon deve ser e (5) a amplitude de tensão. O objetivo da otimização é encontrar as condições que produzem um sinal contínuo que persiste pelo menos 30 s para alguns minutos. As condições devem fornecer uma intensidade de sinal adequado e reprodutível, que é necessário para realizar medições de MS/MS e massa exata. Intensidade de sinal elevada é conseguida através de um pulverizador bem sucedido e de confiança de íons no tecido. A qualidade de pulverização é dependente a nitidez da ponta do tecido apontando para a entrada de iões, a distância entre a ponta de entrada do tecido e íons e a tensão elétrica aplicada. Um spray de sucesso é altamente dependente a nitidez do ponto da ponta do tecido e, em alguns casos, o tecido deve ser cortado para formar uma ponta pontiaguda. Em particular, pequenas alterações na nitidez do ângulo da forma cônico na ponta do tecido corte têm efeitos significativos sobre a qualidade resultante da ionização e, portanto, a intensidade do sinal produzido7. Em casos onde os tecidos são já chamou a atenção, então nenhum corte é necessário, como é o caso com as lâminas de grama ou folhas em forma de lanceta5,13.
Um sinal de íon pode ser suprimido e instável quando a descarga de plasma ocorre no tecido como resultado de ser colocados demasiado perto da entrada do íon ou a tensão eléctrica, sendo muito alto. Um posicionamento adequado de tecido e uma selecção da tensão elétrica são necessários para assegurar um spray estável e consistente entre as amostras. A distância do tecido a partir da entrada do íon de MS também impacta a qualidade e a quantidade do sinal produzido. Em geral, uma amostra de tecido menor deve ser colocada mais perto da entrada, embora pequenas tecido não pode resultar em uma intensidade de sinal baixo, se a ponta é extremamente aguçada ou os compostos são altamente concentrados. A intensidade e a consistência dos espectros devem ser otimizadas empiricamente, comparando várias posições de colocação ao longo do eixo z. É fundamental para uma ionização apropriada que o tecido de planta está alinhado com a entrada de iões de MS em ambos os eixos x e y-Axes. No entanto, se o tecido de planta é excessivamente perto da entrada do íon, isso pode exigir uma limpeza mais frequente de óptica o íon e o front-end do sistema MS.
O volume de solvente aplicado em cima do tecido pode variar de 0 - 50 µ l, dependendo do teor de água e o tamanho da amostra de tecido. Em casos onde o tecido é extremamente alta no teor de água e é cortado, como no caso do suculento Sceletium, nenhum solvente pode ser adicionado. No entanto, é mais típico para usar pelo menos 5-10 µ l de solvente para pelo menos um aplicativo. A adição de um solvente é necessária ao usar um tecido seco ou tecido fresco com um teor de água de baixo para facilitar o spray. Se uma pequena quantidade de solvente é usada em um grande pedaço de material vegetal, é provável ser absorvido sem produzir um spray suficiente. Inversamente, se for usado um volume muito alto, compostos podem ser diluídos ou desolvation adequada não facilmente e eficientemente ocorrerá. Uma opção alternativa para pipetagem manualmente solvente é continuamente aplicar solvente para o tecido através de uma bomba de seringa, assim como uma função do tempo como o composto decompõe-se o sinal observado é empobrecido do material de planta10. Vários tipos de solventes devem ser julgados, e o espectro resultante comparado ao verificar qualquer melhoria da quantidade e consistência do ion(s) para a compound(s) de interesse. A adição de um solvente não só produz o pulverizador, mas também pode fornecer uma seletividade para a extração de compostos diferentes. Solventes orgânicos com polaridades diferentes (metanol, diclorometano, hexanos, acetonitrilo, clorofórmio e acetona) foram comparados e resultam em significativamente diferentes íons presentes no espectro de uma semente de amendoim8. Em geral, o metanol é uma boa escolha de solvente primeira, como ficou demonstrado funcionar bem para muitos tecidos vegetais e uma grande variedade de fitoquímicos, incluindo aminoácidos, alcaloides, flavonóis, carboidratos, ácidos orgânicos, ácidos graxos e fosfolipídios8. A aplicação de água de 100% sobre tecidos vegetais brutos não normalmente funciona bem, mas poderia ser melhorada com a adição de sais10. Em muitos casos, além de protonados íons de um composto, outros abundante adutos são detectados como sódio e potássio adutos. A presença de sal estes adutos é mais prevalente, quando sal é adicionado para o solvente e pode ser vantajoso. Por exemplo, um aumento da sensibilidade e seletividade de glicosídeos fenólicos de Populus espécies foram observadas com a adição de íons de sódio e potássio para o solvente aplicada10.
Duas limitações principais do pulverizador folha técnica MS são (1) a baixa gama dinâmica e desafios (2) com a quantificação. Normalmente, apenas os compostos mais abundantes são ionizados e detectados pela técnica. Diminui a eficiência de ionização devido à supressão de íon que dramaticamente ocorre na ausência de separação cromatográfica é menos de um problema com metabolitos abundantes. Para contornar essa limitação, o intervalo de varredura pode ser ajustado para focalizar somente o intervalo de m/z de interesse. No entanto, compostos de baixa abundância ainda podem não ser detectados sem a separação e concentração fornecida por cromatografia. Ao contrário a quantificação típica de compostos a partir de um extrato, padrões internos não podem ser adequadamente misturados no material de planta antes da pulverização de folha medições Semi-quantitative MS. e concentrações relativas foram obtidas pela colocação de um conhecido concentração de uma solução-padrão sobre a superfície do tecido e em seguida, permitindo seque antes de um spray de folha MS análise8,9,31. Por exemplo, o método de adição de padrão de quantificação foi usado para calcular a proporção do íon representativo para o padrão interno para o íon de interesse para determinar a quantidade relativa de32. Uma curva de calibração foi utilizada para estimar a concentração relativa. Usando este método, foi possível comparar a relação entre os vários glicosídeos de um interno rebaudiosídeo padrão, D, e a concentração relativa de glicosídeos específicos poderia então ser calculada dentro Steatravés de de folhas33. Alternativamente, uma quantificação mais precisa é possível com um padrão de desvendar etiquetado do composto de interesse, embora disponibilidade comercial pode ser um desafio. O uso do tecido de planta metabolicamente rotulado também pode melhorar a quantificação com este método,34.
Dado que convencional LC-MS/MS requer uma preparação extensiva da amostra e a separação cromatográfica, outros métodos de análise são muitas vezes desejados. Spray de folha MS é uma técnica de análise química direta que pode facilmente ser aplicada e oferece simplicidade, precisão, exatidão e metabólito rápida detecção e quantificação semi. Por esta razão, nós investigamos a adequação de spray folha MS para monitorar o índice químico da S. tortuosum, que pode proporcionar a base para químiotaxonomica ferramentas diferenciar espécies do gênero Sceletium baseado na bioquímica assinaturas. Várias propriedades anatômicas desta planta torná-lo uma amostra de teste ideal para spray de folha MS. É uma suculenta, contendo grandes quantidades de água, que é vantajoso, como o spray pode ser gerado sem a aplicação de solvente. Sceletium folha contém idioblastos (células da bexiga)15 , que servem como reservas de armazenamento onde metabólitos especializados podem acumular-se. Spray de folha MS é uma técnica de análise na vivo para caracterizar o tecido de planta de forma rápida. A técnica geral é aplicável a muitas espécies de plantas, tipos de tecido e classes de compostos. Técnicas que captura informações sobre compostos de plantas são de grande interesse para entender o metabolismo primário e especializado de planta para usos humanos de saúde, nutrição, agricultura e energia35.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela concessão do programa de pesquisa de genoma de planta NSF IOS-1238812 e a sociedade pós-doutorado em biologia IOS-1400818. O trabalho também foi financiado por uma bolsa de pós-graduação aluno de Monsanto para Katherine A. Sammons. O africano pesquisador Fulbright Scholars Program (2017-2018) é agradeceu por financiamento concedido a Nokwanda P. Makunga. Agradecemos imensamente a doação de uma fonte de nanospray de Jessica Prenni e a proteómica e metabolómica facilidade na Colorado State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
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