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Biochemistry

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire est une technique d’analyse chimique directe qui minimise la préparation de l’échantillon et élimine la chromatographie, permettant la détection rapide de petites molécules de tissus végétaux.

Abstract

Les plantes produisent des milliers de petites molécules qui sont différentes dans leurs propriétés chimiques. Spectrométrie de masse (MS) est une technique puissante pour l’analyse des métabolites végétaux car il fournit des poids moléculaires avec une spécificité et une sensibilité élevée. Pulvérisation foliaire MS est une technique d’ionisation ambiant où tissu végétal est utilisé pour l’analyse chimique directe via electrospray, éliminant la chromatographie du processus. Cette approche d’échantillonnage des métabolites permet un large éventail de classes chimiques de détecter simultanément des tissus végétaux intacts, minimisant la quantité de préparation de l’échantillon nécessaire. Lorsqu’il est utilisé avec une MS de masse à haute résolution, précise, pulvérisation foliaire MS facilite la détection rapide des métabolites d’intérêt. Il est également possible de recueillir des données de la fragmentation de masse en tandem avec cette technique pour faciliter une identification composée. La combinaison de mesures précises de masse et de la fragmentation est bénéfique à confirmer les identités composées. La pulvérisation foliaire technique MS nécessite seulement des modifications mineures à une source d’ionisation de tuyères et est un outil utile pour accroître les capacités d’un spectromètre de masse. Ici, les tissus de la feuille fraîche de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), une plante médicinale traditionnelle d’Afrique du Sud, sont analysée ; nombreux alcaloïdes mesembrine sont détectés avec une pulvérisation foliaire MS.

Introduction

Les plantes contiennent un large éventail de petites molécules ayant des propriétés chimiques différentes. MS est une technique puissante pour l’analyse de composés végétaux parce qu’elle peut offrir des compositions élémentaires avec une grande sensibilité et une spécificité pour la détection et l’identification des métabolites1. Le plus souvent, MS est effectuée sur les échantillons extraits au solvant, qui sont séparés par chromatographie en phase avant l’analyse MS1. Cependant, l’utilisation de la chromatographie liquide (LC) nécessite fois longue analyse et est souvent associée à un vaste échantillon préparation1. En revanche, l’analyse chimique directe des tissus intacts qui contourne la chromatographie est une technique très rapide, nécessitant un minimum d’échantillon préparation2. Ainsi, dans les cas où des mesures chromatographiques peuvent être abandonnées, une analyse chimique directe peut être très avantageuse.

Typique LC-MS pour la recherche de produits et de la métabolomique naturelle s’appuie sur les extractions longues en vrac de matériaux végétaux séchés ou surgelés contenant plusieurs tissus et cellules types3. Sinon, analyse chimique directe, telles que la détection de MS des métabolites du tissu végétal, peut isoler les types de cellules et éviter les artefacts de préparation4. Pulvérisation foliaire MS, également dénommée tissu-spray5,6, est une technique d’ionisation ambiant direct MS, qui requiert essentiellement aucun échantillon préparation5,7. Pulvérisation foliaire que MS est étroitement liée au jet de papier MS, une technique d’ionisation ambiant avec caractéristiques d’ionisation par électronébulisation qui permet la détection des analytes qui sont déposés sur papier,7. Malgré son nom, pulvérisation foliaire MS est applicable à différents types de tissus végétaux, laisse pas juste et a été démontrée sur les fruits, graines, racines, les tissus floraux et tubercules, entre autres,6,8,9, 10,11,12. La technique facilite l’ionisation du endogène phytochimiques directement à partir des matières végétales dans le spectromètre de masse pour détection8. Pulvérisation foliaire MS peut également fournir des informations sur la distribution spatiale des produits chimiques dans les types de tissus différents en plantes13. Lorsque la pulvérisation foliaire MS est comparée à l’extraction par solvant et LC-MS, les résultats suggèrent de pulvérisation foliaire que MS permet une détection rapide des métabolites surfaces de types de cellules uniques tels que les trichomes13. La figure 1 illustre le montage expérimental de MS pulvérisation foliaire. Ionisation par électronébulisation directe se produit après que des modifications mineures de source. Une tension élevée est appliquée pour les tissus végétaux par un collier métallique, produisant une pulvérisation de gouttelettes survoltées, formant un cône de Taylor qui transporte les ions à l’entrée d’ion de la Mme Electrospray Ionisation se produit dans le liquide naturel de la plante ou de l’appl solvant EEI à la surface de la plante. Un embout pointu sur le tissu facilite l’électrospray et peut être naturellement naturels ou créés par la coupe.

Pulvérisation foliaire MS est une méthode rapide pour l’analyse qualitative et semi quantitative des tissus végétaux intacts qui ont trouvé l’utilitaire pour une grande variété d’applications. Par exemple, la technique a été utilisée pour détecter des composés endogènes pour distinguer les espèces apparentées et même d’évaluer les changements dans la même espèce cultivée dans des conditions différentes. Des études antérieures ont montré cette approche en mesurant les métabolites dans Callicarpe (Callicarpa L.) 12 et ginseng américain (Panax quinquefolium L.) 6. dans le dernier exemple, ginsenosides, des acides aminés et oligosaccharides pourraient être détectés après mouillage tissu brut ginseng. Ginseng américain sauvage et cultivé ont été dissociés du tubercule tranches6. Le ginseng tuber intégrité a été préservée succédant pulvérisation foliaire MS, permettant une inspection morphologique et microscopique ultérieure6. En outre, les composés exogènes sur des échantillons de plantes peuvent également être détectés. Un certain nombre de pesticides (acétamipride, diphénylamine, imazalil, linuron et thiabendazole) ont été détecté sur peel ou pulpe de fruits et légumes9. Alors que ces études et beaucoup d’autres ont montré l’utilité de pulvérisation foliaire MS à diverses fins spécifiques, un protocole détaillé n’a pas été précédemment signalé.

Ici, la description de protocole ne se concentrera pas sur l’optimisation de la méthode pour un tissu spécifique ou composé. Plutôt, la détection des alcaloïdes mesembrine de Sceletium tortuosum (L.) n.e.br. (Aizoaceae) est utilisée à titre d’exemple pour discuter des mesures d’optimisation nécessaires qui doivent être prises lorsque vous configurez une expérience de MS pulvérisation foliaire pour une espèce, tissu, ou composés pour la première fois. S. tortuosum est une succulente endémiques à la région semi-aride de klkkfj d’Afrique du Sud. Un remède traditionnel du San et Khoi Khoi peoples, on l’utilisait pour suppression appétit et la soif ainsi que pour ses effets psychotropes et analgésique14,15. Actuellement, les extraits normalisés sont utilisés pour le traitement des troubles neuropsychiatriques et neuropsychologiques16,17. Les composés primaires d’intérêt incluent l’alcaloïde mesembrine et ses dérivés, dont beaucoup se trouvent aussi dans connexes Sceletium espèces15. Les populations sauvages et cultivées de S. tortuosum ont des concentrations variables d’alcaloïdes mesembrine, présentant ainsi un contrôle de la qualité défi18. Une méthode pour la détection rapide des alcaloïdes mesembrine, comme la pulvérisation foliaire MS, peut-être être utile pour la surveillance des produits de Sceletium . Car auparavant, il n’y avait eu aucun protocole d’essai visuel détaillé pour la pulvérisation foliaire technique MS, Nous illustrerons la méthode à l’aide de l’exemple de S. tortuosumet décrit ce qui suit : la modification d’une source de tuyères, les sélection et préparation des tissus végétaux, l’acquisition des données, l’interprétation des résultats et l’optimisation des paramètres du MS.

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Protocol

1. les modifications à la Source de tuyères pour vantail pulvériser MS

  1. Utiliser une source de tuyères modifiés pour pulvérisation foliaire MS. Comme aucun composant fluidique est nécessaire pour la pulvérisation foliaire MS, modifiez la source en retirant la sonde LC de la source.
  2. Assembler le fil de MS pulvérisation foliaire qui s’applique à la tension pour les tissus végétaux avec la goupille appropriée pour brancher à la source. Souder les broches à une extrémité d’un fil isolé ; une pince à l’extrémité opposée du fil à souder.
    Remarque : La pince (alligator clip type) peut ou peut ne pas avoir de dents. Pour les petits tissus, une pince sans dents est préférée. Un bras flex en option avec une pince peut être ajouté à la source de tuyères pour aider à positionner le tissu de la plante. Remarque que ce protocole décrit plus précisément comment effectuer la pulvérisation foliaire MS sur un analyseur masse piège ionique quadripolaire hybride MS système (voir la Table des matières) ; Cependant, les autres systèmes MS peuvent être modifiées pour effectuer cette technique6. Pulvérisation foliaire de couplage MS avec une analyse chimique en temps réel portable spectromètre de masse peuvent être effectuées sur place sans avoir à transporter le matériel végétal au laboratoire19,20.
  3. Placez un tapis protecteur antistatique sur l’étage inférieur de la source pour réduire la décharge électrique qui peut-être résulter de la source lors de l’utilisation des hautes tensions.

2. préparation du système MS MS pulvérisation foliaire

  1. Si le système a été récemment utilisé, laissez-le refroidir au toucher et supprimer n’importe quelle source alternative et le cône de balayage. Attachez la source de MS de pulvérisation de feuille tuyères.
  2. Créez un fichier de musique avec les paramètres appropriés d’ionisation définies comme suit : gaine, auxiliaire et le gaz de balayage à 0 ; la tension de pulvérisation de 2 à 5 kV ; la température capillaire à 150-250 ° C ; et le niveau de RF S-objectif à 50. Enregistrez le fichier de musique avec les paramètres désirés8,13. Optimiser la tension et la température pour la meilleure ionisation des tissus et des composés d’intérêt.
    Remarque : Les bons points de départ sont 4 kV et 200 ° C.
  3. Faire un fichier de méthode, y compris le fichier d’air spray MS feuille avec : MS pleine positives et négatives ; une résolution de 70 000 ; une cible d’AGC de 1 x 10-6; un maximum de 200 ms ; et la gamme de numérisation souhaitée m/z. Alternativement, utiliser seulement 1 polarité.

3. préparation de l’Instrument, des solvants et des tissus végétaux

Remarque : Toujours porter des gants et n’utilisez pas de tissu de la plante qui a été manipulé à mains nues. Dans le cas contraire, les ions de contaminants comme le polyéthylène glycol dominera les spectres.

  1. Apporter les tissus végétaux pour l’analyse de la même pièce que le système de SM pour permettre un échantillonnage rapid.
  2. Pour les tissus végétaux qui n’ont pas une pointe naturellement, utiliser une lame de rasoir sur une lame de verre pour couper un point conique (Figure 2). Déterminer la quantité de tissu nécessaire à l’analyse fondée sur la sensibilité de l’instrument, type de tissu et composés d’intérêt (p. ex., un jeune S. tortuosum feuille d’environ 5 mm de longueur).
    1. Coupe S. tortuosum quitte à 10 semaines après la germination en fines lanières, chacune avec une extrémité effilée pour former un point.
  3. Forceps permet de sélectionner doucement le tissu de la plante à la fin qui est ancrée. Tenant le tissu avec une pince, soigneusement les transférer dans la pince.
    ATTENTION : Ne touchez pas la source de l’instrument si la tension est activé.
  4. Ajuster le bras flexible et le fil avec la pince pour positionner le tissu conforme à l’entrée du MS afin que la distance entre le tissu de la plante et l’entrée d’ion de la MS est de 5-10 mm pour le triple quadripôle (p. ex., TSQ) et linéaire piège quadripolaire (LTQ) et 10 -50 mm pour le piège à ions analyseur de masse (p. ex., Orbitrap valant)8.
    1. Branchez l’autre extrémité du fil à la source. Si les premières tentatives de produire une intensité de signal faible, déplacer les tissus végétaux plus près à l’entrée d’ions (se reporter à la Discussion pour l’optimisation).
  5. Chargez le fichier méthode ; Nommez le fichier de données et définissez l’emplacement de stockage du fichier. Allumez le système SM en cliquant sur Play , puis cliquez sur Démarrer pour commencer l’acquisition de données.
  6. Appliquer un solvant (p. ex., méthanol) à l’aide d’une pipette avec une pointe de gel de chargement afin de maximiser la distance entre les mains et la haute tension pour protéger l’utilisateur.
    Remarque : Le volume de solvant nécessaire dépend de la taille, la sécheresse et la texture du tissu, généralement ~ 2-20 µL. S. tortuosum feuilles ne nécessitent pas un solvant quelconque à ajouter. Appliquer soigneusement le solvant et ne touchez pas la source de l’instrument lorsque la tension est allumé. Utiliser des solvants grade LC-MS et la verrerie qui a été lavé l’acide et est exempt de détergents. Dans certains tissus, on peut observer un signal sans l’ajout d’un solvant en raison de la teneur en eau naturelle du tissu végétal. Toutefois, une plus grande intensité de signal et réduit S/N est généralement obtenue en appliquant un solvant sur le tissu.
  7. Acquisition de données tant que persiste le signal ou jusqu'à ce que les spectres suffisantes ont été recueillies, généralement de 30 à 60 s. Si nécessaire, appliquer des solvants supplémentaires afin de maintenir une intensité de signal élevé pour une plus longue durée. Arrêter la collecte de données et mettre en pause le système SM.
  8. Enlever le tissu et laver la pince avec 100 % de méthanol et d’un chiffon non pelucheux. Nettoyer l’entrée d’ion MS après environ 1-2 h de l’acquisition par pulvérisation foliaire MS selon les spécifications du fournisseur. En outre, nettoyer l’entrée d’ions MS entre les analyses des types de tissus différents.

4. évaluation de la qualité de données

  1. Ouvrez le fichier de données et inspecter visuellement le chronogramme de masse pic de base. Vérifier que l’intensité du signal est ~1.0 x 107 à 5,0 x 108. Si le signal est plus faible, déplacer le tissu de plus près à l’entrée d’ions. Si plus haut, l’extrémité avant du système MS se sale, donc passer le tissu plus éloigné de l’entrée de l’ion.
  2. Basé sur la présence ou l’absence des ions d’intérêt dans les spectres de masse produit, modifier les paramètres.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

5. Fragmentation de masse en tandem

  1. Décider quels ions sont d’intérêt pour la fragmentation de masse en tandem (MS/MS) ; un signal de spectres de masse qui est > 1,0 x 105 est suffisant pour la sélection des ions pour MS/MS.
  2. Faire un nouveau fichier de méthode avec une liste d’inclusion de m/z à 4 décimales. Cliquez sur listes globales et l’Inclusion. Sous Propriétés du PRM, sélectionnez l’énergie de fragmentation [p. ex., énergie de collision normalisée (RCE) de 30-50 est une bonne gamme d’abord] et d’autres paramètres de MS/MS.
    1. Pour obtenir des données de MS/MS pour les alcaloïdes mesembrine, fragmenter les ions suivantes, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zet de 292.1897 m/z, 35 NCE.
      Remarque : L’acquisition de données de MS/MS peut être effectuée immédiatement après la MS ou à une date ultérieure. Le même tissu peut souvent rester fixé après une MS complet et peut être réutilisé pour acquérir des données de SM/SM. Toutefois, si un pulvérisées ne fournit pas un signal suffisant, utilisez un nouveau tissu.
  3. Charger le fichier de méthode MS/MS et un fichier de données nommé. Allumez le système MS et commencer à acquérir des données, en ajoutant un solvant si nécessaire. Quand les spectres suffisantes ont été recueillies, généralement après 30 à 60 s, arrêter l’acquisition.
  4. Recueillir la fragmentation au niveau de plusieurs énergies différentes lors de l’affectation des ions fragments.
    Remarque : Étant donné que la pulvérisation foliaire MS ne dispose pas d’une séparation chromatographique, les spectres de fragmentation sont susceptibles de contenir de nombreux ions et fragmenter à différentes énergies aidera à faire la lumière.

6. putatives Identifications par Fragmentation masse masse exacte et Tandem

  1. Faire des identifications putatives en faisant référence à des mesures de masse exactes des bases de données accessibles au métabolite comme Metlin21,22de la base de données du métabolome humaine, Banque de masse23, Lipid Maps24, Institut National de la Normes et technologie MS recherche25, ReSpect des composés phytochimiques26ou PNB27.
  2. Ces bases de données n’étant pas exhaustives, effectuer un examen de la documentation supplémentaire sur les espèces végétales caractérisés chimiquement au besoin.
  3. Match des ions de fragmentation de la feuille de pulvériser MS/MS pour les bases de données ci-dessus lorsque MS/MS information n’est disponible, ou à la littérature. Vous pouvez également utiliser une interprétation manuelle des ions fragments MS/MS ou une fragmentation d’un étalon authentique réalisée par l’injection directe ou LC-MS/MS.

7. analyse de données

  1. Convertir les fichiers raw de MS mzXML des fichiers avec l’outil msConvert de Proteowizard28.
  2. Utilisez le progiciel XCMS implémenté dans R pour le prélèvement de crête. Utiliser une injection directe procédé pour la pulvérisation foliaire MS analyse de traitement.
    Remarque : Les scripts bien annotées utilisés pour le traitement des données se trouvent à https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. Pour obtenir des mesures semiquantitative, représente la variabilité expérimentale, normaliser l’intensité de chaque métabolite de l’actuel total d’ion (TIC), comme la pulvérisation foliaire MS signal intensité peut varier, en partie en raison de légères variations dans le positionnement des la feuille dans la source et les différences dans la taille et la forme des feuilles.
  4. Sinon, utiliser du fournisseur de logiciel pour l’analyse des données ou MZmine2 (pour être trouvé à http://mzmine.github.io/)29.

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Representative Results

À 10 semaines qu'après la germination, fraîchement prélevés cultivés en serre S. tortuosum feuilles ont été analysés par pulvérisation foliaire MS. Le flux de travail expérimental pour la détection des métabolites de S. tortuosum laisse à l’aide de pulvérisation foliaire que MS est illustrée à la Figure 2. Une feuille a été sélectionnée, coupée en une bande mince avec un embout conique pour former un point et serrée avec la pulvérisation foliaire MS pince appareillage. Les tissus végétaux se trouvait environ 30 mm de l’entrée d’ion et en ligne avec les axes x et y. Lors de l’ouverture de la pulvérisation foliaire que ms de la S. tortuosum laisse, les ions ont été détectées sans n’importe quelle application de solvant. Plantes de la famille de Sceletium sont succulentes avec des feuilles épaisses avec une forte teneur en eau qui permet une ionisation par électrospray en pulvérisation foliaire MS sans l’application externe d’un solvant. Cependant, plus généralement, les tissus végétaux nécessitent une demande solvable pour détecter des ions.

Un chronogramme de masse et des spectres de masse très peuplées avec les ions ont été produites après 30 s d’acquisition en mode d’ionisation positive (Figure 3). Le chronogramme représente une pulvérisation foliaire réussie MS experiment où un signal stable a été maintenu pendant toute la durée de l’acquisition. Dans cette étude, un total de neuf mesembrine alcaloïdes ont été détectés par pulvérisation foliaire MS et putatives identifications ont été faites de la masse exacte des ions protoné de précédemment caractérisée composés (tableau 1)30. Il est avantageux d’effectuer la pulvérisation foliaire MS sur un haute résolution, précis-masse (HRAM) spectromètre de masse, qui permet de résoudre les masses légèrement différentes. Par exemple, le m/z à 262.1794 pourrait être potentiellement identifiée comme dihydrojoubertiamine au lieu de mesembrenone-m (déméthyl - dihydro-), qui aurait été à m/z 262.1443.

Les tissus foliaires est resté serré pour une fragmentation (MS/MS) masse de tandem de quelques ions d’intérêt (tableau 1). La figure 4 montre trois exemples de spectres de fragmentation MS/MS de pulvérisation foliaire MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zet 292.1897 m/z. Putatives identités ont été vérifiées par des fragments de massives et confirmées avec fragments identifiés précédemment30. L’ion protoné de 276.1583 m/z a été identifiée comme deux isomères différents du mesembrine-M (déméthyl) et une autre à deux isomères de mesembrenone-M en raison de la présence de fragments de diagnostics pour chaque isomère (tableau 1).

Mesembrine tant mesembrine-M (dihydro-) ont été détectés par pulvérisation foliaire MS et présumément identifiés par la masse exacte ainsi que par la fragmentation de la masse. L’ion protoné de mesembrine à 290.1742 m/z est l’un des ions plus abondants dans le spectre ; par conséquent, il peut être un candidat probable comme biomarqueur pour des études futures. Les deux principaux alcaloïdes de S. tortuosum sont mesembrine et mesembrenone, qui sont facilement détectés par pulvérisation foliaire MS. Plusieurs de ces composés détectés par pulvérisation foliaire que MS peut être utile dans le suivi du matériel végétal de Sceletium et produits dérivés.

Figure 1
Figure 1 : diagramme de pulvérisation MS feuille de Set-up. Pulvérisation foliaire MS est un métabolite, méthode qui permet l’échantillonnage rapide des tissus végétaux intacts de profilage. Le diagramme montre une pulvérisation foliaire MS avec kV haute tension appliquée avec une pince et la possibilité d’appliquer un solvant pour les tissus végétaux. Pulvérisation foliaire MS facilite l’ionisation par électronébulisation directement à partir de tissus végétaux dans l’admission de Mme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : expérience de flux de travail de pulvérisation foliaire MS. Des tissus végétaux sélectionnés, une feuille de Sceletium tortuosum , a été coupé, puis transféré avec une pince à être bridés et ensuite placée devant l’entrée d’ions avant l’acquisition de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Metabolite profiling de Sceletium tortuosum par pulvérisation foliaire MS avec ionisation positive. (A), ce panneau indique une pulvérisation foliaire MS masse chronogramme d’ion total count (TIC). Pour chaque sommet, le chiffre du haut est la durée (min) et le fond est le m/z. (B), ce panneau affiche la pulvérisation foliaire profile métabolite MS d’un spectre de masse positif Sceletium tortuosum . L’encart affiche 260-295 m/z. Les masses exactes sont déclarés par à 4 décimales avec une erreur < 6 ppm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Feuille jet MS d’ionisation positive en tandem les spectres de masse de Sceletium tortuosum couper feuille. Ces panneaux montrent des spectres de masse en tandem (MS/MS) recueillies en mode d’ionisation positive avec pulvérisation foliaire MS. Putative identifications des alcaloïdes sont fabriquées à partir de la masse exacte et la fragmentation de masse ce qui suit : (A) mesembrine-M et mesembrenone-M isomères, mesembrine (B) et (C) mesembrine-M (dihydro-). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composé Formule moléculaire Mesure Masse monoisotopique m/z [M + H] erreur de ppm Fragments
Dihydrojoubertiamine C16H23pas2 262.1794 5.0 N/A
Mesembrenone-M (O - déméthyl-) C16H19sans3 274.1431 4.5 N/A
Mesembrine-M (O - déméthyl-) C16H21sans3 276.1583 5.9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - déméthyl-) C16H21sans3 276.1583 5.9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-déméthyl - dihydro-) C16H21sans3 276.1583 5.9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-déméthyl - dihydro-) C16H21sans3 276.1583 5.9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone C17H21sans3 288.1587 4.3 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine C17H23pas3 290.1742 4.9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (dihydro-) C17H25aucune3 292.1897 5.2 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274

Tableau 1 : Putative identifications des Sceletium tortuosum mesembrine alcaloïdes par pulvérisation foliaire MS. Ce tableau des rapports sur les masses exactes d’ionisation positive et ions fragments de Sceletium tortuosum mesembrine alcaloïdes.

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Discussion

L’utilisation réussie de ce protocole repose sur l’optimisation des différentes étapes pour les espèces végétales, type de tissu et cibles composés d’intérêt. Les paramètres décrits dans le protocole fournissent un bon point de départ. Les décisions expérimentales suivantes doivent être réalisés et mis à l’essai : si oui ou non à l’emploi (1) couper ou tissus non circoncis et solvant (2) ou pas de solvant, (3) quel solvant utiliser et dans quel volume, (4) ce qui la distance du tissu de l’entrée d’ion doit être et (5) l’amplitude de la tension. L’objectif de l’optimisation consiste à trouver les conditions qui produisent un signal continu qui persiste pendant au moins 30 s pour quelques minutes. Les conditions devraient fournir une intensité de signal adéquate et reproductible, qui est nécessaire pour effectuer la masse exacte et mesures MS/MS. Intensité du signal élevé est réalisée via un spray performantes et fiable des ions provenant du tissu. La qualité de la pulvérisation dépend de la finesse de la pointe du tissu pointant vers l’entrée d’ions, la distance entre l’extrémité de l’entrée du tissu et ion et la tension électrique appliquée. Un spray réussi dépend fortement de la netteté du point de la pointe de tissu et, dans certains cas, le tissu doit être coupé pour former une pointe. En particulier, de légères altérations dans la netteté de l’angle de la forme effilée à l’extrémité du tissu coupé ont des effets importants sur la qualité résultante d’ionisation et ainsi l’intensité du signal produit7. Dans les cas où les tissus sont déjà pointées, alors aucune découpe n’est nécessaire, comme c’est le cas avec les brins d’herbe ou de feuilles en forme de lancette5,13.

Un signal d’ion peut être supprimé et instable en cas de décharge de plasma des tissus par suite être placé trop près à l’entrée de l’ion ou la tension électrique est trop élevée. Un bon positionnement du tissu et une sélection de la tension électrique sont nécessaires pour assurer une pulvérisation stable et cohérente entre les échantillons. La distance du tissu de l’entrée d’ion MS également une incidence sur la qualité et la quantité du signal produit. En général, un plus petit échantillon de tissu doit être placé plus près de l’entrée, bien que petits tissus ne peuvent aboutir à une intensité de signal faible si la pointe est extrêmement pointue ou les composés sont hautement concentrés. L’intensité et la cohérence des spectres doivent être optimisés empiriquement en comparant plusieurs positions de placement le long de l’axe z. Il est essentiel pour une ionisation appropriée que le tissu de la plante est aligné avec l’entrée d’ions MS à la fois les axes x et. Toutefois, si le tissu de la plante est déraisonnablement à proximité de l’entrée de l’ion, cela peut nécessiter un nettoyage plus fréquent de l’optique de l’ion et l’extrémité avant du système MS.

Le volume de solvant appliqué sur le tissu peut varier de 0 - 50 µl selon la teneur en eau et la taille de l’échantillon de tissu. Dans le cas où le tissu est très haute teneur en eau est coupé, comme dans le cas de la succulente Sceletium, aucun solvant ne peut-être être ajouté. Toutefois, il est plus typique d’utiliser au moins 5 à 10 µL de solvant au moins une application. L’ajout d’un solvant est nécessaire lorsque vous utilisez un tissu sec ou un tissu frais avec une teneur en eau faible afin de faciliter la vaporisation. Si une petite quantité de solvant est utilisée sur un grand morceau de matériel végétal, il sera probablement absorbée sans produire une pulvérisation suffisante. À l’inverse, si un volume trop élevé est utilisé, composés peuvent être dilués ou bonne désolvatation facilement et efficacement se produira pas. Une option alternative à pipetage manuellement solvant est d’appliquer continuellement solvant au tissu par une pompe à seringue afin que les désintégrations de signal observé en fonction du temps que le composé est épuisée de la matière végétale10. Différents types de solvants devraient être jugés, et les spectres résultants par rapport à vérifier toute amélioration de la quantité et la cohérence de l’ions pour les composés d’intérêt. L’ajout d’un solvant non seulement produit de pulvérisation, mais peut également fournir une sélectivité pour l’extraction de composés différents. Solvants organiques avec des polarités différentes (acétonitrile, méthanol, dichlorométhane, hexanes, chloroforme et l’acétone) ont été comparés et entraînent significativement différentes ions présents dans le spectre d’une graine d’arachide8. En général, le méthanol est un bon choix premier solvant, comme il a été montré à travailler bien pour beaucoup de tissus végétaux et une large gamme de composés phytochimiques, y compris les acides aminés, alcaloïdes, flavonols, glucides, acides organiques, acides gras et de phospholipides8. L’application d’eau de 100 % sur les tissus végétaux non circoncis ne fonctionne pas en général bien mais pourrait être améliorée avec l’ajout de sels10. Dans de nombreux cas, en plus des ions protonée d’un composé, autres abondante adduits sont détectés comme le sodium et le potassium adduits. La présence de ces sel adduits est encore plus répandu lorsque le sel est ajouté au solvant et peut être avantageuse. Par exemple, une augmentation de la sensibilité et la sélectivité des glucosides phénoliques de Populus espèces ont été observées avec l’addition d’ions sodium et potassium au solvant appliquée10.

Deux principales limites de la pulvérisation foliaire technique MS sont (1) la faible gamme dynamique et défis (2) avec quantification. En règle générale, seulement les composés les plus abondants sont ionisés et détectés par la technique. Diminution de l’efficacité de l’ionisation en raison de la répression d’ions qui se produit de façon spectaculaire en l’absence de séparation chromatographique est à moins d’un problème avec les métabolites abondantes. Pour contourner cette limitation, la plage de balayage peut être ajustée pour se concentrer sur seulement la gamme de m/z d’intérêt. Cependant, les composés de faible abondance toujours ne sont pas détectés sans la séparation et la concentration fournies par chromatographie. Contrairement à la typique dosage des composés d’un extrait, étalons internes ne peuvent être correctement mélangés dans le matériel végétal avant pulvérisation foliaire mesure Semi-quantitative MS. et concentrations relatives ont été obtenues en plaçant un connu concentration d’une solution titrée sur la surface du tissu et puis laissez-le sécher avant d’une pulvérisation foliaire MS analyse8,9,31. Par exemple, la méthode des ajouts dosés dosage a été utilisée pour calculer le ratio de l’ion représentatif pour l’étalon interne à l’ion d’intérêt afin de déterminer les quantités relatives de32. Une courbe d’étalonnage a été utilisée pour estimer la concentration relative. En utilisant cette méthode, il était possible de comparer le rapport des glycosides divers à un interne rebaudioside standard, D, et la concentration relative des glycosides spécifiques pourrait alors être calculée au sein de la Stevia feuilles33. Alternativement, un dosage plus précis est possible avec une norme isotopiquement étiquetée du composé d’intérêt, bien que la disponibilité commerciale peut être un défi. L’utilisation de tissus végétaux métaboliquement marqués peut également améliorer la quantification avec cette méthode34.

Étant donné que conventionnelles LC-MS/MS nécessite une préparation approfondie et la séparation chromatographique, autres méthodes d’analyse sont souvent désirés. Pulvérisation foliaire MS est une technique d’analyse chimique directe qui peut être facilement appliquée et offre simplicité, précision, exactitude et détection de métabolite rapide et la détermination semi-quantitative. Pour cette raison, nous avons examiné la pertinence de pulvérisation foliaire MS de contrôler le contenu chimique de S. tortuosum, qui pourrait fournir la base d’outils chimiotaxonomiques différencier les espèces du genre Sceletium basé sur biochimiques signatures. Plusieurs propriétés anatomiques de cette plante font un spécimen d’essai idéal pour pulvérisation foliaire MS. C’est une plante grasse, contenant des quantités élevées d’eau, ce qui est avantageux, comme le jet peut être généré sans l’application d’un solvant. Feuille de Sceletium contient idioblastes (cellules de type vessie)15 qui servent de réserves de stockage où les métabolites spécialisées peuvent s’accumuler. Pulvérisation foliaire MS est une technique d’analyse in vivo pour caractériser les tissus végétaux d’une manière rapide. La technique générale s’applique à plusieurs espèces de plantes, types de tissus et classes de composés. Techniques qui capturent des informations sur les composés de la plante sont d’un grand intérêt pour comprendre le métabolisme des plantes primaires et spécialisés pour des utilisations humaines de la santé, la nutrition, l’agriculture et l’énergie35.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la subvention de NSF Plant Genome Research Program IOS-1238812 et le stage postdoctoral en biologie IOS-1400818. Le travail a également été financé par une bourse d’étudiant diplômé Monsanto à Katherine A. Sammons. Le programme Fulbright des boursiers chercheur africain (2017-2018) est remercié pour le financement accordé à Nokwanda P. Makunga. Nous apprécions grandement la donation d’une source de tuyères de Jessica Prenni et l’installation de protéomique et métabolomique à la Colorado State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

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References

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Numéro 136 pulvérisation foliaire MS spectrométrie de masse ionisation par électronébulisation biochimie ionisation ambiante Sceletium tortuosum mesembrine alcaloïdes produits naturels métabolites petites molécules
Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux
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