मच्छर जनित वायरस संचरण के कुशल नियंत्रण के लिए, संबंधित मच्छरों के वेक्टर क्षमता का ज्ञान विशेष रुचि का है । हम एक विधि के रूप में मजबूर लार का वर्णन करने के लिए एडीज albopictus की वेक्टर क्षमता का विश्लेषण और Zika वायरस के संचरण के लिए तीन अलग Culex taxa ।
वेक्टर क्षमता एक मच्छर प्रजातियों के एक हड्डीवाला मेजबान के लिए एक मच्छर जनित वायरस (mobovirus) संचारित करने की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है । व्यवहार्य वायरस कणों एक संक्रमित मच्छर की लार के माध्यम से एक रक्त भोजन के दौरान प्रेषित कर रहे हैं । मजबूर लार परख एकल मच्छरों के आधार पर वेक्टर क्षमता का निर्धारण करने की अनुमति, पशु प्रयोगों के उपयोग से परहेज । विधि समय की एक छोटी अवधि के भीतर एक प्रयोग में मच्छरों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है । मजबूर लार परख के लिए ८५६ व्यक्तिगत जर्मनी में फंसे मच्छरों का विश्लेषण, दो अलग Culex pipiens pipiens के रूप में, Culex torrentium के रूप में अच्छी तरह के रूप में एडीज albopictus, जो प्रयोग से संक्रमित थे शामिल किया गया Zika वायरस (ZIKV) और दो और तीन सप्ताह के लिए 18 डिग्री सेल्सियस या 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के साथ । परिणाम ZIKV के लिए अलग Culex taxa के सदिश क्षमता की कमी का संकेत दिया । इसके विपरीत, एडीज albopictus ZIKV के लिए अतिसंवेदनशील था, लेकिन केवल 27 डिग्री सेल्सियस पर, एक एडीज aegypti प्रयोगशाला कॉलोनी के समान संचरण दरों के साथ समानांतर में परीक्षण किया ।
२०१५ में, Zika वायरस (ZIKV), एक मच्छर जनित वायरस (mobovirus) परिवार Flaviviridae से संबंधित , कोलंबिया और ब्राजील में उभरा और अमेरिका और कैरेबियन में तेजी से फैल गया, जुड़े की उल्लेखनीय संख्या के साथ एक महामारी के कारण microcephaly और Guillain के नैदानिक मामलों – Barré सिंड्रोम1. प्रजातियों के मच्छर एडीज aegypti और एडीज albopictus ZIKV2के प्राथमिक और माध्यमिक वैक्टर माना जाता है, लेकिन जीनस एडीज की अन्य प्रजातियों को भी प्रयोगात्मक सदिश क्षमता 3 साबित कर दिया है . एडीज प्रजातियों के विपरीत, अब तक परीक्षण Culex प्रजातियों में से अधिकांश वायरस4संचारित करने में सक्षम नहीं हैं । केवल, Culex quinquefasciatus के लिए डेटा अनिर्णायक परिणाम3प्रदान की है । वर्तमान में, जानकारी ZIKV के लिए मच्छर वेक्टर क्षमता पर उदारवादी तापमान शर्तों के तहत कमी है (< 20 ° c) । हालांकि, यह जानकारी इस तरह के मध्य यूरोप के रूप में शीतोष्ण जलवायु के साथ क्षेत्रों के लिए संभव फैलता के जोखिम आकलन के लिए पर्याप्त है ।
ZIKV के लिए एक सक्षम वेक्टर प्राप्त करने, बनाए रखने, बढ़ाना और अंत में वायरस संचारित करने में सक्षम है । इसलिए, मच्छर निकायों या शरीर के कुछ हिस्सों, पैर, midgut, सिर या लार ग्रंथियों सहित परीक्षण, ZIKV के लिए वेक्टर क्षमता निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । यह जारी लार के भीतर संक्रामक वायरस कणों के लिए परीक्षण करने के लिए अनिवार्य है । वेक्टर क्षमता का आकलन करने के लिए, दोनों संक्रमण दर (आईआर, engorged मच्छरों की संख्या प्रति ZIKV-सकारात्मक मच्छर निकायों की संख्या) और संचरण दर (TR, ZIKV के साथ मच्छरों की संख्या-ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों की संख्या प्रति सकारात्मक लार), होना करने के लिए है निर्धारित. आईआरएस मच्छरों की आसानी से बस अनुमन्य मच्छरों द्वारा पीछा किया जा सकता है एक रिवर्स transcriptase वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) लक्ष्यीकरण ZIKV । इसके अलावा, संक्रमण मच्छर प्रति वायरल प्रति संख्या का निर्धारण करके आगे की विशेषता हो सकती है । इसके विपरीत, संचरण दरों के विश्लेषण व्यक्तिगत मच्छरों की लार में व्यवहार्य वायरस कणों का पता लगाने पर निर्भर करता है । यह अतिसंवेदनशील मेजबान पशुओं पर संक्रमित मच्छरों की खिला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, viremia के विश्लेषण के बाद मेजबान5में । हालांकि, इस विधि उपयुक्त मॉडल जीवों पर निर्भर करता है, और महंगा है और पशु कल्याण नियमों द्वारा प्रतिबंधित है । संचरण दरों के विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग से बचने के लिए और लागत को कम करने के लिए रक्त की बूंदों का उपयोग कर कृत्रिम पुनः खिला प्रणालियों6बताया गया है । हालांकि, व्यक्तिगत पैमाने पर व्यक्तियों की एक उच्च संख्या के साथ संयुक्त परीक्षण मुश्किल और समय लेने वाली है । व्यक्तिगत पैमाने पर एक लार परख का पहला विवरण १९६६7 में प्रकाशित किया गया था और हाल के वर्षों के दौरान, मजबूर लार प्रयोगों पसंद की विधि के लिए3मच्छरों के वेक्टर क्षमता का मूल्यांकन हो गया है,8 .
हमारे वेक्टर मध्य यूरोपीय हाल ही में प्रकाशित मच्छरों के क्षमता अध्ययन के आधार पर9, हम लार मजबूर के रूप में एंडरसन एट अलद्वारा रिपोर्ट का वर्णन । 8 कुछ संशोधनों के साथ । इस विधि उच्च सुरक्षा स्तर की स्थिति (बीएसएल-3) के तहत उच्च प्रवाह मानकीकृत प्रयोगों की अनुमति देता है और सेल संस्कृति आधारित परख द्वारा सक्रिय वायरस की पहचान भी शामिल है । यहां बताए गए प्रयोगों में ८५६ मच्छर शामिल हैं । वे कृत्रिम रक्त भोजन द्वारा ZIKV से संक्रमित थे और बाद में लार में संक्रामक वायरस कणों की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया । इस मच्छरों के प्रयोगों में शुरू की दो लंबे समय एई की प्रयोगशाला आबादी की स्थापना की । aegypti और Culex pipiens pipiens molestus (Cx. पी. molestus), साथ ही साथ फील्ड पकड़ा Culex pipiens pipiens pipiens (Cx. पी. pipiens), Culex torrentium (Cx.torrentium) और दो एई. albopictus आबादी । दो एई. albopictus आबादी है , जो इटली में एकत्र किया गया था में से एक के अपवाद के साथ, सभी मच्छरों जर्मनी में एकत्र किए गए ।
यह पहले से दिखाया गया है कि परिणाम मजबूर लार के साथ प्राप्त शास्त्रीय पुनः खिला प्रयोगों6के साथ लाइन में हैं । हालांकि, दोनों फिर से खिला प्रयोगों में और हमारे प्रस्तुत विधि में मजबूर लार, यह असंभव है सीधे सबूत लार गतिविधि या लार की रिहाई की निगरानी । लार गतिविधि साबित करने के लिए, नमूनों लार (जैसे, प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, आदि) में मौजूद अन्य घटकों के लिए परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, अतिरिक्त qPCRs वायरल आरएनए प्रतियां का पता लगाने की अनुमति होगी । यह, तथापि, विभिंन विश्लेषण के लिए लार के नमूनों के बंटवारे की आवश्यकता है, जो बहुत कम कण संख्या के मामले में सेल संस्कृति परख में संवेदनशीलता को सीमित कर सकते हैं । बदले में, यह निर्धारित संचरण दरों के एक अनुमान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
reproducible परिणामों के लिए यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि प्रयोग के अंत तक सभी मच्छर जीवित रहें । यह नेत्रहीन मच्छरों के शरीर आंदोलन गतिविधि की निगरानी द्वारा नियंत्रित किया जाता है । इसके अलावा, एक दिया मच्छर प्रजातियों के लिए लार परख के सिद्धांत का उपयोग नियंत्रण वायरस, जो इस विशिष्ट मच्छर प्रजातियों द्वारा प्रेषित किया जाना जाता है खिला द्वारा परीक्षण किया जाना है । इसके विपरीत, हर वायरस एक प्रयोग में पेश करने के लिए एक अतिसंवेदनशील मच्छर में परीक्षण किया जाना है ।
मजबूर लार परख कई फायदे हैं । मच्छरों की उच्च संख्या पशु कल्याण विनियम9के साथ परस्पर विरोधी बिना नियंत्रित मानकीकृत शर्तों के तहत एक एकल नमूना आधार पर एक साथ परीक्षण किया जा सकता है ।
विधि कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है । हालांकि, सटीक setups अलग हो सकता है, जो प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक महत्वपूर्ण घटक लार, जो गिलास14 या प्लास्टिक15से बनाया जा सकता है इकट्ठा करने के लिए केशिका है । एक के उच्च सुरक्षा नियमों का अनुपालन करने के लिए एक सुरक्षा 3 कीट स्तर, हम बजाय कांच केशिकाओं के प्लास्टिक फिल्टर सुझावों का इस्तेमाल किया, इस प्रकार चोटों के जोखिम को कम करने. इसके अलावा, फिल्टर सुझावों का लाभ है कि एकत्र तरल आसानी से एक पिपेट का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है ।
मजबूर लार यहां प्रस्तुत परख के सेटअप दो एक साथ काम कर रहे जांचकर्ताओं और साझा करने के कर्तव्यों पर आधारित है । मच्छर के मैटीरियल एक व्यक्ति द्वारा किया जाता है, जबकि दूसरे एक साथ मजबूर लार सेटअप तैयार करता है । यह काफी समय से निपटने कम कर देता है और के रूप में स्थिरीकरण-कार्यस्थल और लार-प्लेट आवश्यक नहीं है के बीच बदलने के रूप में नमूना स्विचन के जोखिम को कम करता है । इसके अलावा, यह मजबूर लार डिवाइस पर मच्छरों के तुरंत जमावड़े के बाद रखने की अनुमति देता है । इस जगह कम मच्छर हैंडलिंग समय सफल मजबूर लार के लिए आवश्यक है । अन्त में, मच्छरों के पूरे प्रयोग भर गतिशीलता के लिए सीधे निगरानी की जा सकती है.
यहां प्रस्तुत लार परख मच्छर प्रजातियों के वेक्टर क्षमता में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कुछ अंय विशिष्ट प्रश्नों का उत्तर देने के लिए (जैसे, मच्छर के काटने की संख्या है कि रीढ़ को संक्रमित करने की जरूरत है), पशु प्रयोगों अभी भी आवश्यक हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम धंयवाद एला Weinert, मिशेल पतवार और मारलीस Badusche उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए, जेसिका Börstler Culex मच्छरों के विश्लेषण के लिए, Norbert बेकर और Björn Pluskota के लिए एडीज albopictus अंडे और ोली Vapalahti प्रदान करने के लिए वायरस स्टॉक प्रदान करना. एमएल लाइबनिट्स एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था; अनुदान संख्या देखा-२०१४-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |