Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

Blad spray massespektrometri er en direkte kjemiske analyser teknikk som minimerer eksempel utarbeidelsen og eliminerer Ture, slik at for rask påvisning av små molekyler fra anlegget vev.

Abstract

Plantene produsere tusenvis av små molekyler som er forskjellige i deres kjemiske egenskaper. Massespektrometri (MS) er en kraftfull teknikk for å analysere anlegget metabolitter fordi det gir molekylvekt høy sensitivitet og spesifisitet. Blad spray MS er en ambient ionisering teknikk der anlegget vev brukes for direkte kjemisk analyse via electrospray, eliminere kromatografi fra prosessen. Denne tilnærmingen til prøvetaking metabolitter tillater et bredt spekter av kjemiske klasser kan oppdages samtidig fra intakt anlegget vev, minimere mengden sample preparatet er nødvendig. Når den brukes med en høy oppløsning, nøyaktig masse MS, muliggjør blad spray MS rask påvisning av metabolitter av interesse. Det er også mulig å samle tandem masse fragmentering data med denne teknikken å lette en sammensatt ID. Kombinasjonen av nøyaktig masse målinger og fragmentering er gunstig i bekrefter sammensatte identiteter. Blad spray MS teknikken krever kun mindre modifikasjoner til en nanospray ionization kilde og er en nyttig verktøyet å ytterligere utvide egenskapene til en masse spectrometer. Her, er friske blad vev fra Sceletium tortuosum (Aizoaceae), en tradisjonell medisinsk plante fra Sør-Afrika analysert; mange mesembrine alkaloider oppdages med blad spray MS.

Introduction

Planter inneholder en rekke små molekyler med forskjellige kjemiske egenskaper. MS er en kraftfull teknikk for å analysere anlegget forbindelser fordi den kan gi grunnleggende komposisjoner med høy sensitivitet og spesifisitet av identifikasjon av metabolitter1. Oftest utføres MS på løsemiddel-utpakkede prøver, som er atskilt med kromatografi før MS analyse1. Men bruk av flytende kromatografi (Langbane) krever lengre analyse ganger og er ofte forbundet med en vid prøve forberedelse1. Derimot er direkte kjemiske analyser av intakt vev som omgår kromatografi en svært rask teknikk, krever minimal eksempel forberedelse2. Dermed i tilfeller hvor brukt kromatografiske trinnene kan være forgone kan en direkte kjemisk analyse være svært fordelaktig.

Typisk LC-MS for naturlige produkter og metabolomics forskning er avhengig av lange bulk utdrag av tørket eller frosset plantemateriale som inneholder flere vev og cellen typer3. Alternativt, direkte kjemiske analyser, for eksempel MS påvisning av metabolitter fra anlegget vev, kan isolere celletyper og unngå forberedelse gjenstander4. Blad spray MS, også referert til som vev-spray5,6, er en direkte ambient ionisering MS teknikk, som krever egentlig eksempel forberedelse5,7. Blad spray MS er nært knyttet til papir spray MS, en ambient ionisering teknikk med karakteristikker av electrospray ionization som tillater påvisning av analytter som er avsatt til papir7. Til tross for navnet, blad spray MS gjelder for ulike typer anlegg vev, går ikke bare, og har vært vist på frukt, frø, røtter, blomster vev og knoller, blant annet6,8,9, 10,11,12. Teknikken forenkler ionisering av endogene fytokjemikaliene direkte fra plantemateriale i den masse spectrometer oppdagelsen8. Blad spray MS gir også informasjon om den romlige fordelingen av kjemikalier i ulike vev typer i planter13. Når blad spray MS sammenlignes med løsemiddel utvinning og LC-MS, tyder resultatene blad spray MS gir mulighet for rask påvisning av overflaten metabolitter fra unike typer som trichomes13. Figur 1 illustrerer blad spray MS eksperimentelle set-up. Direkte electrospray ionization oppstår etter kun mindre kilde modifikasjoner. En høy spenning brukes til anlegget vev via en metall klemme, produsere en spray av omfattende dråper danner en Taylor membran som bærer ioner i ion innløpet til MS. Electrospray ionization oppstår fra naturlige væske av anlegget eller den løsemiddel appl IED til anlegget overflaten. En spiss tupp på vev gjør electrospray og kan være naturlig forekommende eller opprettes ved å kutte.

Blad spray MS er en rask metode for kvalitativ og semi kvantitativ analyse av intakt anlegget vev som funnet verktøyet for en rekke applikasjoner. For eksempel er teknikken brukt til å oppdage endogene forbindelser å skille beslektede arter, og til å vurdere endringer i samme art dyrket under ulike forhold. Tidligere studier har vist denne tilnærmingen ved å måle metabolitter i beautyberry (Callicarpa L.) 12 og amerikanske ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. i det siste eksemplet, ginsenosides, aminosyrer og oligosaccharides kan bli oppdaget etter wetting rå ginseng vev. Vill og dyrket amerikanske ginseng var differensiert fra tuber skiver6. Ginseng tuber integritet ble bevart etterfølgende blad spray MS, som tillot en påfølgende morfologiske og mikroskopiske inspeksjon6. Videre kan også eksogene forbindelser på anlegget prøver oppdages. En rekke plantevernmidler (acetamiprid, diphenylamine, imazalil, linuron og thiabendazole) er identifisert på skallet eller masse frukt og grønnsaker9. Mens disse studiene og mange andre har vist verktøyet blad spray MS for ulike bestemte formål, er en detaljert protokoll ikke tidligere rapportert.

Her vil protokollen beskrivelsen ikke fokusere på optimalisering av metoden for en bestemt vev eller sammensatte. Snarere gjenkjenning av mesembrine alkaloider fra Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) brukes som et eksempel for å diskutere de nødvendige optimalisering tiltakene som skal tas når en blad spray MS eksperiment for Art, vev, eller Compound(s) for første gang. S. tortuosum er en saftig endemisk til halvtørre Karroo regionen i Sør-Afrika. En tradisjonell medisin i San og khoikhoi khoikhoi folkeslag, det ble brukt for appetitt og tørst undertrykkelse så vel som for sine psykotrope og smertestillende effekter14,15. Foreløpig brukes standardisert ekstrakter for behandling av nevropsykiatriske og nevropsykologiske lidelser16,17. Den primære forbindelser av interesse inkluderer alkaloidet mesembrine og dets derivater, hvorav mange er også funnet i relaterte Sceletium arter15. Både vill og dyrket populasjoner av S. tortuosum har variabel konsentrasjoner av mesembrine alkaloider, dermed presentere en kvalitetskontroll utfordring18. En metode for rask påvisning av mesembrine alkaloider, som blad spray MS, kan være nyttig i overvåking Sceletium produkter. Fordi det hadde vært noen detaljert visuell eksperimentelle protokoll for blad spray MS teknikk, vi vil illustrere metoden vi bruker eksemplet med S. tortuosumog følgende er beskrevet tidligere: endring av en nanospray kilde, den valg og utarbeidelse av anlegget vev, oppkjøpet av dataene, tolkningen av resultatene, og optimalisering av parameterne MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. endringer av Nanospray kilde for blad Spray MS

  1. Bruke en endret nanospray kilde for blad spray MS. Ingen fluidic komponenter er obligatoriske for blad spray MS, kan du endre kilden ved å fjerne LC sonden fra kilden.
  2. Samle blad spray MS ledningen som gjelder spenningen til anlegget vev med riktig pin for koble til kilden. Loddetinn pin til den ene enden av en isolert wire; lodde en klemme til den motsatte enden av ledningen.
    Merk: Klemme (alligator klipp type) kan eller kan ha ikke tenner. For liten vev er en klemme uten tenner foretrukket. En valgfri flex arm med en klemme kan legges til nanospray kilden å bistå i posisjoneringen anlegget vevet. Merk at denne protokollen spesielt beskriver hvordan du utfører blad spray MS på en hybrid quadrupole ion felle masse analysator MS systemet (se Tabellen for materiale); andre MS-systemer kan imidlertid endres for å utføre denne teknikken6. Kopling blad spray kan MS med en bærbar masse spectrometer sanntid kjemisk analyse utføres på stedet uten behovet å transportere plantemateriale til laboratoriet19,20.
  3. Plasser en antistatisk gulvmatte på gulvet under kilden å redusere den elektrisk utladning som kan oppstå fra kilden ved høye spenninger.

2. forberedelse av MS til Leaf Spray MS

  1. Hvis systemet har nylig vært i bruk, la det avkjøles å ta og fjerne eventuelle alternative kilde og feie membran. Fest nanospray blad spray MS kilden.
  2. Opprette en melodi fil med riktig ioniseringen parametere slik: skjede, Aux og feie gass til 0. spray spenningen til 2-5 kV; kapillær temperaturen til 150-250 ° C; og S-linse RF nivået til 50. Lagre filen melodi med den ønskede parametre8,13. Optimalisere spenning og temperatur for den beste ioniseringen av vev og compound(s) rundt.
    Merk: Godt utgangspunkt er 4 kV og 200 ° C.
  3. Opprette et metoden inkludert blad spray MS melodi med: positive og negative full MS; en oppløsning på 70.000; en AGC mål 1 x 106. maksimum av 200 ms; og den ønskede skann m/z. Alternativt bruke bare 1 polaritet.

3. forberedelse Instrument, løsemidler og plante vev

Merk: Alltid bruke hansker, og bruker ikke plante vev som er behandlet med bare hendene. Ellers vil miljøgifter ioner som polyetylenglykol dominere til spectra.

  1. Bringe anlegget vev for analyse til samme rom som MS systemet tillater en rask prøvetaking.
  2. Anlegget vev som ikke har en naturlig spiss tupp, bruke et barberblad på et glass lysbilde for å kutte en konisk punktet (figur 2). Bestemme mengden av vev behov for analyse basert på instrumentet følsomhet, vev type og compound(s) av interesse (f.eksen ung S. tortuosum blad dvs ~ 5 mm i lengde).
    1. Kutt S. tortuosum blader på 10 uker etter spiring i tynne strimler, hver med en konisk slutt til et punkt.
  3. Bruk tang til å forsiktig velge anlegget vev på slutten som vil være festet. Nøye holder vevet med tang, overføre det til klemmen.
    FORSIKTIG: Berør ikke hvor apparatet hvis spenning på.
  4. Justere fleksible armen og ledningen med klemme å plassere vevet i tråd med MS innløp slik at avstanden mellom anlegget vevet og ion mengden av MS er 5-10 mm for de tre quadrupole (f.eksTSQ) og lineær felle quadrupole (LTQ) og 10 -50 mm for ion felle masse analyzer (f.eks, orbitrap)8.
    1. Plugg den motsatte enden av ledningen inn i kilden. Hvis de første forsøkene produsere en lav signalstyrke intensitet, flytter anlegget vevet nærmere i ion innløpet (se diskusjon for optimalisering).
  5. Laste filen metoden; navnet datafilen og angir plasseringen til lagring. Deretter slår på MS systemet ved spille og klikk på Start for å starte henter.
  6. Bruke et løsemiddel (f.eks, metanol) bruke en Pipetter med gel-lasting tips for å maksimere avstanden mellom hendene og høy spenning å beskytte brukeren.
    Merk: Løsemiddel volumet nødvendig avhengig av størrelse, tørrhet og tekstur av vev, ~ 2-20 µL. S. tortuosum blader krever vanligvis ikke løsemidler som skal legges til. Forsiktig bruk løsemiddelet og ikke ta apparatet kilden når spenningen er på. Bruk LC-MS klasse løsemidler og glass som er acid vasket, uten vaskemidler. I noen vev, kan et signal sees uten tilsetning av et løsemiddel på grunn av naturlig vanninnholdet av anlegget vev. Imidlertid er en større signal intensitet og redusert S/N vanligvis oppnås ved å bruke et løsemiddel til vev.
  7. Hente data som signalet vedvarer eller til til tilstrekkelig spectra har blitt samlet, vanligvis 30-60 s. Om nødvendig bruke ekstra løsningsmiddel for å opprettholde en høy signal intensitet for en lengre tid. Stoppe datainnsamling og pause MS systemet.
  8. Fjerne vevet og vask klemmen med 100% metanol og en lofri tørke. Rengjør MS ion innløp etter ca 1-2 h for anskaffelsen av blad spray MS etter leverandørens spesifikasjoner. Også rengjøre MS ion innløp mellom analyser av ulike vev.

4. dataene kvalitetsvurdering

  1. Åpne datafilen og visuelt inspisere base peak masse chronogram. Kontroller at signalet intensiteten ~1.0 x 107 5.0 x 108. Hvis signalet er lavere, flytte vevet nærmere i ion innløpet. Hvis høyere, frontprogram MS systemet blir skitten, så Flytt vevet videre fra ion innløpet.
  2. Basert på tilstedeværelse eller fravær av ioner interesse til masse spectra produsert, endre parametere.
    Merk: Protokollen kan pauses her.

5. tandem masse fragmentering

  1. Bestemme hva ioner er av interesse for tandem masse fragmentering (MS/MS); en masse spectra signal som er > 1.0 x 105 er tilstrekkelig for utvalget av ioner for MS-/ MS.
  2. Lage en ny metode-fil med en inkluderingsliste m/z ut til 4 desimaler. Klikk på globale lister og inkludering. Under Egenskaper for PRM, velger fragmentering energi [f.eksnormalisert kollisjon energi (NCE) 30-50 er et godt utvalg med] og andre MS-/ MS parametere.
    1. For å få MS-/ MS dataene for mesembrine alkaloider, fragmentere de følgende ionene, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zog 292.1897 m/z, på NCE 35.
      Merk: MS-/ MS datainnsamling kan utføres umiddelbart etter MS eller senere. Samme vev kan ofte være festet etter en full MS og kan gjenbrukes for å skaffe MS-/ MS data. Hvis en respraying ikke gir et tilstrekkelig signal, bruke en ny vev.
  3. Last filen MS-/ MS metode og en navngitt datafil. Slå på MS systemet, og start henter, legge til et løsemiddel om nødvendig. Når tilstrekkelig spectra har blitt samlet, vanligvis etter 30-60 s, stoppe oppkjøpet.
  4. Samle mange ulike energier fragmentering tilordne fragment ioner.
    Merk: Siden blad spray MS mangler en brukt kromatografiske separasjon, fragmentering spectra er sannsynlig å inneholde mange ioner, og fragmentering på ulike energier vil bidra til å bringe klarhet.

6. antatte identifikasjoner av nøyaktig masse og Tandem masse fragmentering

  1. Gjør antatte identifikasjoner av refererer nøyaktig masse målinger fra offentlig tilgjengelige metabolitten databaser som Metlin21, menneskelige Metabolome Database22, masse Bank23, Lipid kart24, National Institute of Standarder og teknologi MS søke25, respekt for fytokjemikaliene26eller GNPS27.
  2. Som disse databasene ikke er uttømmende, kan du utføre en ytterligere gjennomgang på plantearter kjemisk karakterisert som nødvendig.
  3. Match fragmentering ioner fra blad spray MS-/ MS nevnte databasene når MS-/ MS informasjon eller litteratur. Alternativt bruke en manuell tolkning av MS-/ MS fragment ioner eller en fragmentering av en autentisk standard utført av direkte injeksjon eller LC--MS-/ MS.

7. dataanalyse

  1. Konvertere MS råfiler til mzXML filer med verktøyet msConvert fra Proteowizard28.
  2. Bruk XCMS programvarepakken implementert i R for topp plukking. Bruke en direkte infusjon behandling metode for blad spray MS analyse.
    Merk: Godt kommentert skript brukes for databehandling kan finnes på https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. For å få semi kvantitative normalisere mål, regnskap for eksperimentell variasjon, intensiteten av hver metabolitten av den totale ion gjeldende (TIC), som blad spray MS signal intensitet kan variere, delvis på grunn av små variasjoner i plasseringen av bladet i kilden og forskjellene i bladet form og størrelse.
  4. Alternativt, bruk leverandøren programvare for dataanalyse eller MZmine2 (å bli funnet på http://mzmine.github.io/)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

10 uker etter spiring, fersk samlet drivhus dyrket S. tortuosum blader ble analysert av blad spray MS. Eksperimentell arbeidsflyten for å oppdage metabolitter fra S. tortuosum forlater bruke blad spray MS er illustrert i figur 2. Et blad ble valgt, skåret i en tynn stripe med en konisk slutt til et punkt og festet med blad spray MS wire klemme apparater. Anlegget vevet ble plassert ~ 30 mm fra ion inntaket og i tråd med x- og y-akser. Ved oppstart av blad spray MS av S. tortuosum blader, oppdaget ioner uten løsemiddel programmer. Planter i Sceletium familien er sukkulenter med tykke blader med høyt vanninnhold som gjør electrospray ionization av blad spray MS uten ekstern bruk av et løsemiddel. Men mest vanligvis krever anlegget vev et løsemiddel program å oppdage ioner.

En masse chronogram og masse spektra tett befolket med ioner ble produsert etter 30 s oppkjøpet i positiv ionisering modus (Figur 3). Chronogram representerer en vellykket blad spray MS eksperiment der et stabilt signal ble opprettholdt for hele varigheten av oppkjøpet. I denne studien preget totalt ni mesembrine alkaloider ble oppdaget av blad spray MS og antatte IDer ble gjort nøyaktig masse protonerte ioner av tidligere forbindelser (tabell 1)30. Det er fordelaktig å utføre blad spray MS på en høy oppløsning, nøyaktig-masse (HRAM) masse spectrometer, som gjør det mulig å løse litt forskjellige massene. For eksempel m/z på 262.1794 kan bli åpenbart identifisert som dihydrojoubertiamine i stedet for mesembrenone-m (demethyl - dihydro-), som ville ha vært på m/z 262.1443.

Blad vevet forble festet for en tandem masse (MS-/ MS) fragmentering av noen ioner rundt (tabell 1). Figur 4 viser tre eksempler på MS-/ MS fragmentering spectra fra blad spray MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zog 292.1897 m/z. Antatte identitet ble bekreftet av masse fragmenter og bekreftet med tidligere identifisert fragmenter30. Protonerte ion 276.1583 m/z ble identifisert som to forskjellige en mesembrine-M (demethyl) og en annen to isomerene mesembrenone-m av diagnostiske fragmenter for hver isomer (tabell 1).

Både mesembrine og mesembrine-M (dihydro-) ble oppdaget av blad spray MS og åpenbart identifisert nøyaktig masse og masse fragmentering. Protonerte ion av mesembrine på 290.1742 m/z er en av de rikeste ionene i spekteret; Det kan derfor være en sannsynlig kandidat som en biomarkør for framtidige studier. De to viktigste alkaloider av S. tortuosum er mesembrine og mesembrenone, begge ble lett oppdaget av blad spray MS. Flere av forbindelsene oppdaget av blad spray MS kan være nyttig for overvåking av plantemateriale Sceletium og avledede produkter.

Figure 1
Figur 1: Leaf spray MS diagram av oppsett. Blad spray MS er en metabolitten profilering metode som gir mulighet for rask prøvetaking av intakt anlegget vev. Diagrammet viser blad spray MS med kV høy spenning angitt med en klemme og muligheten til å bruke et løsemiddel til anlegget vev. Blad spray MS forenkler electrospray ionization direkte fra anlegget vevet i MS innløpet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: arbeidsflyt blad spray MS eksperimentere. Valgte anlegget vev, en Sceletium tortuosum blad, var kuttet, så overføres med tang festet, og deretter plassert foran ion innløp før datainnsamling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Metabolitten profilering av Sceletium tortuosum av blad spray MS med positiv ionisering. (A) dette panelet viser blad spray MS totale ion teller (TIC) masse chronogram. For hver topp, topp nummeret tid (min) og bunnen er m/z. (B) dette panelet viser blad spray MS metabolitten profil av en Sceletium tortuosum positive masse spektrum. Rammemargen viser 260-295 m/z. Nøyaktig massene er rapportert til 4 desimaler med en feil < 6 ppm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Leaf spray MS positiv ionisering tandem masse spectra fra Sceletium tortuosum kuttet blad. Disse skjermbildene viser tandem masse spectra (MS-/ MS) samlet i positiv ionisering modus med blad spray MS. Putative identifikasjoner av alkaloider foretas nøyaktig masse og masse fragmentering for følgende: (A) mesembrine-M og mesembrenone-M isomerene, (B) mesembrine og (C) mesembrine-M (dihydro-). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte Molekylære formel Målt Monoisotopic masse m/z [M + H] ppm feil Fragmenter
Dihydrojoubertiamine C16H23ingen2 262.1794 5.0 I/T
Mesembrenone-M (O - demethyl-) C16H19ingen3 274.1431 4.5 I/T
Mesembrine-M (O - demethyl-) C16H21ingen3 276.1583 5.9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - demethyl-) C16H21ingen3 276.1583 5.9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-demethyl - dihydro-) C16H21ingen3 276.1583 5.9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-demethyl - dihydro-) C16H21ingen3 276.1583 5.9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone C17H21ingen3 288.1587 4.3 124 151 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine C17H23ingen3 290.1742 4.9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (dihydro-) C17H25ingen3 292.1897 5.2 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274

Tabell 1: antatte identifikasjoner av Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider av blad spray MS. Denne tabellen rapporter om positiv ionisering nøyaktig massene og fragment alternativer for Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vellykket bruk av denne protokollen er avhengig av optimalisering av trinnene for de plantearter, vev og målet compound(s) rundt. Parameterne som beskrives i protokollen gir et godt utgangspunkt. Følgende eksperimentelle avgjørelser må gjøres og testet: hvorvidt bruk (1) kutt eller uncut vev og (2) løsemiddel eller ingen løsemiddel, (3) hva løsemiddel bruke og hva volum, (4) hva avstanden av ion innløp bør være , og (5) spenning amplitude. Målet med optimering er å finne betingelsene som oppretter et kontinuerlig signal som vedvarer minst 30 å få minutter. Betingelsene skal gi en tilstrekkelig og reproduserbar signal intensitet, som kreves for å utføre nøyaktige masse og MS-/ MS målinger. Høy signal intensitet oppnås via en vellykket og pålitelig spray ioner fra vevet. Spray kvaliteten er avhengig av skarpheten på spissen av vevet peker mot ion innløp, avstanden mellom spissen av vev og ion innløp og elektrisk spenning anvendes. En vellykket spray er svært avhengig av skarpheten på poenget med vev spissen, og i noen tilfeller vevet bør kuttes for å danne en spiss tupp. Spesielt endringer i skarpheten av vinkelen på konisk form på spissen av kutt vev har signifikant effekt på den resulterende kvaliteten på ionisering og signal intensiteten produserte7. I tilfeller der vev er allerede pekte er ikke kutte nødvendig, som er tilfellet med gress blader eller lancet-formede blader5,13.

Et ion signal kan undertrykkes og ustabilt når plasma utslipp oppstår fra vevet som følge av å være plassert for nær ion innløp eller elektriske spenningen blir for høy. En riktig plassering av vev og et utvalg av elektrisk spenning er nødvendig for å sikre en stabil og konsekvent spray mellom eksempler. Avstanden av vev fra MS ion inntaket også påvirker kvaliteten og kvantiteten av signal produsert. Generelt, plasseres en mindre Vevsprøve nærmere innløp, selv om lite vev ikke resulterer i en lav signalstyrke intensitet hvis spissen er ekstremt pekte eller forbindelser er svært konsentrert. Intensiteten og konsistensen av spectra skal optimaliseres empirisk ved å sammenligne flere plasseringer stillinger langs z-aksen. Det er avgjørende for en egnet ionisering at anlegget vevet etter MS ion brytningsrate i både x- og y-akser. Men hvis anlegget vevet er urimelig nær ion innløp, kan dette krever en hyppig rengjøring ion optikk og fronten av MS.

Volumet av løsemidler brukes på vevet kan variere fra 0 - 50µL avhengig av vanninnholdet og størrelsen på Vevsprøve. I tilfeller der vev er svært høy i vanninnholdet og er kuttet, som i tilfelle av saftig Sceletium, kan ingen løsemiddel legges. Det er imidlertid mer vanlig å bruke minst 5-10 µL løsemiddel for minst ett program. Tillegg av et løsemiddel er nødvendig når du bruker en tørket vev eller ferskt vev med et lavt vanninnhold for å lette spray. Hvis en liten mengde løsemiddel brukes på et stort stykke av plantemateriale, vil det trolig bli absorbert uten å produsere en tilstrekkelig spray. Omvendt, hvis det brukes for høy et volum, forbindelser kan fortynnes eller riktig desolvation lett og effektivt skjer ikke. Et alternativ til manuelt pipettering løsemiddel er kontinuerlig bruke løsemiddel til vev via en sprøytepumpe slik at de observerte signal henfall som funksjon av tiden som sammensatt er oppbrukt fra plante materiale10. Ulike typer løsemidler bør prøvd, og de resulterende spectra sammenlignet bekrefte noen forbedring av antallet og konsistensen av ion(s) for compound(s) av interesse. Tillegg av et løsemiddel ikke bare produserer spray, men gir også en selektivitet for utvinning av ulike forbindelser. Organiske løsemidler med forskjellige polariteter (metanol, diklormetan, hexanes, acetonitrile, kloroform og aceton) har blitt sammenlignet og resultere i betydelig forskjellige ioner finnes i til spectra fra peanut frø8. Generelt, er metanol et godt første løsemiddel valg, som det har vist seg å fungere godt for mange plante vev og en rekke fytokjemikaliene, inkludert aminosyrer, alkaloider, flavonols, karbohydrater, organiske syrer, fettsyrer og fosfolipider8. Anvendelsen av 100% vann til uncut anlegget vev vanligvis fungerer ikke godt, men kan bli bedre med tillegg av salter10. I mange tilfeller, i tillegg til protonerte ioner av et sammensatt, andre rikelig addukter oppdages som natrium og kalium addukter. Tilstedeværelsen av disse salt addukter er enda mer utbredt når salt legges til løsemiddelet og kan være fordelaktig. For eksempel ble en økt følsomhet og selektivitet av fenoliske glykosider fra Populus arter observert med tillegg av natrium og kalium ioner til anvendt løsemiddel10.

To store begrensninger av blad spray MS teknikk er (1) lavt dynamisk område og (2) utfordringer med kvantifisering. Vanligvis er bare de mest tallrike forbindelsene ionisert og oppdaget av teknikken. Nedgang i ionisering effektiviteten på grunn av ion undertrykkelse som oppstår dramatisk i fravær av brukt kromatografiske separasjon er mindre av et problem med rikelig metabolitter. For å omgå denne begrensningen, kan skanneområde justeres å fokusere på bare m/z området rundt. Men registreres lav-overflod forbindelser fortsatt ikke uten separasjon og konsentrasjonen av kromatografi. I motsetning til typisk kvantifisering av forbindelser fra et utdrag, interne standarder kan ikke være riktig blandet inn plantemateriale før blad spray MS. Semi-quantitative mål og relative konsentrasjoner er anskaffet ved å plassere en kjent konsentrasjonen av en standard løsning på vevet overflaten og deretter la det tørke før bladet spray MS analyse8,9,31. For eksempel ble kvantifisering standard tillegg metoden brukt til å beregne forholdet mellom representant ion for interne standarden ion av interesse å bestemme relative antallene32. En kalibreringskurven ble brukt til å beregne relative konsentrasjonen. Bruker denne metoden, var det mulig å sammenligne forholdet mellom de ulike glykosider til en intern standard, rebaudioside D, og den relative konsentrasjonen av bestemte glykosider kan deretter beregne i Stevia blader33. Alternativt er en mer nøyaktig kvantifisering mulig med en isotopically merket standard av sammensatt interesse, men kommersiell tilgjengelighet kan være en utfordring. Bruken av metabolically merket anlegget vev kan også forbedre kvantifisering med denne metoden34.

Gitt at konvensjonelle LC-MS/MS krever en omfattende utvalg forberedelse og brukt kromatografiske separasjon, er andre metoder for analyse ofte ønsket. Blad spray MS er en direkte kjemiske analyser teknikk som lett kan brukes og tilbyr enkelhet, presisjon, nøyaktighet og rask metabolitten gjenkjenning og semi kvantifisering. Av denne grunn undersøkt vi hensiktsmessigheten av blad spray MS overvåke det kjemiske innholdet av S. tortuosum, som kan gi grunnlag for chemotaxonomic verktøy å skille arter av slekten Sceletium basert på biokjemiske signaturer. Flere Anatomiske egenskaper av dette anlegget gjør det en ideell test-prøven for blad spray MS. Det er en saftig, som inneholder store mengder vann, som er en fordel som spray kan genereres uten bruk av et løsemiddel. Sceletium blad inneholder idioblasts (blæren-lignende celler)15 som fungerer som lagring reserver hvor spesialiserte metabolitter kan akkumuleres. Blad spray MS er en i vivo analyse teknikk å karakterisere anlegget vev på en rask måte. De generelle teknikken gjelder mange plantearter, vev typer og klasser av forbindelser. Teknikker som fange informasjon om anlegget forbindelser er av stor interesse å forstå anlegget primære og spesialiserte stoffskiftet for menneskelig bruk av helse, ernæring, landbruk og energi35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NSF anlegget Genome Research Program stipendet IOS-1238812 og postdoktorstipend i biologi IOS-1400818. Arbeidet ble også finansiert av en Monsanto Graduate Student fellesskap til Katherine A. Sammons. Den Fulbright afrikanske forsker Scholars Program (2017-2018) er takket for finansiering tildelt Nokwanda P. Makunga. Vi setter stor pris på donasjon av en nanospray kilde fra Jessica Prenni og Proteomikk og Metabolomics anlegget ved Colorado State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 136 Leaf spray MS massespektrometri electrospray ionization ambient ionisering Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider naturlige produkter plante metabolitter små molekyler
Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter