Summary
Blatt-Spray-Massenspektrometrie ist eine direkte chemische Analyse-Technik, die minimiert die Probenvorbereitung und beseitigt Chromatographie, so dass für die schnelle Erkennung von kleinen Molekülen von Pflanzengewebe.
Abstract
Pflanzen produzieren Tausende von kleinen Molekülen, die in ihren chemischen Eigenschaften unterschiedlich sind. Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Technik für Pflanze Metaboliten zu analysieren, denn es Molmassen mit hoher Sensitivität und Spezifität bietet. Blatt-Spray MS ist eine ambient Ionisation Technik wo Pflanzengewebe für direkte chemische Analyse über Elektrospray, Beseitigung von Chromatographie aus dem Prozess verwendet. Dieser Ansatz zur Probenahme Metaboliten ermöglicht eine Vielzahl von chemischen Klassen gleichzeitig von intakten Pflanzengewebe, Minimierung der Menge der Probenvorbereitung erforderlich erkannt werden. Bei Verwendung mit einem hochauflösenden, genaue Masse MS erleichtert Blatt Spray MS den Schnellnachweis von Metaboliten von Interesse. Es ist auch möglich, tandem mass Fragmentierung Datensammlung mit dieser Technik um eine zusammengesetzte Identifizierung zu erleichtern. Die Kombination aus präzise massenmessungen und Fragmentierung ist vorteilhaft bei der Bestätigung zusammengesetzte Identitäten. Das Blatt-Spray MS Technik erfordert nur geringfügige Änderungen Nanospray Ionisierung Quelle und ist ein nützliches Werkzeug zum Ausbau der Fähigkeiten eines Massenspektrometers. Hier wird frisches Blattgewebe aus Sceletium Tortuosum (Mittagsblumengewächsen), eine traditionelle Heilpflanze aus Südafrika, analysiert; zahlreiche Mesembrine Alkaloide werden mit Blatt-Spray MS erkannt.
Introduction
Pflanzen enthalten eine Vielzahl von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. MS ist eine leistungsfähige Technik für Pflanzenstoffe zu analysieren, da es elementare Kompositionen eine hohe Sensitivität und Spezifität für die Detektion und Identifizierung von Metaboliten1verschaffen kann. Am häufigsten wird MS auf Lösungsmittel extrahierte Proben durchgeführt, die durch Chromatographie vor MS Analysis1getrennt sind. Jedoch der Flüssigchromatographie (LC) langen Analysenzeiten benötigt und ist oft verbunden mit einem umfangreichen Probe Vorbereitung1. Im Gegensatz dazu ist direkte chemische Analyse von intakten Gewebe, die Chromatographie umgeht eine sehr schnelle Technik, minimales Beispiel Vorbereitung2erfordern. In Fällen wo chromatographische Schritte verzichtet werden können, kann somit eine direkte chemische Analyse sehr vorteilhaft sein.
Typische LC-MS für natürliche Produkte und Metabolomics-Forschung stützt sich auf langwierige Bulk Extraktionen von getrockneten oder gefrorenen Pflanzenmaterial, enthält mehrere Gewebe und Zelle Arten3. Alternativ kann direkte chemische Analyse, wie die MS-Detektion von Metaboliten von Pflanzengewebe, Zelltypen zu isolieren und Vorbereitung Artefakte4vermeiden. Blatt-Spray MS, auch bezeichnet als Gewebe-Spray5,6, ist eine direkte ambient Ionisation MS-Technik, die im wesentlichen keine Probe Vorbereitung5,7erfordert. Blatt-Spray, die MS auf Papier Spray MS, eine ambient Ionisation Technik mit Merkmalen der Elektrospray-Ionisation verwandt ist, die für die Erkennung von Analyten ermöglicht, die auf Papier7abgelegt werden. Trotz des Namens Blatt Spray MS ist für verschiedene Arten von Pflanzengewebe, nicht nur Blätter und wurde auf Obst, Samen, Wurzeln, floral Gewebe und Knollen unter anderem6,8,9, demonstriert 10,11,12. Die Technik erleichtert die Ionisierung der endogenen Phytochemicals direkt aus pflanzlichen Stoffen in das Massenspektrometer für Erkennung8. Blatt-Spray MS bieten auch Informationen über die räumliche Verteilung der Chemikalien in verschiedenen Gewebetypen in Pflanzen13. Wenn Blatt Spray MS mit solvent-Extraktion und LC-MS verglichen wird, deuten die Ergebnisse Blatt-Spray, die MS für die schnelle Erkennung von Oberfläche Metaboliten von einzigartigen Zelltypen wie Trichome13ermöglicht. Abbildung 1 zeigt den Blatt Spray MS Versuchsaufbau. Direkte Elektrospray-Ionisation tritt nach nur geringfügigen Quelle Änderungen. Liegt eine hohe Spannung auf das pflanzliche Gewebe über eine Metallklammer, produzieren einen Spray von hoch geladenen Tröpfchen bilden einen Taylor-Kegel, der trägt die Ionen mit dem Ion-Einlass der MS. Electrospray Ionisierung tritt aus der natürlichen Flüssigkeit der Pflanze oder vom Lösungsmittel appl IED auf der Pflanzenoberfläche. Eine Spitze auf das Gewebe der Elektrospray erleichtert und kann natürlich vorkommende oder geschaffene durch Schneiden.
Blatt-Spray MS ist eine schnelle Methode für die semi-quantitative und qualitative Analyse der intakten Pflanzengewebe, die Dienstprogramm für vielfältige Anwendungen gefunden haben. Zum Beispiel wurde die Technik zur endogene Verbindungen, verwandte Arten zu unterscheiden und auch zu Änderungen in der gleichen Spezies, die unter verschiedenen Bedingungen gewachsen bewerten zu erkennen. Frühere Studien haben hierbei gezeigt, durch die Messung der Metaboliten in Beautyberry (Callicarpa L.) 12 und amerikanischer Ginseng (Panax Quinquefolium L.) 6. im zweiten Beispiel, ginsenoside, Aminosäuren und Oligosaccharide konnte nach Benetzung rohes Ginseng Gewebe nachgewiesen werden. Wilde und kultivierte amerikanischer Ginseng wurden von Knolle Scheiben6differenziert. Ginseng Knolle Integrität blieb nachfolgenden Blatt Spray MS, die für eine anschließende morphologische und mikroskopische Prüfung6erlaubt. Darüber hinaus können auch exogene Verbindungen auf Pflanzenproben nachgewiesen werden. Eine Reihe von Pestiziden (Acetamiprid, Diphenylamine, Imazalil, Linuron und Thiabendazol) wurden auf Schale und Fruchtfleisch von Obst und Gemüse9gefunden. Während diese Studien und viele andere das Dienstprogramm Blatt Spray MS für verschiedene spezifische Zwecke gezeigt haben, hat ein detailliertes Protokoll bisher nicht gemeldet.
Die Protokollbeschreibung wird hier nicht auf die Optimierung der Methode für eine bestimmte Gewebe oder zusammengesetzte konzentrieren. Vielmehr wird die Erkennung von Mesembrine Alkaloide von Sceletium Tortuosum (L.) N.E.Br. (Mittagsblumengewächsen) als Beispiel verwendet, um notwendigen Optimierungsmaßnahmen besprechen, die getroffen werden sollten, wenn Sie ein Blatt Spray MS Experiment für eine Art Gewebe, einrichten oder zum ersten Mal widerrufen. S. Tortuosum ist eine saftige endemisch in der semi-ariden Karroo-Region in Südafrika. Eine traditionelle Medizin der San und Khoi Khoi Völker, es diente für Appetit und Durst Unterdrückung sowie die psychotropen und analgetische Effekte14,15. Derzeit sind standardisierte Extrakte für die Behandlung von neuropsychiatrischen und neuropsychologischen Störungen16,17verwendet. Die primäre Verbindungen des Interesses enthalten das Alkaloid Mesembrine und seine Derivate, von die viele auch in verwandten Sceletium Arten15gefunden werden. Wilde und kultivierte Populationen von S. Tortuosum haben Variable Konzentrationen der Mesembrine Alkaloide, damit eine Qualitätskontrolle Herausforderung18präsentieren. Eine Methode für die schnelle Erkennung von Mesembrine Alkaloide, wie Blatt-Spray MS, kann bei der Überwachung der Sceletium Produkte hilfreich sein. Denn bisher es keine detaillierte visuelle experimentelles Protokoll für das Blatt-Spray MS Technik gab, wir zeigen die Methode am Beispiel von S. Tortuosumund Folgendes beschrieben: die Änderung einer Nanospray-Quelle, die Auswahl und Vorbereitung von Pflanzengewebe, die Erfassung der Daten, die Interpretation der Ergebnisse und die Optimierung der MS-Parameter.
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Protocol
1. Änderungen an Nanospray Quelle für Leaf Sprühen MS
- Verwenden Sie eine modifizierte Nanospray Quelle für Blatt Spray MS. Da keine fluidischen Komponenten für Blatt Spray MS notwendig sind, ändern Sie die Quelle durch das Entfernen der LC-Sonde aus der Quelle.
- Montieren Sie das Blatt MS spritzdraht, das die Spannung auf das pflanzliche Gewebe mit den entsprechenden Pin zum Einstecken in die Quelle angewendet wird. Löten Sie die Pin an einem Ende ein isolierter Draht; Löten Sie eine Klammer am anderen Ende des Drahtes.
Hinweis: Die Klemme (Alligator-Clip-Typ) kann oder haben keine Zähne. Für kleine Gewebe wird eine Klammer ohne Zähne bevorzugt. Ein optionale Flex-Arm mit einer Klammer kann die Nanospray Quelle, bei der Positionierung der Pflanzengewebe hinzugefügt werden. Beachten Sie, dass dieses Protokoll konkret beschreibt wie Blatt-Spray MS auf einem Hybrid Quadrupol Ionenfallen Masse Analysator MS System durchführen (siehe die Tabelle der Materialien); jedoch können andere MS-Systeme geändert werden, um diese Technik6durchführen. Kupplung Blatt-Spray kann MS mit einer tragbaren Massenspektrometer in Echtzeit chemische Analyse vor Ort ohne die Notwendigkeit, das Pflanzenmaterial zu den Labor-19,-20transport durchgeführt werden. - Positionieren Sie eine antistatische Matte auf dem Boden unterhalb der Quelle, die elektrische Entladung zu reduzieren, die von der Quelle bei hohen Spannungen auftreten.
2. Vorbereitung des MS System für Blatt-Spray-MS
- Wenn das System vor kurzem verwendet wurde, lassen Sie es kühl auf der Haut und entfernen alternative Quelle und der Sweep-Kegel. Befestigen Sie die Nanospray Blatt Spray MS Quelle.
- Erstellen Sie eine Melodie-Datei mit den entsprechenden Ionisation Parametern wie folgt festgelegt: Mantel, Hilfs- und Sweep-Gas auf 0; die Spray-Spannung, 2 bis 5 kV; die Kapillare Temperatur auf 150-250 ° C; und die S-Objektiv HF-Pegel bis 50. Speichern Sie die Melodie-Datei mit der gewünschten Parameter8,13. Optimieren Sie die Spannung und Temperatur für die besten Ionisation des Gewebes und widerrufen von Interesse.
Hinweis: Gute Ausgangspunkte sind 4 kV und 200 ° C. - Machen Sie eine Methode-Datei einschließlich der Blatt-Spray MS-Melodie-Datei mit: positive und negative vollständige MS; eine Auflösung von 70.000; ein AGC-Ziel von 1 x 106; ein Maximum von 200 ms; und den gewünschten Scan-Bereich m/Z. Alternativ können Sie nur 1 Polarität.
3. Vorbereitung des Instruments, Lösungsmittel und pflanzliches Gewebe
Hinweis: Immer Handschuhe tragen, und verwenden Sie Pflanzengewebe, die bearbeitet wurden nicht mit bloßen Händen. Andernfalls werden die Verunreinigung Ionen wie Polyethylenglykol Spektren dominieren.
- Bringen Sie das Pflanzengewebe für die Analyse in den gleichen Raum wie das MS-System ermöglicht eine schnelle Auswahl.
- Für pflanzliches Gewebe, das nicht natürlich Spitze, eine Rasierklinge auf einen Objektträger zu verwenden, um einen konischen Punkt (Abbildung 2) geschnitten. Bestimmen die Menge des Gewebes benötigt für die Analyse anhand der Instrument-Empfindlichkeit, Gewebetyp und widerrufen von Interesse (z. B., eine junge S. Tortuosum Blatt d. h. ~ 5 mm in der Länge).
- Geschnittenen S. Tortuosum fährt um 10 Wochen nach dem Keimen in dünne Streifen, die jeweils mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden.
- Verwenden Sie Zange, um sanft das Pflanzengewebe am Ende auszuwählen, die geklemmt werden. Halten Sie das Gewebe mit der Pinzette, sorgfältig auf die Klemme übertragen.
Vorsicht: Berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf. - Anpassen der flexible Arm und den Draht mit der Klemme, das Gewebe im Einklang mit dem MS-Einlass zu positionieren, so dass der Abstand zwischen der Pflanzengewebe und dem Ion-Einlass der MS 5-10 mm für die triple Quadrupol (z.B.TSQ) und linearen Falle Quadrupol (LTQ) und 10 -50 mm für die Ionenfalle Masse Analysator (z.B. Orbitrap)8.
- Stecken Sie das gegenüberliegende Ende des Drahtes in die Quelle. Wenn die ersten Versuche eine niedrige Signalintensität produzieren, bewegen das Pflanzengewebe näher mit dem Ion-Einlass (siehe die Diskussion zur Optimierung).
- Laden Sie die Datei Methode; Benennen Sie die Datei und legen Sie den Speicherort der Datei. Schalten auf dem MS-System durch klicken, spielen und klicken Sie auf starten , um Erfassung von Daten zu beginnen.
- Wenden Sie ein Lösungsmittel (z.B. Methanol) mit einem Pipettieren mit einer Gel-laden-Spitze, um den Abstand zwischen den Händen und die Hochspannung zum Schutz des Anwenders zu maximieren.
Hinweis: Das Lösungsmittel Volumen benötigt, hängt von der Größe, Trockenheit und Textur des Gewebes, in der Regel ~ 2-20 µL. S. Tortuosum Blätter nicht Lösungsmittel hinzugefügt werden benötigen. Auftragen Sie die Lösungsmittel vorsichtig und berühren Sie die Instrument-Quelle nicht, wenn die Spannung auf. Verwenden Sie LC-MS Grade Lösungsmittel und Glaswaren, die Säure gewaschen wurde und ist frei von Reinigungsmitteln. In einigen Geweben kann ein Signal ohne Zugabe eines Lösungsmittels aufgrund der natürlichen Wassergehalt von Pflanzengewebe beobachtet werden. Jedoch wird eine höhere Signalintensität und reduzierten S/N in der Regel durch die Anwendung eines Lösungsmittels des Gewebes erreicht. - Daten zu erwerben, solange das Signal anhält oder bis die angemessene Spektren gesammelt haben, in der Regel 30-60 s. Bei Bedarf wenden Sie zusätzliche Lösungsmittel um eine hohe Signalintensität für einen längeren Zeitraum hinweg beizubehalten. Die Datenerfassung zu stoppen und Anhalten der MS-System.
- Entfernen Sie das Gewebe zu und waschen Sie die Klammer mit 100 % Methanol und einem fusselfreien Tuch. Reinigen Sie den MS Ion Einlass nach ca. 1-2 h des Erwerbs Blatt Spray MS nach Vorgaben des Herstellers. Reinigen Sie auch den MS Ion Einlass zwischen Analysen der verschiedenen Gewebetypen.
4. Data Quality Assessment
- Öffnen Sie die Datendatei und Sichtprüfung der Basis Peak mass Chronogramm. Überprüfen Sie, dass die Signalintensität ~1.0 X 107 bis 5,0 x 108. Wenn das Signal niedriger ist, verschieben Sie das Gewebe näher mit dem Ion-Einlass. Wenn höher, das vordere Ende des MS System verschmutzt wird, so bewegen Sie das Gewebe weiter von den Ionen-Einlass.
- Basierend auf das Vorhandensein oder Fehlen der Ionen des Interesses an der Massenspektren produziert, die Parameter verändert.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
(5) Tandem Mass Fragmentierung
- Entscheiden Sie, was Ionen sind von Interesse für die Tandem-Massen-Fragmentierung (MS/MS); ein Massenspektren Signal, dass > 1,0 x 105 ist ausreichend für die Auswahl von Ionen für MS/MS.
- Machen Sie eine neue Methode-Datei mit einer Aufnahmeliste m/Z , auf 4 Dezimalstellen. Klicken Sie auf globale Listen und Aufnahme. Wählen Sie unter Eigenschaften von PRM, die Fragmentierung Energie [z.B.normalisierte Aufprallenergie (NCE) von 30-50 ist eine gute Auswahl zu] und andere MS/MS-Parameter.
- MS/MS-Daten für Mesembrine Alkaloide erhalten, fragment der folgenden Ionen, 276.1583 m/Z, 290.1742 m/Z, und 292.1897 m/Zbei NCE 35.
Hinweis: MS/MS-Datenerfassung kann unmittelbar nach der MS oder zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Das gleiche Gewebe kann oft nach einer vollen MS eingespannten bleiben und kann wiederverwendet werden, um MS/MS-Daten zu erfassen. Wenn jedoch eine Neulackierung kein ausreichendes Signal zur Verfügung stellt, nutzen Sie ein neues Gewebe.
- MS/MS-Daten für Mesembrine Alkaloide erhalten, fragment der folgenden Ionen, 276.1583 m/Z, 290.1742 m/Z, und 292.1897 m/Zbei NCE 35.
- Die MS/MS-Methode-Datei und eine benannte Datei zu laden. Schalten Sie die MS-System, und starten Sie Datenerfassung, Lösungsmittel hinzufügen, wenn nötig. Wenn ausreichende Spektren gesammelt wurden, in der Regel nach 30-60 s, stoppen Sie den Erwerb.
- Zersplitterung in viele unterschiedliche Energien zu sammeln, bei der Zuweisung von Fragment-Ionen.
Hinweis: Da Blatt Spray MS eine chromatographische Trennung fehlt, die Fragmentierung Spektren sind wahrscheinlich viele Ionen enthalten, und Fragmentierung bei verschiedenen Energien helfen Klarheit zu bringen.
(6) vermeintlichen Identifikationen durch genaue Masse und Tandem Mass Fragmentierung
- Machen Sie vermeintliche Identifikationen durch Verweis auf präzise massenmessungen von öffentlich zugänglichen Metabolit Datenbanken wie z. B. Metlin21, menschliche Metabolom Datenbank22, Masse Bank23, Lipid-Karten24, National Institute of Standards und Technologie MS suchen25, Respekt für sekundäre Pflanzenstoffe26oder festzulegenden27.
- Da diese Datenbanken nicht erschöpfend sind, führen Sie eine zusätzliche Literaturrecherche auf die Pflanzenarten, die chemisch charakterisiert wie nötig.
- Spiel Fragmentierung Ionen aus Blatt Sprühen MS/MS, zu den oben genannten Datenbanken Wenn MS/MS-Informationen verfügbar sind, oder der Literatur. Alternativ können Sie eine manuelle Interpretation der MS/MS-Fragment-Ionen oder eine Fragmentierung eines authentischen Standards durch die Direkteinspritzung oder LC-MS/MS durchgeführt.
7. die Datenanalyse
- Konvertieren Sie die raw-Dateien von MS in MzXML Dateien mit dem MsConvert-Tool von Proteowizard28.
- Verwenden Sie die XCMS-Software-Paket in R für Peak Picking implementiert. Verwenden Sie eine direkte Infusion Verarbeitungsmethode für das Blatt-Spray MS-Analyse.
Hinweis: Gut kommentierte für die Datenverarbeitung verwendeten Skripte finden Sie auf https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - Um semi-quantitative Messungen, Buchhaltung für die experimentelle Variabilität, Normalisieren Sie die Intensität der einzelnen Metaboliten durch die gesamte Ionenstrom (TIC) als MS Signalintensität variieren kann, teilweise durch leichte Abweichungen bei der Positionierung der Blatt-spray das Blatt in die Quelle und die Unterschiede in Blattform und Größe.
- Alternativ können Sie Hersteller bereitgestellten Software für die Datenanalyse oder MZmine2 (bei http://mzmine.github.io/ gefunden werden)29.
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Representative Results
Bei 10 Wochen nach dem Keimen, frisch gesammelten Gewächshaus gewachsen S. Tortuosum Blätter wurden von Blatt Spray MS analysiert. Die experimentelle Workflow zum Nachweis von Metaboliten von S. Tortuosum verlässt mit Blatt-Spray, die MS in Abbildung 2dargestellt ist. Ein Blatt wurde ausgewählt, schneiden Sie in einen dünnen Streifen mit einem konischen Ende um einen Punkt zu bilden und mit dem Blatt-Spray MS Draht Clamp Vorrichtung eingespannt. Das pflanzliche Gewebe war ~ 30 mm vom Ion Einlass und im Einklang mit der x- und y-Achse positioniert. Nach der Einleitung der Blatt-Spray, das MS S. Tortuosum verlässt, wurden Ionen ohne irgendwelche Lösungsmittel Anwendung gefunden. Pflanzen der Familie Sceletium sind Sukkulenten mit dicken Blättern mit hohem Wassergehalt, der Elektrospray-Ionisation durch Blatt Spray MS ohne die externe Anwendung eines Lösungsmittels ermöglicht. Pflanzengewebe erfordern in der Regel, jedoch eine Lösungsmittel Anwendung Ionen zu erkennen.
Eine Masse Chronogramm und Massenspektren dicht besiedelt mit Ionen entstanden nach 30 s Akquisition in positive Ionisation Modus (Abbildung 3). Das Chronogramm stellt eine erfolgreiches Blatt-Spray MS zu experimentieren, wo ein stabiles Signal für die gesamte Dauer des Erwerbs beibehalten wurde. In dieser Studie charakterisiert eine Gesamtmenge von neun Mesembrine, die Alkaloide nachgewiesen durch Blatt Spray MS und vermeintliche Identifikationen von der genauen Masse der protonierten Ionen von zuvor wurden Verbindungen (Tabelle 1)30. Es ist vorteilhaft, Blatt Spray MS auf einem hochauflösenden, genaue Masse (HRAM) Massenspektrometer, durchführen, die es ermöglicht, leicht unterschiedliche Massen zu beheben. Zum Beispiel m/Z am 262.1794 konnte als Dihydrojoubertiamine anstelle von Mesembrenone-m vermeintlich identifiziert werden (demethyl - Dihydro-), was bei m/Z 262.1443 gewesen wäre.
Das Blattgewebe blieb eingespannten für ein Tandem mass (MS/MS) Fragmentierung von ein paar Ionen von Interesse (Tabelle 1). Abbildung 4 zeigt drei Beispiele für MS/MS-Fragmentierung-Spektren von Blatt Spray MS, 276.1583 m/Z, 290.1742 m/Zund 292.1897 m/Z. Vermeintliche Identitäten wurden durch Masse Fragmente überprüft und bestätigt mit zuvor identifizierten Fragmente30. Das protonierten Ion von 276.1583 m/Z wurde identifiziert als zwei verschiedene Isomere von Mesembrine M (demethyl) und ein weiteres zwei Isomere von Mesembrenone-m aufgrund des Vorhandenseins von diagnostischen Fragmente für jedes Isomer (Tabelle 1).
Mesembrine und Mesembrine-M (Dihydro-) wurden vom Blatt Spray MS erkannt und vermeintlich identifiziert durch genaue Masse sowie Masse Fragmentierung. Protonierten Ion von Mesembrine bei 290.1742 m/Z ist eines der am häufigsten vorkommenden Ionen im Spektrum; Daher kann es ein aussichtsreicher Kandidat als Biomarker für zukünftige Studien sein. Die zwei wichtigsten Alkaloide von S. Tortuosum sind Mesembrine und Mesembrenone, die leicht durch Blatt Spray MS erkannt wurden. Einige der Verbindungen erkannt durch Blatt-Spray, was MS bei der Überwachung von Pflanzenmaterial Sceletium und abgeleitete Produkte nützlich sein können.
Abbildung 1: Leaf Spray MS Diagramm des Aufstellortes. Blatt-Spray MS ist ein Metabolit profiling-Verfahren, das für die schnelle Probenahme von intakten Pflanzengewebe ermöglicht. Das Diagramm zeigt eine Blatt-Spray MS mit kV hohe Spannung mit einer Klemme und die Möglichkeit, ein Lösungsmittel, das Pflanzengewebe anzuwenden. Blatt-Spray MS erleichtert Electrospray Ionisierung direkt aus der Pflanzengewebe in den MS-Einlauf. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Experimentieren Sie Workflow Blatt Spray MS. Ausgewählte pflanzliche Gewebe, ein Blatt Sceletium Tortuosum wurde geschnitten, dann mit Zange geklemmt und dann vor dem Ion Einlass vor der Datenerfassung positioniert werden übertragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Metabolit Profilierung der Sceletium Tortuosum von Blatt-Spray MS mit positive Ionisation. (A) dieses Panel zeigt ein Blatt-Spray MS total Ion Graf (TIC) Masse Chronogramm. Für jeden Peak die obere Reihe ist die Zeit (min) und der Boden ist die m/Z. (B) dieses Panel zeigt das Blatt-Spray MS Metabolit Profil ein Sceletium Tortuosum positive Massenspektrum. Der Inset zeigt 260-295 m/Z. Genaue Massen sind auf 4 Dezimalstellen mit einem Fehler < 6 ppm berichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Leaf Spray MS positive Ionisation Tandem Massenspektren von Sceletium Tortuosum schneiden Blatt. Diese Tafeln zeigen Tandem Massenspektren (MS/MS) gesammelt in positive Ionisation Modus mit Blatt-Spray MS. Putative Identifikationen der Alkaloide sind die genauen Masse und Masse Fragmentierung für folgende aus: (A) Mesembrine- und Mesembrenone-M Isomere, (B) Mesembrine und (C) Mesembrine-M (Dihydro-). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Verbindung | Summenformel | Gemessenen Monoisotopic Masse m/Z [M + H] | ppm-Fehler | Fragmente |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23Nr.2 | 262.1794 | 5.0 | N/A |
| Mesembrenone-M (O - demethyl-) | C16H19Nr.3 | 274.1431 | 4.5 | N/A |
| Mesembrine-M (O - demethyl-) | C16H21Nr.3 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine-M (N - demethyl-) | C16H21Nr.3 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-demethyl - Dihydro-) | C16H21Nr.3 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone-M (N-demethyl - Dihydro-) | C16H21Nr.3 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H21Nr.3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H23Nr.3 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (Dihydro-) | C17H25Nr.3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Tabelle 1: vermeintliche Identifikationen von Sceletium tortuosum Mesembrine Alkaloide durch Blatt Spray MS. Diese Tabelle berichtet über positive Ionisation genaue Massen und Fragment-Ionen für Sceletium Tortuosum Mesembrine Alkaloide.
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Discussion
Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls stützt sich auf die Optimierung der verschiedenen Schritte für die Pflanzenarten, Gewebetyp und Ziel widerrufen von Interesse. Im Protokoll beschriebenen Parameter bieten einen guten Ausgangspunkt dar. Die folgenden experimentellen Entscheidungen müssen hergestellt und getestet werden: ob zu verwenden (1) Schnitt oder ungeschnitten Gewebe und Lösungsmittel (2) keine Lösungsmittel, (3) welche Lösungsmittel zu verwenden und in welchem Volumen (4) was die Entfernung von Gewebe aus dem Ion sollte sein , und (5) die Spannungsamplitude. Das Ziel der Optimierung ist es, die Bedingungen zu finden, die ein kontinuierliches Signal zu produzieren, die weiterhin für mindestens 30 s auf wenige Minuten. Die Bedingungen sollen eine angemessene und reproduzierbare Signalintensität, die benötigt wird, um genaue Masse und MS/MS-Messungen durchzuführen. Hoher Signalintensität wird über eine erfolgreiche und zuverlässige Spray von Ionen aus dem Gewebe erreicht. Die Spritzqualität ist abhängig von der Schärfe der Spitze des Gewebes in Richtung der Ionen-Inlet, den Abstand zwischen der Spitze des Gewebes und Ionen-Inlet und die elektrische Spannung. Eine erfolgreiche Spray ist stark abhängig von der Schärfe des Punktes der Gewebe Spitze, und in einigen Fällen sollte das Gewebe geschnitten werden, um eine Spitze zu bilden. Insbesondere geringfügige Änderungen in der Schärfe der Winkel von der konischen Form an der Spitze des geschnittenen Gewebes haben erhebliche Auswirkungen auf die resultierende Qualität der Ionisation und damit die Signalintensität hergestellt7. In Fällen wo Gewebe bereits darauf hingewiesen werden, ist dann kein schneiden notwendig, wie der Fall mit Grashalmen oder lanzenförmigen Blätter5,13.
Ein Ionen-Signal unterdrückt werden kann und instabilen Plasmaentladung tritt aus dem Gewebe durch Wesen gelegt zu nahe Ion Einlauf oder die elektrische Spannung zu hoch. Eine richtige Positionierung des Gewebes und eine Auswahl der elektrischen Spannung sind erforderlich, um eine stabile und Konstante Spray zwischen Proben sicherzustellen. Die Entfernung des Gewebes aus dem MS Ion wirkt sich auch auf die Qualität und Quantität des Signals produziert. Im Allgemeinen sollte eine kleine Gewebeprobe näher mit dem Einlass platziert werden, obwohl kleine Gewebe nicht in eine niedrige Signalintensität führen kann, wenn die Spitze besonders darauf hingewiesen wird oder die Verbindungen hochkonzentriert sind. Die Intensität und die Konsistenz der Spektren sollte empirisch optimiert werden, durch den Vergleich mehrerer Platzierungspositionen entlang der z-Achse. Es ist entscheidend für eine geeignete Ionisation, dass das pflanzliche Gewebe mit dem MS-Ion-Einlass in den x- und y-Achsen ausgerichtet ist. Jedoch wenn das Pflanzengewebe unangemessen in der Nähe der Ionen-Einlass ist, kann dies erfordern eine häufigere Reinigung der Ionen-Optik und das vordere Ende des MS-System.
Das Volumen des Lösungsmittels auf das Gewebe aufgetragen reichen von 0 - 50µL je nach Wassergehalt und die Größe der Gewebeprobe. In Fällen, wo das Gewebe ist extrem hohen Wassergehalt und geschnitten ist, wie im Fall von saftigen Sceletium, kann keine Lösungsmittel hinzugefügt werden. Allerdings ist es eher typisch, mindestens 5-10 µL des Lösungsmittels für mindestens eine Anwendung zu verwenden. Die Zugabe eines Lösungsmittels ist notwendig, wenn eine getrocknete Gewebe oder frischen Gewebe mit niedrigem Wassergehalt zu verwenden, um das Spray zu erleichtern. Wenn eine kleine Menge des Lösungsmittels auf ein großes Stück des Pflanzenmaterials verwendet wird, wird es wahrscheinlich aufgenommen werden, ohne eine ausreichende Spray zu produzieren. Umgekehrt, wenn zu hoher Lautstärke verwendet wird, Verbindungen können verdünnt werden oder richtige zugeführten tritt nicht leicht und effizient. Als Alternative zu manuell pipettieren Lösungsmittel soll kontinuierlich Lösungsmittel auf das Gewebe über eine Spritzenpumpe anwenden, sodass das beobachtete Signal zerfällt als Funktion der Zeit als die Verbindung von der Pflanze Material10aufgebraucht ist. Verschiedene Arten von Lösungsmittel sollte versucht werden, und die daraus resultierende Spektren im Vergleich um zu überprüfen, eine Verbesserung der Menge und Konsistenz des Ion(s) für das Widerrufen von Interesse. Die Zugabe eines Lösungsmittels Spray erzeugt nicht nur, sondern bieten auch eine Selektivität für die Gewinnung von verschiedenen Verbindungen. Organische Lösungsmittel mit unterschiedlichen Polaritäten (Methanol, Dichlormethan, Hexanes, Acetonitril, Chloroform und Aceton) verglichen wurden und führen zu deutlich unterschiedlichen Ionen in den Spektren von einer Erdnuss Samen8vorhanden. Im Allgemeinen ist Methanol eine gute erste Lösungsmittel Wahl, wie sich gezeigt hat, gut für viele Pflanzengewebe und eine Vielzahl von sekundären Pflanzenstoffen, darunter Aminosäuren, Alkaloide, Flavonole, Kohlenhydrate, organische Säuren, Fettsäuren und Phospholipide8zu arbeiten. Die Anwendung der 100 % Wasser auf unbeschnittenen Pflanzengewebe funktioniert nicht in der Regel gut aber mit dem Zusatz von Salzen10verbessert werden könnte. In vielen Fällen neben protonierten Ionen einer Verbindung andere reichlich Addukte werden erkannt, wie Natrium und Kalium Addukte. Das Vorhandensein dieser Salz Addukte ist sogar häufiger, wenn Salz das Lösungsmittel hinzugefügt ist und kann von Vorteil sein. Zum Beispiel wurden mit dem Zusatz von Natrium und Kalium-Ionen auf die eingesetzten Lösungsmittel10eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität der phenolische Glycoside von Populus -Arten beobachtet.
Zwei wesentliche Einschränkungen der Blatt-Spray MS Technik sind (1) die geringen Dynamikumfang und (2) Herausforderungen mit Quantifizierung. In der Regel sind nur die am häufigsten vorkommenden Verbindungen ionisiert und durch die Technik erkannt. Sinkt der Ionisation Effizienz aufgrund der Ionen-Unterdrückung, die dramatisch bei fehlender chromatographische Trennung auftritt sind weniger ein Problem mit reichlich Metaboliten. Um diese Einschränkung zu umgehen, kann der Scan-Bereich zu konzentrieren auf nur den m/Z -Bereich von Interesse eingestellt werden. Jedoch können Low-Fülle Verbindungen ohne die Trennung und die Konzentration von Chromatographie zur Verfügung gestellt noch nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu den typischen Quantifizierung von Verbindungen aus einem Extrakt internen Standards nicht richtig vermischt werden in das Pflanzenmaterial vor dem Blatt Spray MS. Semi-quantitative Messungen und relativen Konzentrationen gewonnen wurden, indem man eine bekannte Konzentration einer Standardlösung auf der Gewebeoberfläche und dann damit es vor einem Blatt trocken spray MS Analyse8,9,31. Die Quantifizierung Methode wurde z. B. das Verhältnis des repräsentativen ions für den internen Standard, das Ion von Interesse festzustellen, relativen Mengen32zu berechnen. Eine Kalibrierungskurve wurde benutzt, um die relative Konzentration zu bestimmen. Mit dieser Methode war es möglich, das Verhältnis der verschiedenen Glykoside, einen internen standard, Rebaudiosid D vergleichen, und die relative Konzentration von bestimmten Glykosiden könnte dann in Steüber Blätter33berechnet werden. Alternativ ist eine genauere Quantifizierung möglich mit einem isotopisch beschriftete Standard der Verbindung von Interesse, wenn kommerzielle Verfügbarkeit eine Herausforderung sein kann. Der Einsatz von metabolisch beschrifteten Pflanzengewebe kann auch die Quantifizierung mit dieser Methode34verbessern.
Angesichts der Tatsache, dass konventionelle LC-MS/MS eine umfangreiche Probenvorbereitung und chromatographische Trennung erfordert, sind andere Methoden für die Analyse oft gewünscht. Blatt-Spray MS ist eine direkte chemische Analyse-Technik, die leicht angewendet werden kann und bietet Einfachheit, Präzision, Genauigkeit und schnelle Metabolit Erkennung und semi-Quantifizierung. Aus diesem Grund haben wir die Eignung von Blatt-Spray MS, der chemischen Zusammensetzung von S. Tortuosum, zu überwachen, die die Grundlage für chemotaxonomic Werkzeuge, Arten der Gattung Sceletium , basierend auf biochemischen unterscheiden kann Signaturen. Mehrere anatomische Eigenschaften dieser Pflanze machen es eine ideale Probekörper für Blatt Spray MS. Es ist ein saftiges, mit hohen Mengen an Wasser, was vorteilhaft ist, da das Spray ohne die Anwendung eines Lösungsmittels erzeugt werden kann. Sceletium Blatt enthält Idioblasts (Blase-wie Zellen)15 dienen als Speicher-Reserven wo spezialisierte Metaboliten ansammeln können. Blatt-Spray MS ist eine in Vivo Analyse-Technik, pflanzliches Gewebe in einer schnellen Weise zu charakterisieren. Die allgemeine Vorgehensweise gilt für viele Pflanzenarten, Gewebetypen und Klassen von Verbindungen. Techniken, die Informationen über Pflanzenstoffe zu erfassen sind von großem Interesse, primäre und spezialisierte Pflanzenstoffwechsel für menschliche Zwecke der Gesundheit, Ernährung, Landwirtschaft und Energie35zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NSF Plant Genome Research Program Grant IOS-1238812 und Postdoctoral Fellowship in Biologie IOS-1400818 finanziert. Die Arbeit wurde auch durch eine Monsanto Graduate Student Fellowship, Katherine A. Sammons finanziert. Die Fulbright-afrikanische Forscher Scholars Program (2017-2018) ist dankte für Fördermittel zu Nokwanda P. Makunga. Wir schätzen die Spende einer Nanospray Quelle von Jessica Prenni und der Proteomik und Metabolomik-Anlage an der Colorado State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
References
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