Summary
ゼブラフィッシュは、遺伝子編集技術の登場により、特に、生物医学研究における信頼性の高い遺伝モデル有機体として使用されています。幼虫の表現型の場合は、DNA 抽出と遺伝子型同定は挑戦できます。ここでは、尾クリッピング、早ければ 72 時間後受精によるゼブラフィッシュの幼虫、効率的なジェノタイピング手順について述べる.
Abstract
ゼブラフィッシュ (動脈分布) では、人間の病気と関連付けられる知られていた遺伝子の 84% 第オーソロガスを所有しています。さらに、これらの動物は、短い世代時間を持っているし、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして胚における DNA の微量注射による遺伝子操作に簡単に適しています。遺伝子編集ツールの最近の進歩は、ゼブラフィッシュの遺伝子と変異の正確な導入を迎えました。ゼブラフィッシュのモデリング病気幼虫の表現型と遺伝子型が不明な場合の解釈に挑戦することができますの早期死亡に します。遺伝子表現または質量分析法の研究など、サンプルのプールを必要とする実験に必要な遺伝子型のこの早期発見しています。ただし、遺伝的スクリーニングは、ほとんどのラボでのみ大人ゼブラフィッシュや死後の幼虫で実行される従来の方法によって制限されます。我々 は早ければ 72 時間後受精 (hpf) 達成することができる生きたゼブラフィッシュ幼虫からゲノム DNA を PCR 用の隔離のための方法を適応させることによってこの問題に対処します。この時間とコスト効果の高い手法、以前発行したジェノタイピング プロトコルから微細フィン バイオプシーから遺伝子の同定をことができます。フィンは、幼虫を開発に迅速に再生成します。研究者を選択し、この高速 PCR に基づくジェノタイピング プロシージャを用いた成人に必要な遺伝子型を上げることができます。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布)治療仮説1,2,3の前臨床試験としてだけでなく病調査のためのモデルとして広く脊椎動物の生物します。これらの動物が短い世代時間、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして、胚4dna マイクロインジェクションにより遺伝子操作に簡単に従うです。新規トランスジェニック遺伝子の増加開発を通じて亜鉛指核酸 (ZFN)5タルのようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7、および、クラスター化定期的に空間短いなどの技術の編集回文を繰り返す (CRISPR)/CRISPR 関連 9 (Cas9) システム8ゼブラフィッシュは大幅にいくつかの病態の理解を改善するために態勢を整えています。これらの技術は、体細胞の両方のターゲットを絞ったノックアウトを作成する使用されている、ゼブラフィッシュ、効率的に遺伝子を醸成の生殖細胞変更動物8。本邦の最近の例は、ゼブラフィッシュ3,9,10、11,12 てんかん、代謝性疾患の遺伝学的モデルの開発に成功.
ゼブラフィッシュ ゲノム編集でなされる進歩、迅速かつ信頼性の高い遺伝子型別否定の律速段階となっています。予測されたゲノム編集ターゲット サイトに隣接する特定の DNA の突然変異の同定は、プロトコルの重要な段階です。伝統的に、フィン クリッピングによる遺伝子型解析技術は、通常のみで実行される少年や大人のゼブラフィッシュです。ただし、時間は成年期に引き上げゼブラフィッシュ (> 2 ヶ月) はかなり研究の進歩を遅らせます。多くの場合、必須遺伝子 (例えば、疾患モデル) または表現型の有害な影響につながる機能獲得変異のノックアウトによる成人期を実現できません。さらに、いくつかの試金は RNA または代謝物抽出のような幼虫のプールを必要とし、したがってジェノタイピング テクニックのホックの記事だけが利用できるときに挑戦できる遺伝子型の事前の同定が必要があります。これらの前述の例は、正確な同じ時に、完全復旧モデルと幼虫の正常な発展を有効にする幼虫検出技術の重要性を強調します。初期段階のゼブラフィッシュの遺伝子型が現在広く使用されるに表示されません。実験12,13,14の実行前に遺伝子型ではなく、事後のジェノタイピングによる幼虫の遺伝子型を識別する疾患モデルの最近の出版物に反映されます。本稿では以前に確立された遺伝子型のやり方を改善することを目指して幼虫フィン クリップ戦略を提案します。
過去には、遺伝子型にプロティナーゼ K 消化を採用戦略は幼虫が可変のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 効率15につながっているゼブラフィッシュを住んでいます。もっと最近より有望な結果16を提供顕微鏡尾生検手法を公開、我々 と他のグループができませんでした高効率、著者によって報告された DNA の回復を再現します。ウィルキンソンらによって記述されたプロトコルの主要な後退16は、PCR チューブに尾組織を転送可能性があります。その顕微鏡サイズのため、フィンは正しく収集、ピペッティングにより調剤を確保するは難しいです。この障壁に対処するため遺伝子型9のほぼ 100% の効率で生きたゼブラフィッシュ幼虫数が多いため改良されたプロトコルを開発しました。Microscalpel を使用して、フィン尾の先端が削除され、フィルター紙の上に配置します。組織を含むフィルター紙の作品は、容易に視覚化し、PCR チューブに正しく配置できます。ゲノム DNA の抽出が実行されます、続いて遺伝子試料への関心領域の PCR の拡大。このメソッドの利点には、PCR 効率、低偽陽性率と低い死亡率率があります。さらに、多数の胚の遺伝子型は、このプロトコルを使用可能です。ここ記載されているプロトコルは、このアプローチと誘因の魚と 2 日以内尻尾再生の正しい id を使用して 2-3 h 内幼虫数百人のフィン クリッピングを使用できます。
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Protocol
動物のケアのガイドラインに従って、承認されている含む動物科目の手順は、アニマル ・ ケア委員会動物ケアとオタワ大学のカナダの理事会によって提供されます。
1. 準備
- 郭清の面を準備するには、その内部の表面を横切ってオートクレーブ テープで 9 cm シャーレのふたをテーピングします。ステレオ顕微鏡の下に配置します。
- 3-5 日後受精 (dpf) を置くペトリネットにおける幼虫のゼブラフィッシュ皿し、˜1.5 mM Tricaine 1 x E3 胚メディア (5 mM NaCl、KCl、0.33 mM CaCl2、0.17 mM 0.33 mM MgSO4、pH 7.2) の麻酔。
- 最小限のストレスで 3 dpf 幼虫に合わせて 2 mm の直径にはさみやかみそりの刃のペアで P1000 ピペット チップの端を切り落とします。
2. ゼブラフィッシュ幼虫フィン クリッピング
- 変更された P1000 マイクロ ピペットを使用して麻酔の幼虫をピックアップし、シャーレのふたを配置されたオートクレーブ テープ ゼブラフィッシュ幼虫を配置します。
- マイクロ ピペットを使用して幼虫を取り巻く過剰の Tricaine ソリューションを削除します。地域はセクション フィンをピックアップすることは不可能が、生存を確保するのにはまだウェットとして乾燥する必要があります。
- マイクロメス、ステレオ顕微鏡、ウィルキンソンら16に示すように、図 1で示さで尾鰭のセクションを使用します。切開中に尾鰭血液循環 (図 1 a) の限界への遠位の色素ギャップ サイト内で安定した下方圧力を適用します。脊索の損傷を避けるために穏やかな圧力を適用します。
- 顕微鏡切片のフィンを可視化し、microscalpel ブレード (図 2 a) の先端の上に作品を配置します。フィルター紙の小片の表面にフィンを含む microscalpel を配置します。
注意: 切断組織におけるメラニン細胞の存在のためにこのステップはフィンの小さな黒い点 (図 2 b) として可視化できます。 - はさみやピンセット (図 2) を使用して、96 ウェル PCR プレートにフィンを含む、(図 2 D) ウェルあたり 50 mM NaOH 溶液の 25 μ L を含む濾紙を転送します。
- フラット底 96 ウェル プレート、PCR プレートのラベルによると井戸を番号を準備します。新鮮な 1 x E3 胚メディアの 200 μ L でいっぱい修正 P1000 ピペットを使用して、慎重に穏やかな圧力を使用してゼブラフィッシュ幼虫を収集し。同じ PCR プレート (図 2 e) としても番号で 96-well ティッシュの培養皿に幼虫を調剤します。
- フィルター ペーパーもソリューション (図 2 f) に浸漬するかどうかを確認します。Microscapel と 70% エタノール溶液に浸漬して交差汚染を防ぐために各カットの間ピンセットの刃をクリーンアップします。きれいなペーパー ティッシュ/ワイプでブレードを拭きます。
- 手順 2.1 2.7 を繰り返して、すべての胚がクリップされています。
- 遺伝子型の特定までは、28 ° C で 96 ウェル プレートで幼虫を格納します。
注: 胚メディアは、2 日以内にプロトコルを簡単に完了できるので、変更する必要はありません。多くの時間が必要な場合、メディアの変更をお勧めします。
3. ゲノム DNA の抽出
- シール 96 ウェル PCR プレートおよび遠心フィルターのすべての書類を確認する 1 分 1,000 x g でサンプルが NaOH 溶液内で水中に沈みます。
- 組織溶解の 95 ° c 10 分のための 4 ° C に冷却後 5 分たちのサンプルを加熱します。
- 500 mm トリス-HCl、各サンプルに pH 8.0 6 μ L を追加します。渦。
- 簡単に遠心分離機で 1,500 × g、室温で 5 分間プレート。
- 1.5 μ L の PCR 反応あたり DNA 上清を使用します。
- 表 1-2に示すように、幼虫は、遺伝子を PCR を準備します。
注: このプロトコルは、2 つのアプリケーションのテストされた: 明らかに agarose のゲルの9、およびヘテロ二本鎖融解アッセイ (HMA) 明らかに遺伝子型のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)17を使用してを使用して遺伝子の PCR の反作用を多重化します。
4 キレート樹脂を用いた代替のゲノム抽出
- ろ紙クリップされたフィンを 96 ウェル PCR プレートに追加することによって完全なステップ 2.5 キレート樹脂 (スチレン-ジビニル ベンゼン共重合体ペア イミノ二酢酸イオンを含む) 5% の 30 μ L を含みます。
注: このタイプの樹脂は、組織溶解し、高速かつ効率的な方法18PCR 用 DNA の準備のため使用されます。 - 示される 2.6 〜 2.8 の手順に従います。
- 96 ウェル PCR プレートをシールし、簡潔にすべてのフィルター ペーパーがキレート樹脂内に水没を確認するサンプルを遠心します。
- 組織溶解の 95 ° C 10 分のための 4 ° C に冷却後 15 分でたちのサンプルを加熱します。
注: この手順により溶解や細胞成分を極性樹脂ビーズの後続バインド DNA および RNA 溶液中に残っている間。 - 簡単に遠心分離機の樹脂ビーズをペレットし、懸濁液中の DNA を取得するサンプルです。
- 3.5-3.6 ジェノタイピング手順を完了する手順に従います。
5. アプリケーション 1: マルチプレックス PCR の Agarose のゲルの分析に続いて
- WT 幼虫、ヘテロ接合体、ホモ接合体変異体の識別を有効にするマルチプレックス PCR 反応を設定次の表 1。96 ウェル サーマルサイクラーを使用すると、表 3に示すサイクリング条件を使用して PCR の反作用を実行できます。
注: PCR の反作用は、任意他従来 PCR サーマルサイクラーでも実行できます。この例は、ペナらによって使用される PCR 戦略を説明します。9 aldh7a1 WT と同じ多重反応で 5 bp の挿入変異対立遺伝子を識別します。 - ナトリウム ホウ酸バッファー、1 とステンド グラスに 1% の agarose のゲルの準備 x GelRed。
注: ホウ酸ナトリウム緩衝在庫 x 20 で 10 M NaOH、ddH2O、1800 mL 40 mL pH 8.5 ホウ酸の 76 g に調整および ddH2o. を使用して 2 L 最終巻を完了し - 250 V で 15 分の 1 x ナトリウム ホウ酸バッファーでゲルを実行します。プロセスを容易にするために可能であれば、サンプルをロードする時間の短縮による高スループット機能を有効にするマルチ チャンネルの pipets と互換性のあるジェル システムを使用します。
- 異なる遺伝子型の識別を許可する紫外線 (UV) 光の下でゲルをイメージします。
6. アプリケーション 2: ヘテロ二本鎖アッセイを溶融
- ページ 12 1.5 mm スペーサー プレートと 15 サンプル櫛を使用して % ゲルを準備します。12.21 mL ddH2O、2.52 × トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE)、30% アクリルアミドの 10 mL、250 μ L の 10 mL の 10% アンモニウムの過硫酸塩 (AP) を使用して 2 つのページのゲルを準備し、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L。1 x TBE バッファーを使用 (0.089 M トリス-HCl、0.089 M ホウ酸と 0.002 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)) バッファーを実行することとします。
- 5 分 94 ° C で PCR の製品を加熱します。
- 4 ° C で 10 分間たち、氷の上の管を冷却します。
- PCR のサンプルあたり 10 μ L と分子量マーカーの 8 μ L を読み込みます。
- 150 V 垂直電気泳動システムを用いた分子量マーカーまで、または 1 時間ほぼ TBE ガラス板の足のラインに達すると 1 x でページを実行します。
- 異なる遺伝子型の識別を許可する紫外線の下でゲルをイメージします。
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Representative Results
遺伝子型によって、protocoll の効率を示したヘテロ接合体の十字の子孫 (aldh7a1+/ot100、 aldh7a1+/-としてここに示されて) (図 3 a- C)9。Aldh7a1ot100の突然変異体の対立遺伝子は、フレーム シフトと早期停止コドン9のための機能喪失につながるゼブラフィッシュaldh7a1遺伝子の最初のコーディング エクソン 5 塩基対 (bp) 挿入。4 プライマーは WT、ヘテロ接合体 (+/-aldh7a1)、および (aldh7a1-/-) のホモ接合体変異の遺伝子型を区別する 3 つの特徴的なバンドを得るため多重反応で使用された (ペーニャからら。 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3'、"Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT 3'、"5 nt-イン-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' と"WT specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3')。Gen1_FW と Gen1_RV のプライマーを使用して両方の対立遺伝子の増幅は、434 bp 増幅で起因しました。293 bp のバンドは生じた突然変異体の対立遺伝子の増幅と 195 bp のバンドが得られた具体的 WT 対立図 3Aに示すように。次の PCR、それぞれ 20 μ L 反応量の 8 μ L を行った 1% アガロース/ナトリウム ホウ酸塩ゲルの図 3Bに示すように十分な幼虫の DNA は 98% から回収された (n = 576) 高い PCR 効率の結果、サンプルの。NaOH を用いた DNA の抽出は、平均 4.7 0.5 ng/μ L 〜 30 μ L のボリュームで、フィン生検の手順に従ってサンプルごとの幼虫の dna を取得します。キレート樹脂を用いた DNA 抽出結果同様の収率は、平均で 3.8 0.5 ng/μ L の DNA サンプルあたり。この幼虫フィン transections から収集された DNA の量は、遺伝子の同定を可能にするのに十分な品質の PCR 用ゲノム DNA を生成します。˜30 PCR 増幅反応の各 DNA のサンプルを使用できます。Gen1_FW と Gen2_RV のプライマーを用いて増幅製品シーケンス アプリケーション9、ホモ接合体変異体 (aldh7a1-/-) (図 3 で 5 bp の挿入が正常に識別のために使用もできます。).サンガー配列を PCR の製品は、このアプリケーションに適していた場合をテストする外部サービス経由で行った。ホモ接合体変異体と WTs agarose のゲルからの DNA のサンプルを確認した (n = 各 3) 使用されました。高 Phred19得点 (> 30) を示す高品質の読み取り、最初と最後の 40 塩基対を除いて得られました。
このプロトコルはその後ヘテロ二本鎖融解曲線解析による遺伝子型に様々 な他のゼブラフィッシュ変異体を使用します。Plpbp遺伝子の (図 4 a~ D) 各plpbpot101とplpbpot102変異対立遺伝子は、フレーム シフト、早期停止コドンに します。Plpbpを識別するために-突然変異サイトを含む最初のコーディングのエクソンを増幅するための null ゼブラフィッシュ幼虫、2 つのプライマー (plpbp F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'とplpbp R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3')。WT 動物のplpbpフラグメントの増幅結果 272 bp 増幅 (homoduplex)。268-bp の断片とplpbpot102 (5bp 置換、2 bp 削除対立遺伝子、図 4) から成っているplpbpot101 (対立遺伝子 4 bp 削除、図 4) から得られた増幅270 bp、図 4 a・ Bに見られるように。変性、アニーリング、ヘテロ接合体の動物から PCR のフラグメントにヘテロ二本鎖 homoduplex DNA17が含まれます。Homoduplex とヘテロ二本鎖のバンドは簡単に分けることができるし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を用いて可視化します。突然変異の発生による不完全なアニーリングによる一致と不一致の DNA 鎖の間に開いている角度の存在を引き起こすヘテロ二本鎖 DNA homoduplex DNA17よりかなり遅いペースで移行します。異なる移動パターンは異なる突然変異によって生産されています。ヘテロ接合体の遺伝子型 (plpbp+ ot101、 plpbp+ ot102) 化合物のヘテロ接合体 (plpbpot101/ot102) (図と同様に、ヘテロ二本鎖 DNA 断片を表示したがって4 aB)。このヘテロ二本鎖として各遺伝子型のユニークなページのパターンを取得して、個別のヘテロ接合性変異を視覚化できるアッセイを溶解 (図 4 aB) による正確なジェノタイピング.ホモ接合体変異体はページのゲルの homoduplex のパターンを表示し、したがってを WTs に区別できません。これらの遺伝子型を区別するためにページのゲルの分析の別のラウンドは、17を他の場所で説明されているように検討するが、サンプルと混合する WT 対立遺伝子の必要性からの PCR の製品で行わなければなりません。
WT とヘテロ接合体の胚の約 90% (88/98) 大人に育った (> 2 ヶ月)。Aldh7a1とplpbpは、初期の死の表現型を表示の機能喪失変異体、未処理動物が大人に発生しませんでした。しかし、すべて存続 WT とヘテロ接合体の大人の遺伝子型は幼虫フィン生検の手順を使用して遺伝子の同定の精度率が 100% を示す幼虫フィン クリッピング結果と同じでした。
図 1。幼虫フィン クリップ。(A) します。 3 日後受精 (dpf) で非切断幼虫フィン。行は、断裂、顔料ギャップ内のサイトを表します。黒い矢印は、尾びれの血流の制限を示しています。(B). 次の幼虫フィン 3 dpf でクリッピング プロシージャ。(C). 5 dpf でゼブラフィッシュ稚魚フィン再生。巣状の形成からフィンの再生は唯一の 2 日後フィンの断裂を観察されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。幼虫フィン クリッピングのためのプロシージャです。(A). 幼虫はテープ上に配置され、余分な胚のメディアを削除します。顕微鏡では、図 1 aに示すように、フィンは顔料ギャップの地域で離断します。Microscalpel を使用すると、フィンが収集され、フィルター紙の上に置かれただけでタッチ (B) 表面し、黒い斑点として容易に視覚化することができます。フィンを含むフィルターの紙の部分を持ち、(C) の目的の地域を囲む小さな正方形をカットします。96 well プレート (D) の井戸にフィンを含むフィルター紙の小片を置きます。対応する幼虫は、胚メディア (E) 200 μ L のフラット底 96 ウェル プレートのよく対応するのに配置必要があります。フィルター紙部分は、溶解液 (F) 水没する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。Aldh7a1ヘテロ接合間幼虫フィン バイオプシーからのジェノタイピング。(A)。WT とaldh7a1ot100の両方の対立遺伝子の増幅が 434 bp 増幅の結果期待される結果。293-bp のバンドが (aldh7a1ot100、5 bp の挿入)、突然変異体の対立遺伝子の増幅から発生し、WT アレルの 195 bp のバンドが得られます。(B). aldh7a1幼虫フィン組織から pcr の例。1 kb の分子量マーカーは、レーン 7 に表示されます。1-6 の車線のシングルフィン生検を表しています。PCR の結果は、 aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) 遺伝子 (1 車線)、 +/- aldh7a1ヘテロ接合体遺伝子型を識別する (aldh7a1+/ot100) (3、4、および 5 の車線) と重量 (aldh7a1+/+)遺伝子 (レーン 2 と 6)。(C) します。 シーケンスされた WT と 5 bp の挿入変異の位置を示すaldh7a1ot100アレル間の位置合わせ。この図は、ペナらの補足図 5 から適応されました。9アメリカの遺伝学の協会から付与された権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。Plpbp複合ヘテロ接合体 (2 bp 削除 4 bp 削除) 幼虫フィン バイオプシーからのジェノタイピング。(A)。WT の対立遺伝子の増幅が 272 bp 増幅の結果期待される結果。4 bp 削除対立遺伝子 (plpbpot101) および 2 bp 削除対立遺伝子 (plpbpot102) と 5 bp 置換は、それぞれ 268 bp と 270 bp の増幅バンド長さを生成します。ヘテロデュプレックス易動は WT の対立遺伝子、(+/-plpbp) ヘテロ接合体遺伝子型変異アレル間に形成されます。対立遺伝子の不一致によるヘテロ二本鎖の形成は、WT homoduplex と比較してゲル内にあるバンドの遅延原因となります。(B). 幼虫フィンの切り抜きの子孫から生じる PCR 増幅、 plpbp+ ot101x plpbp+ ot102クロスします。1 レーンに 1 kb の分子量マーカーを示します。2-10 の車線は、シングルフィン生検を表しています。PCR の結果が突然変異の遺伝子型を識別する (plpbp-null 複合ヘテロ接合体plpbpot101/ot102レーン 2、4、および 8)、ヘテロ接合体遺伝子型 (3、6、7、9、および 10 の車線) と WT 遺伝子型 (レーン 5)。(C) します。 シーケンスされた WT と 4 bp 削除の突然変異の位置を示すplpbpot101アレル間の位置合わせ。(D) します。 シーケンスされた WT と (太字) 2 bp 削除と 5 bp 置換位置を示すplpbpot102アレル間の位置合わせ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| コンポーネント | 20 μ l 反応 | 100 の反応 | 最終濃度 |
| ヌクレアーゼ フリー H2O | $7.45 Μ L | 745 Μ L | |
| 行く Taq 2 (Promega、M7122) x | 10 Μ L | 1000 Μ L | 1 x |
| プライマー Gen1_FW | 0.25 Μ L | 25 Μ L | 0.125 Μ M |
| プライマー 5 nt-イン-specific_FW | 0.3 Μ L | 30 Μ L | 0.15 Μ M |
| プライマー Gen2_RV | 0.25 Μ L | 25 Μ L | 0.125 Μ M |
| プライマー WT specific_RV | 0.25 Μ L | 25 Μ L | 0.125 Μ M |
| DNA | 1.5 Μ L | -- |
テーブル 1。マルチプレックス PCR 用の反応条件、 aldh7a1 このプロトコルで対立遺伝子。使用されるプライマーは、次のとおりです。: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3'、"Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT 3'、"5 nt-イン-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3'、と"WT specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'。プライマーの株は、10 μ M でした。
| コンポーネント | 13 μ l 反応 | 100 の反応 | 最終濃度 |
| H2O | 3.25 Μ L | 325 Μ L | |
| 行く Taq 2 (Promega、M7122) x | 6.25 Μ L | 625 Μ L | 1 x |
| FW のプライマー | 1 Μ L | 100 Μ L | 0.77 Μ M |
| RV のプライマー | 1 Μ L | 100 Μ L | 0.77 Μ M |
| DNA | 1.5 Μ L | -- |
表 2。ために使用される PCR 反応条件 plpbp このプロトコルでアレル。使用される転送のプライマー PLPBP F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 だった 'と、リバース、 PLPBP R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'。プライマーの株は、10 μ M でした。
| サイクルのステップ | Temp。 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 95 ° C | 3 分 | 1 |
| 変性 | 95 ° C | 30 秒 | 36 |
| 焼鈍 * | ° C X | 30 秒 | |
| 拡張機能 | 72 ° C | 20 秒/kb | |
| 最終的な拡張 | 72 ° C | 5 分 | 1 |
| 4 ° C | ホールド |
表 3。PCR の状態は、このプロトコルで使われます。
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Discussion
過去の突然変異とゼブラフィッシュの遺伝子を正確に紹介する編集ツールが採用されている遺伝子年5,6,7,8。病ゼブラフィッシュ モデルを実行すると、初期の幼虫や少年の表現型に9,12,13,14多く観察されます。ここで提示されたプロトコルでは、若い 3 dpf と幼虫のジェノタイピングを有効にする、小さなゼブラフィッシュ幼生尾のバイオプシーから PCR 用 DNA の抽出について説明します。遺伝子型の早期発見は、遺伝子型のホックを投稿が可能な9でない場合は特に、いくつかの研究室のアプリケーションにとって重要です。幼い頃から遺伝子型を知ること、生存研究と変異体の表現型解析も容易になります。このプロトコルはまた成熟に特定遺伝子型の幼虫の育成に特に役立ちます。幼虫のジェノタイピングまだ広く使用されていませんゼブラフィッシュ研究所で世界中で、このプロトコルはこの技術の普及を促進するを目指します。切断のフィンを操作しながらこのメソッドの使用は、サンプル内の DNA の存在に関して信頼性を提供します。フィンの生検は、処理プロセス全体でろ紙上暗いスポットとして容易に視覚化できます。これは Wilkinson et al.によって公開されたプロトコルの重要な改善を表します16。
プロトコル内でいくつかの重要な手順は、品質の結果を得るに正しく続かれなければなりません。第一に、顔料のギャップ、出血を避けるために、血液の循環を制限する遠位内幼虫フィンの切除の必要があります。これはフィン生検中の幼虫の生存を保証します。また、フィンの位置をマーキング、フィルター紙の上の黒い点は NaOH 溶液でろ紙を置く前に遵守されなければなりません。これは、各サンプルでよくフィンの組織 (およびそのため、DNA) の存在を保証します。フィルター ペーパーは、セル換散および正常な DNA の抽出を保証する NaOH 溶液内も浸漬する必要があります。孵化した幼虫のみが使用されたように、このプロトコルが 3 dpf より若い年齢のテストされませんでした。遺伝子型の若い胚 (死ご < 3 dpf) 絨毛膜の除去が必要になります。その不十分な PCR の拡大が発生した場合に、標準的な PCR の最適化戦略応用 (例えば、プライマー濃度を変化、温度、および/または DNA 濃度を焼鈍) はずです。十分な DNA を抽出して、PCR 反応 (下図のaldh7a1とplpbpのジェノタイピング例のために) のいくつかの種類を正常に実行する、このフィン クリッピングを手順得られた DNA の濃度は小さい (~ 5 ng/μ L あたりサンプル) したがって、PCR の反作用の DNA の濃度を増加させる増幅のより大きい成功を可能にする可能性があります。
このプロトコルで抽出した幼虫フィン DNA は、ゼブラフィッシュ稚魚の遺伝子型と高スループット方法で正確な識別を許可するいくつかの増幅反応に使用できます。ページのゲルの試金を融解ヘテロ二本鎖は、17の異なる変異を識別するために使用できます。1 サンプルあたりの ~ 30 μ L の DNA が得られるし、PCR の反作用ごと DNA の 1 〜 1.5 μ L を使用したことを考えるは、抽出したサンプルあたり約 30 の PCR の反作用を実行できます。PCR の製品はサンガー シーケンス アプリケーションに適していますWT の正確な確認とaldh7a1のホモ接合体変異体シーケンスことができます読み取りの高品質が得られました。ゼブラフィッシュ稚魚からゲノム DNA の抽出には、研究の多くのアプリケーションがあります。このプロトコルの開発の元の目標は、 aldh7a19の特定の突然変異のための成人に達することができない遺伝子型幼虫効果的にでした。さらに、このプロトコルには、遺伝子の分離、特に幼虫期以降9からaldh7a1-/-魚でてんかんを伴う表現型の観察が有効になります。RNA の抽出または代謝物抽出などのアプローチの各遺伝子型の幼虫のプーリング正確に実行できる手順9をクリッピングこの幼虫フィンによるジェノタイピング後。結論としては、トレーニングの短い期間の後経験豊富な探偵がのみ最小限かつ安価な試薬、日常的に 1 日あたりフィン クリップの何百もを実行するを必要とする、このシンプルで時間効率の良いプロトコルを使用できます。ペナらによって記述された研究このプロトコルの使用が可能うまくいけばより広範なゼブラフィッシュにおける同様の目的にサービスを提供します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、まれな疾患モデルと機構 (RDMM) ネットワーク (カナダ協会の健康研究 (機構) とゲノム カナダによって拠出された) に感謝したいと思います。CK は、支給奨学金授与 (オタワ大学) によってサポートされます。DLJ は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金によってサポートされます。IAP はカナダ協会の健康研究 (機構) ポスドク ・ フェローシップ賞を受賞しています。作者に感謝、遺伝学協会許可からペナ、補足図 5 の適応を使用してこのプロトコルを公開するら。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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