Summary
Zebrafish जैव चिकित्सा अनुसंधान में विश्वसनीय आनुवंशिक मॉडल जीवों के रूप में इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से जीन के आगमन-संपादन प्रौद्योगिकियों के साथ । जब लार्वा phenotypes की उम्मीद कर रहे हैं, डीएनए निष्कर्षण और जीनोटाइप पहचान चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यहां, हम zebrafish लार्वा के लिए एक कुशल genotyping प्रक्रिया का वर्णन, पूंछ कतरन द्वारा, के रूप में जल्दी के रूप में ७२-एच के बाद निषेचन ।
Abstract
Zebrafish (ढाणियो rerio) मानव रोगों के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता जीन के ८४% के लिए orthologues के अधिकारी । इसके अलावा, इन जानवरों को एक छोटी पीढ़ी के समय है, को संभालने के लिए आसान कर रहे हैं, एक उच्च प्रजनन दर, कम लागत प्रदर्शन, और आसानी से भ्रूण में डीएनए के microinjection द्वारा आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए उत्तरदाई हैं । जीन संपादन उपकरण में हाल के अग्रिमों zebrafish में उत्परिवर्तनों और transgenes के सटीक परिचय को सक्षम कर रहे हैं । zebrafish में रोग मॉडलिंग अक्सर लार्वा phenotypes और जल्दी मौत जो अगर पादी अज्ञात है व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है की ओर जाता है । पादी की यह जल्दी पहचान भी नमूना पूलिंग, जैसे जीन अभिव्यक्ति या मास स्पेक्ट्रोमेट्री अध्ययन में आवश्यकता होती है प्रयोगों में की जरूरत है । हालांकि, व्यापक genotypic स्क्रीनिंग पारंपरिक तरीकों, जो ज्यादातर प्रयोगशालाओं में केवल वयस्क zebrafish या गुजाइश लार्वा पर प्रदर्शन कर रहे हैं द्वारा सीमित है । हम जीवित zebrafish लार्वा से तैयार जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए एक विधि के अनुकूल द्वारा इस समस्या को संबोधित किया है कि ७२ एच पद निषेचन (hpf) के रूप में जल्दी के रूप में प्राप्त किया जा सकता है । इस समय और लागत प्रभावी तकनीक, एक पहले से प्रकाशित genotyping प्रोटोकॉल से सुधार, सूक्ष्म पंख बायोप्सी से पादी की पहचान की अनुमति देता है । पंख जल्दी से पुनर्जीवित के रूप में लार्वा का विकास । शोधकर्ताओं ने तो चयन करने के लिए और इस उच्च प्रवाह पीसीआर आधारित genotyping प्रक्रिया का उपयोग करके वयस्कता के लिए वांछित पादी बढ़ाने में सक्षम हैं ।
Introduction
zebrafish (ढाणियो rerio) व्यापक रूप से रोग की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चिकित्सकीय परिकल्पनाओं के नैदानिक परीक्षण के लिए1,2,3के रूप में इस्तेमाल किया एक हड्डीवाला जीव है । इन जानवरों को एक छोटी पीढ़ी के समय है, को संभालने के लिए आसान कर रहे हैं, एक उच्च प्रजनन दर, कम लागत प्रदर्शन, और आसानी से भ्रूण4में डीएनए के microinjection द्वारा आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए उत्तरदाई हैं । इस तरह के जस्ता के रूप में उपंयास ट्रांसजेनिक और जीन संपादन प्रौद्योगिकियों के बढ़ते विकास के माध्यम से फिंगर nucleases (ZFN)5, ताल की तरह प्रभाव nucleases (TALENs)6,7, और नियमित रूप से कम रिक्ति संकुल Palindromic दोहराता (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) प्रणाली8, zebrafish कई रोग की स्थिति की समझ में काफी सुधार की ओर अग्रसर है । इन प्रौद्योगिकियों zebrafish में दोनों दैहिक और germline कोशिकाओं में लक्षित नॉकआउट बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, कुशलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं8दिनोंदिन । साहित्य में हाल के उदाहरणों में मिर्गी के आनुवंशिक मॉडलों के सफल विकास और zebrafish3,9,10,11,12 में चयापचय संबंधी विकार शामिल हैं .
zebrafish जीनोम संपादन में की गई प्रगति के साथ, तेजी से और विश्वसनीय genotyping एक निर्विवाद दर कदम सीमित बन गया है । विशिष्ट डीएनए उत्परिवर्तन की भविष्यवाणी की जीनोम-संपादन लक्ष्य साइट से सटे की पहचान प्रोटोकॉल का एक अनिवार्य मंच है । परंपरागत रूप से, पंख कतरन द्वारा genotyping तकनीक आमतौर पर केवल किशोर या वयस्क zebrafish में प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि, समय वयस्कता को zebrafish स्थापना खर्च (> 2 महीने) अनुसंधान में काफी देरी प्रगति । कई मामलों में, वयस्कता आवश्यक जीन के नॉकआउट के कारण प्राप्त नहीं किया जा सकता (जैसे, रोग मॉडलिंग में) या लाभ के समारोह हानिकारक phenotypic प्रभाव के लिए अग्रणी उत्परिवर्तनों । इसके अलावा, कई परख लार्वा के पूलिंग की आवश्यकता होती है, जैसे आरएनए या metabolite निष्कर्षण में, और इस तरह पादी की पूर्व पहचान शामिल है, जो जब केवल पोस्ट हॉक genotyping तकनीक उपलब्ध है चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इन aforementioned उदाहरण लार्वा genotyping तकनीक है जो एक ही समय में सटीक और पूर्ण वसूली और लार्वा के सामांय विकास को सक्षम कर रहे है के महत्व पर प्रकाश डाला । प्रारंभिक चरण zebrafish genotyping वर्तमान में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रकट नहीं होता; यह रोग मॉडल के हाल के प्रकाशनों से परिलक्षित होता है जिसमें लार्वा पादी का प्रयोग12,13,14के निष्पादन से पूर्व genotyping के बजाय पोस्टमार्टम genotyping के माध्यम से पहचाना जाता है । इस पत्र में, एक लार्वा फिन क्लिप रणनीति पहले से स्थापित genotyping प्रक्रियाओं में सुधार करने के लिए लक्ष्य प्रस्तुत किया है ।
अतीत में, रणनीतियों proteinase K पाचन को रोजगार जीनोटाइप लाइव zebrafish लार्वा चर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) दक्षता15के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि एक और हाल ही में प्रकाशित सूक्ष्म पूंछ बायोप्सी तकनीक अधिक आशाजनक परिणाम16प्रदान की है, हम और अंय समूहों में सक्षम उच्च दक्षता और डीएनए वसूली लेखकों द्वारा रिपोर्ट पेश नहीं कर रहे थे । Wilkinson एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का एक बड़ा झटका । 16 को टेल टिशू का ट्रांसफर पीसीआर ट्यूब पर किया जा सकता था । अपने सूक्ष्म आकार के कारण, यह सुनिश्चित करना कठिन है कि फिन ठीक से एकत्र और pipetting द्वारा तिरस्कृत किया गया था । इस बाधा को हल करने के लिए, हमने लगभग १००% दक्षता9के साथ बड़ी संख्या में लाइव zebrafish लार्वा genotyping के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित किया है । एक microscalpel का उपयोग करना, पंख पूंछ की नोक हटा दिया और फिल्टर कागज के एक टुकड़े पर रखा गया है । फ़िल्टर कागज के टुकड़े ऊतक युक्त आसानी से visualized किया जा सकता है और सही ढंग से एक पीसीआर ट्यूब में रखा । जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण तो प्रदर्शन किया है, ब्याज के क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा नमूना जीनोटाइप के बाद । इस विधि के लाभ एक उच्च पीसीआर दक्षता, एक कम झूठी सकारात्मक दर और एक कम मृत्यु दर शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, भ्रूण की बड़ी संख्या के genotyping इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभव है । इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल फिन-2-3 घंटे के भीतर लार्वा के सैकड़ों की कतरन इस दृष्टिकोण और दो दिनों के भीतर genotyped मछली और पूंछ पुनर्जनन की सही पहचान का उपयोग करने की अनुमति देता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी गई है और पशु देखभाल पर कनाडा की परिषद द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे है और ओटावा पशु देखभाल समितियों के विश्वविद्यालय ।
1. तैयारी
- इसकी भीतरी सतह के पार आटोक्लेव टेप के साथ एक 9 सेमी पेट्री डिश ढक्कन टेप द्वारा विच्छेदन सतह तैयार करें । यह एक स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के तहत स्थिति ।
- प्लेस 3-5 दिन बाद निषेचन (dpf) एक पेट्री पकवान में zebrafish लार्वा और anesthetize में ˜ १.५ mm Tricaine में 1x E3 भ्रूण मीडिया (5 मिमी NaCl, ०.१७ मिमी KCl, ०.३३ मिमी CaCl2, ०.३३ मिमी MgSO4, पीएच ७.२) ।
- कैंची या 2 मिमी के एक व्यास के लिए एक उस्तरा ब्लेड की एक जोड़ी के साथ एक P1000 पिपेट टिप के अंत में कटौती करने के लिए ंयूनतम तनाव के साथ एक 3 dpf लार्वा को समायोजित ।
2. फिन Zebrafish लार्वा की कतरन
- संशोधित P1000 micropipette का उपयोग कर एक anesthetized लार्वा उठाओ और आटोक्लेव डिश ढक्कन पर तैनात पेट्री टेप पर zebrafish लार्वा जगह है ।
- एक micropipette का उपयोग लार्वा आसपास के अतिरिक्त Tricaine समाधान निकालें । क्षेत्र को सफलतापूर्वक अनुभाग के रूप में संभव के रूप में शुष्क और फिन उठाओ, लेकिन अभी भी अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए गीला होना चाहिए ।
- एक माइक्रो स्केलपेल का उपयोग करना, खंड caudal पंख के तहत एक स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के रूप में चित्रा 1में संकेत दिया, जैसा कि Wilkinson एट अल16में वर्णित है । चीरा के दौरान, रक्त परिसंचरण (आंकड़ा 1a) की सीमा के लिए बाहर caudal फिन की वर्णक गैप साइट के भीतर एक स्थिर नीचे दबाव लागू होते हैं । लागू कोमल दबाव notochord हानिकारक से बचने के लिए ।
- माइक्रोस्कोप के तहत खोदी गई फिन कल्पना और microscalpel ब्लेड (चित्रा 2a) की नोक के शीर्ष पर टुकड़ा की स्थिति । फिल्टर कागज का एक छोटा सा टुकड़ा की सतह पर फिन युक्त microscalpel प्लेस ।
नोट: transected ऊतक में melanocytes की उपस्थिति के कारण, इस कदम के एक छोटे से काले स्थान (चित्रा बी) के रूप में फिन के दृश्य की अनुमति देता है । - कैंची और चिमटी (चित्रा 2c) का उपयोग करना, एक ९६-well पीसीआर प्लेट के लिए फिन युक्त फिल्टर पेपर हस्तांतरण, ५० मिमी NaOH समाधान प्रति अच्छी तरह से 25 μL (चित्रा 2d) युक्त.
- एक फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली तैयार, पीसीआर प्लेट के लेबल के अनुसार अच्छी तरह से क्रमांकन । ताजा 1x E3 भ्रूण मीडिया के २०० µ एल से भरा संशोधित P1000 पिपेट का प्रयोग, ध्यान से zebrafish कोमल दबाव का उपयोग लार्वा इकट्ठा । ९६-well टिशू कल्चर प्लेट में लार्वा वितरण, पीसीआर प्लेट के रूप में ही अच्छी तरह से संख्या में (चित्रा 2E).
- सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर काग़ज़ समाधान (चित्र 2F) में अच्छी तरह से जलमग्न है । microscapel के ब्लेड साफ और प्रत्येक कट के बीच चिमटी इसे ७०% ेतोः समाधान में सूई से पार संक्रमण को रोकने के लिए । साफ कागज के ऊतकों के साथ ब्लेड पोंछ/
- दोहराएं चरण २.१-२.७ जब तक सभी भ्रूण काटा गया है ।
- पादी की पहचान की गई है जब तक 28 डिग्री सेल्सियस पर ९६-well थाली में लार्वा की दुकान ।
नोट: भ्रूण मीडिया को बदलने की जरूरत नहीं है, क्योंकि प्रोटोकॉल आसानी से कम 2 दिनों में पूरा किया जा सकता है । अधिक समय की आवश्यकता है, तो एक मीडिया परिवर्तन अनुशंसित है ।
3. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण
- ९६-खैर पीसीआर प्लेट सील और 1 मिनट के लिए १,००० x g पर नमूने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी फिल्टर कागजात NaOH समाधान के भीतर जलमग्न हो रहे है बनाने के लिए ।
- ऊतक lysis के लिए, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करने के बाद 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में नमूनों गर्मी ।
- प्रत्येक नमूने के लिए ५०० मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.० के 6 μL जोड़ें । भंवर.
- संक्षेप में १,५०० x g पर थाली केंद्रापसारक, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
- पीसीआर रिएक्शन के प्रति डीएनए supernatant का १.५ μL इस्तेमाल करें ।
- लार्वा जीनोटाइप करने के लिए एक पीसीआर तैयार करें, जैसा कि टेबल 1-2में दिखाया गया है ।
नोट: इस प्रोटोकॉल दो अनुप्रयोगों के लिए परीक्षण किया गया था: मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रियाओं agarose जैल9का उपयोग कर जीनोटाइप खुलासा, और heteroduplex पिघलने परख (HMA) पादी जेल polyacrylamide (पृष्ठ)17का उपयोग ट्रो खुलासा ।
4. वैकल्पिक जीनोमिक निष्कर्षण एक Chelating राल का उपयोग
- एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए काटा हुआ पंख के साथ फिल्टर कागज जोड़कर पूरा कदम २.५, 5% chelating राल के 30 μL युक्त (styrene-divinylbenzene copolymer युक्त युग्मित iminodiacetate आयनों).
नोट: राल के इस प्रकार सामांयतः ऊतक lysis और पीसीआर तैयार डीएनए की तैयारी के लिए एक तेज और कुशल तरीके से18में प्रयोग किया जाता है । - संकेत के रूप में २.६-२.८ चरणों का पालन करें ।
- ९६-खैर पीसीआर प्लेट सील और संक्षेप में यह सुनिश्चित करें कि सभी फिल्टर कागज chelating राल के भीतर जलमग्न है बनाने के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
- ऊतक lysis के लिए, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस को ठंडा करने के बाद 15 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में नमूनों गर्मी ।
नोट: इस कदम lysis और बाद में डीएनए और आरएनए समाधान में रहते हैं, जबकि सेलुलर घटकों के लिए ध्रुवीय राल मोतियों की बाइंडिंग की अनुमति देता है । - संक्षेप में राल मोतियों की गोली और निलंबन में डीएनए प्राप्त करने के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
- genotyping प्रक्रिया को पूरा करने के लिए ३.५-३.६ चरणों का पालन करें ।
5. आवेदन 1: मल्टीप्लेक्स पीसीआर Agarose जेल विश्लेषण द्वारा पीछा किया
- तालिका 1के बाद, homozygous म्यूटेंट, heterozygotes और WT लार्वा के बीच भेदभाव को सक्षम करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें । 3 टेबलमें वर्णित सायक्लिंग शर्तों का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए एक ९६-well थर्मल साइकिल चालक का प्रयोग करें ।
नोट: पीसीआर प्रतिक्रियाओं किसी भी अंय पारंपरिक पीसीआर थर्मल साइकिल चालक में भी किया जा सकता है । इस उदाहरण पेना, एट अल द्वारा प्रयुक्त पीसीआर रणनीति का वर्णन करता है । 9 aldh7a1 WT और 5-बीपी बिंद उत्परिवर्ती alleles की पहचान करने के लिए एक ही मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया में । - सोडियम बोराटे बफर में 1% agarose जेल, 1x GelRed के साथ दाग तैयार करें ।
नोट: 20x सोडियम बोराटे बफर स्टॉक 10 एम NaOH, ddH2ओ के १८०० मिलीलीटर के ४० मिलीलीटर से बना है, पीएच बोरिक एसिड की ७६ जी के साथ ८.५ के लिए समायोजित और फिर 2 एल अंतिम ddH2ओ का उपयोग कर मात्रा को पूरा किया । - २५० V पर 15 मिनट के लिए 1x सोडियम बोराटे बफर में जेल चलाएं । प्रक्रिया की सुविधा के लिए, यदि संभव हो, मल्टीचैनल pipets के साथ संगत है जो एक जेल सिस्टम का उपयोग करें नमूनों को लोड करने के लिए समय को कम करके उच्च प्रवाह क्षमताओं को सक्षम करने के लिए ।
- छवि पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत जेल अलग पादी के भेदभाव की अनुमति के लिए ।
6. आवेदन 2: Heteroduplex पिघलने परख
- तैयार पेज 12% जैल १.५ mm स्पेसर प्लेट और 15 नमूने कंघी का उपयोग कर । १२.२१ मिलीलीटर ddH2O, 10x Tris/बोराटे/EDTA (TBE), 30% acrylamide, २५० μL के 10% अमोनियम persulfate (ए पी एस) और 20 μL के tetramethylethylenediamine (TEMED) के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर दो पृष्ठ जैल तैयार करें । उपयोग 1x TBE बफर (०.०८९ मीटर Tris-एचसीएल, ०.०८९ एम बोरिक एसिड और ०.००२ मीटर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) के रूप में चल रहे बफर ।
- 5 मिनट के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पादों गर्मी ।
- बर्फ पर ट्यूबों ठंडा या thermocycler में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ।
- प्रति पीसीआर नमूना 10 μL लोड और आण्विक वजन मार्कर के 8 μL ।
- 1 ज के लिए एक ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली का उपयोग कर या आणविक भार मार्कर लगभग कांच की थाली के पैर लाइन तक पहुंच जाता है जब तक 1x TBE में १५० V पर पृष्ठ भागो ।
- छवि यूवी प्रकाश के तहत जेल अलग पादी के भेदभाव की अनुमति के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
protocoll की दक्षता एक heterozygous पार (aldh7a1+/ot100के वंश genotyping द्वारा प्रदर्शित किया गया था, यहां aldh7a1 के रूप में दिखाया+/-) (3 अंक-सी)9। aldh7a1ot100उत्परिवर्ती एलील zebrafish aldh7a1 जीन है कि frameshift और नुकसान की ओर जाता है की पहली कोडिंग एक्सॉन में एक 5-आधार जोड़ी (बीपी) प्रविष्टि है एक जल्दी बंद करो codon9के कारण समारोह । चार प्राइमरों एक मल्टीप्लेक्स की प्रतिक्रिया में इस्तेमाल के लिए तीन विशिष्ट बैंड WT, heterozygous (aldh7a1+/-), और homozygous उत्परिवर्ती (aldh7a1-/-) पादी (पेना, एट अल से) के बीच अंतर प्राप्त करने के लिए किया गया । 9): Gen1_FW 5 '-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ', "Gen2_RV": 5 '-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ', "5 nt-ins-specific_FW": 5 '-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ', और "WT-specific_RV": 5 '-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ') । Gen1_FW और Gen1_RV प्राइमरों का उपयोग दोनों alleles के प्रवर्धन एक ४३४-बीपी amplicon के परिणामस्वरूप । एक २९३-बीपी बैंड उत्परिवर्ती एलील के विशिष्ट प्रवर्धन से उठी, और एक १९५-बीपी बैंड विशेष रूप से WT एलील के लिए प्राप्त किया गया था, जैसा कि 3ए में दिखाया गया है । पीसीआर के बाद, 8 µ एल प्रत्येक 20 µ l प्रतिक्रिया की मात्रा एक 1% agarose/सोडियम बोराटे जेल पर विश्लेषण किया गया था, जैसा चित्र 3 बीमें दिखाया गया है । पर्याप्त लार्वा डीएनए नमूनों की ९८% (एन = ५७६) से वसूली गई, जिसके परिणामस्वरूप एक उच्च पीसीआर दक्षता दर पाई गई । डीएनए निष्कर्षण NaOH तकनीक का उपयोग औसत ४.७ ०.५ एनजी/µ एल के नमूने प्रति लार्वा डीएनए के पंख बायोप्सी प्रक्रिया के बाद में, ~ 30 µ l मात्रा में प्राप्त करता है । डीएनए एक समान उपज में chelating राल परिणामों का उपयोग कर निष्कर्षण, औसत ३.८ ०.५ एनजी/नमूना प्रति डीएनए के µ एल । लार्वा फिन transections से एकत्र डीएनए की यह मात्रा पादी की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के पीसीआर तैयार जीनोमिक डीएनए उत्पन्न करता है । प्रत्येक डीएनए नमूने ˜ 30 पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रवर्धन उत्पादों का उपयोग कर प्राप्त प्राइमरों Gen1_FW और Gen2_RV भी sequencing अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता9, जो सफलतापूर्वक homozygous म्यूटेंट में 5-बीपी प्रविष्टि की पहचान (aldh7a1-/ ). इस आवेदन के लिए पीसीआर उत्पादों उपयुक्त थे, तो परीक्षण करने के लिए एक बाहरी सेवा के माध्यम से सैंज अनुक्रमण किया गया था । agarose-जेल पुष्टि homozygous म्यूटेंट और WTs (n = 3 प्रत्येक) से डीएनए नमूने का इस्तेमाल किया गया । उच्च Phred19 स्कोर (> 30) उच्च गुणवत्ता का संकेत प्राप्त किया गया पढ़ता है, पहले और पिछले ४० आधार जोड़े को छोड़कर ।
इस प्रोटोकॉल बाद में heteroduplex पिघलने विश्लेषण द्वारा विभिंन अंय zebrafish उत्परिवर्तनों जीनोटाइप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । alleles जीन के plpbpot101 और plpbpot102 उत्परिवर्ती plpbp (फिगर 4a-डी) एक frameshift और जल्दी रोक codon के लिए प्रत्येक नेतृत्व । plpbp-अशक्त zebrafish लार्वा की पहचान के लिए दो प्राइमरों में उत्परिवर्तन स्थल (plpbp-एफ 5 '-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 ' और plpbp-आर 5 '-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3 ') सहित पहली कोडिंग एक्सॉन को बढ़ाना इस्तेमाल किया गया । WT पशुओं में plpbp टुकड़ा के प्रवर्धन एक २७२-बीपी amplicon (homoduplex) में परिणाम है । plpbpot101 (4-बीपी विलोपन एलील, चित्रा 4c) से प्राप्त amplicon २६८-बीपी के एक टुकड़े के होते है और कि plpbpot102 के (5bp-प्रतिस्थापन, 2-बीपी विलोपन एलील, चित्रा 4d), २७०-बीपी, के रूप में चित्र 4a-Bमें देखा । विकार और एनीलिंग के बाद, heterozygous पशुओं से पीसीआर टुकड़े heteroduplex और homoduplex डीएनए17शामिल होंगे । Homoduplex और heteroduplex बैंड आसानी से अलग किया जा सकता है और polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) का उपयोग कर visualized । मिलान और बेमेल डीएनए के बीच एक खुले कोण की उपस्थिति अपूर्ण एनीलिंग की वजह से उत्परिवर्तनों की घटना के कारण किस्में heteroduplex डीएनए homoduplex डीएनए17से एक काफी धीमी गति से स्थानांतरित करने के लिए कारण । अलग प्रवास पैटर्न अलग उत्परिवर्तनों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । heterozygous पादी (plpbp+/ot101, plpbp+/ot102) इसलिए heteroduplex डीएनए अंशों को प्रदर्शित करेगा, साथ ही यौगिक heterozygous (plpbpot101/ot102) (चित्रा 4a-बी) । सटीक genotyping इस heteroduplex पिघलने परख द्वारा प्राप्त की है के रूप में एक अद्वितीय पृष्ठ पैटर्न प्रत्येक जीनोटाइप और विशिष्ट heterozygous उत्परिवर्तनों के लिए प्राप्त किया जाता है visualized (4a-बीचित्र) हो सकता है। Homozygous म्यूटेंट पृष्ठ जेल में एक homoduplex पैटर्न प्रदर्शित होता है और इसलिए WTs के लिए अलग हो सकता है । इन पादी को अलग करने के लिए, पृष्ठ जेल विश्लेषणों का एक और दौर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जिसमें WT alleles से पीसीआर उत्पादों को नमूनों के साथ मिश्रित किया जाना चाहिए, जैसा कि17कहीं वर्णित है ।
WT और heterozygous भ्रूण के बारे में ९०% (88/98) सफलतापूर्वक वयस्कता के लिए उठाया गया (> 2 महीने) । के रूप में aldh7a1 और plpbp के नुकसान-समारोह म्यूटेंट कि एक प्रारंभिक मौत phenotype, अनुपचारित पशुओं वयस्कता को नहीं उठाया जा सकता है प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि, सभी जीवित WT और heterozygous वयस्कों के पादी लार्वा पंख कतरन परिणामों के समान थे, पादी फिन बायोप्सी प्रक्रिया का उपयोग लार्वा की पहचान के लिए एक १००% सटीकता दर का संकेत है ।
चित्र 1. लार्वा फिन क्लिप. (क). गैर-गंभीर लार्वा फिन तीन दिन बाद निषेचन (dpf) । रेखा transection की साइट का प्रतिनिधित्व करता है, वर्णक अंतराल के भीतर स्थित है । काले arrowhead caudal रक्त परिसंचरण की सीमा को दर्शाता है । (ख). लार्वा 3 dpf पर फिन कतरन प्रक्रिया के बाद । (C). लार्वा zebrafish पंख पुनर्वृद्धि पर 5 dpf. एक blastemal गठन से फिन पुनर्जनन केवल 2 दिन बाद फिन transection मनाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. लार्वा फिन कतरन के लिए प्रक्रिया । (क). लार्वा टेप पर रखे गए हैं और अतिरिक्त भ्रूण मीडिया हटा दिया जाता है. माइक्रोस्कोप के तहत, फिन के रूप में चित्र 1aमें दिखाया वर्णक अंतर के क्षेत्र में transected है । एक microscalpel का उपयोग करना, फिन एकत्र और एक फिल्टर कागज सतह पर बस स्पर्श (ख) द्वारा रखा जाता है, और आसानी से एक काला स्थान के रूप में visualized किया जा सकता है । फिन युक्त फिल्टर पेपर का टुकड़ा पकड़ो और एक छोटे से वांछित क्षेत्र (सी) आसपास के वर्ग में कटौती । फिल्टर कागज के छोटे टुकड़े एक अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट (डी) के एक कुआं में फिन युक्त प्लेस । इसी लार्वा भ्रूण मीडिया (ई) के २०० µ एल में एक फ्लैट नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली के इसी अच्छी तरह से रखा जाना चाहिए । फ़िल्टर काग़ज़ का टुकड़ा lysis समाधान (F) में जलमग्न होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. लार्वा फिन बायोप्सी से aldh7a1 heterozygous क्रॉस की Genotyping. (क). अपेक्षित परिणाम जहां दोनों WT और aldh7a1ot100 alleles परिणाम में एक ४३४-बीपी amplicon का प्रवर्धन । एक २९३-बीपी बैंड उत्परिवर्ती एलील (aldh7a1ot100, 5-बीपी प्रविष्टि) के प्रवर्धन से उठता है, और एक १९५-बीपी बैंड WT एलील के लिए प्राप्त की है । (ख) aldh7a1 लार्वा फिन ऊतकों से पीसीआर प्रवर्धन का उदाहरण. एक 1 kb आणविक भार मार्कर लेन 7 में दिखाया गया है । गलियाँ 1-6 प्रत्येक एक फिन बायोप्सी प्रतिनिधित्व करते हैं । पीसीआर परिणाम पहचानें aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) पादी (लेन 1), aldh7a1+/- heterozygous पादी (aldh7a1+/ot100) (फि ल्म 3, 4, और 5) और WT ( aldh7a1+/ पादी (फि ल्म 2 और 6) । (ग). अनुक्रम WT और aldh7a1ot100 एलील 5-बीपी प्रविष्टि उत्परिवर्तन की स्थिति दिखा रहा है के बीच संरेखण । यह आंकड़ा पेना एट अल के पूरक चित्रा 5 से अनुकूलित किया गया था । 9 अमेरिका की आनुवंशिकी सोसायटी से अनुमति के साथ दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4. Genotyping plpbp यौगिक heterozygous (2 बीपी हटाव/लार्वा फिन बायोप्सी से 4 बीपी हटाव/ (क). अपेक्षित परिणाम जहां WT एलील का प्रवर्धन एक २७२-बीपी amplicon के परिणामस्वरूप । 4-बीपी विलोपन एलील (plpbpot101) और 2-बीपी विलोपन एलील (plpbpot102) के साथ 5-बीपी प्रतिस्थापन क्रमशः २६८-बीपी और २७०-बीपी की amplicon लंबाई का उत्पादन । एक heteroduplex एक WT एलील और उत्परिवर्ती एलील के बीच एक heterozygous जीनोटाइप में बना है (plpbp+/ एक बेमेल alleles के कारण heteroduplex के गठन WT homoduplex की तुलना में जेल के भीतर बैंड के मंदता का कारण होगा । (ख). पीसीआर एक plpbp+/ot101x plpbp+/ot102 पार के वंश के लार्वा फिन कतरनों से उत्पंन प्रवर्धन । एक 1 kb आणविक भार मार्कर लेन 1 में दिखाया गया है । गलियाँ 2-10 प्रत्येक एक फिन बायोप्सी प्रतिनिधित्व करते हैं । पीसीआर परिणाम की पहचान उत्परिवर्ती पादी (plpbp-अशक्त यौगिक heterozygous plpbpot101/ot102, गलियाँ 2, 4, और 8), heterozygous पादी (फि ल्म 3, 6, 7, 9, और 10) और WT पादी (लेन 5) । (ग). अनुक्रम WT और plpbpot101 4-बीपी विलोपन उत्परिवर्तन की स्थिति दिखा एलील के बीच संरेखण । (घ). अनुक्रम WT और plpbpot102 एलील के बीच संरेखण 2-बीपी विलोपन और 5-बीपी प्रतिस्थापन (बोल्ड) की स्थिति दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| घटक | २० μl प्रतिक्रिया | १०० प्रतिक्रियाओं | अंतिम. |
| Nuclease-फ्री एच२ओ | ७.४५ μL | ७४५ μL | |
| Go-Taq 2x (मेगा, M7122) | 10 μL | १००० μL | 1x |
| प्राइमरी Gen1_FW | ०.२५ μL | 25 μL | ०.१२५ माइक्रोन |
| प्राइमर 5 nt-ins-specific_FW | ०.३ μL | 30 μL | ०.१५ माइक्रोन |
| प्राइमरी Gen2_RV | ०.२५ μL | 25 μL | ०.१२५ माइक्रोन |
| प्राइमरी WT-specific_RV | ०.२५ μL | 25 μL | ०.१२५ माइक्रोन |
| डीएनए | १.५ μL | -- |
तालिका 1. इस प्रोटोकॉल में aldh7a1 एलील के लिए प्रयुक्त मल्टीप्लेक्स पीसीआर के लिए रिएक्शन शर्तें । प्राइमरों का इस्तेमाल इस प्रकार हैं: Gen1_FW 5 '-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ', "Gen2_RV": 5 '-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ', "5 nt-ins-specific_FW": 5 '-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ', और "WT-specific_RV": 5 '-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ' । प्राइमरी स्टॉक्स में 10 µ एम थे ।
| घटक | १३ μl प्रतिक्रिया | १०० प्रतिक्रियाओं | अंतिम. |
| एच२ओ | ३.२५ μL | ३२५ μL | |
| Go-Taq 2x (मेगा, M7122) | ६.२५ μL | ६२५ μL | 1x |
| प्राइमर परिवार कल्याण | 1 μL | १०० μL | ०.७७ माइक्रोन |
| प्राइमरी RV | 1 μL | १०० μL | ०.७७ माइक्रोन |
| डीएनए | १.५ μL | -- |
तालिका 2. इस प्रोटोकॉल में plpbp एलील के लिए प्रयुक्त पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया शर्तों । फॉरवर्ड प्राइमरी का इस्तेमाल PLPBP-एफ 5 '-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 ' और रिवर्स, PLPBP-आर 5 '-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3 ' में हुआ था । प्राइमरी स्टॉक्स में 10 µ एम थे ।
| सायकल स्टेप | Temp. | समय | चक्र |
| प्रारंभिक विकार | ९५ ° c | 3 min | 1 |
| Denaturing | ९५ ° c | 30 सेकंड | ३६ |
| एनीलिंग | X ° c | 30 सेकंड | |
| एक्सटेंशन | ७२ ° c | 20 सेकंड kb/ | |
| अंतिम विस्तार | ७२ ° c | 5 min | 1 |
| 4 ° c | पकड़ |
तालिका 3. पीसीआर शर्तों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जीन संपादन उपकरण ठीक पिछले वर्षों में zebrafish में उत्परिवर्तनों और transgenes शुरू करने के लिए नियोजित किया गया है5,6,7,8। जब zebrafish में रोग मॉडलिंग प्रदर्शन, जल्दी लार्वा या किशोर phenotypes अक्सर9,12,13,14मनाया जाता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में छोटे zebrafish लार्वा टेल बायोप्सी से पीसीआर तैयार डीएनए की निकासी का वर्णन है, जो 3 dpf के रूप में लार्वा के genotyping को सक्षम करता है । पादी की प्रारंभिक पहचान कई प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब पोस्ट हॉक genotyping9संभव नहीं है । एक प्रारंभिक उंर से पादी जानने के भी अस्तित्व के अध्ययन और म्यूटेंट के phenotypic विश्लेषण की सुविधा । यह प्रोटोकॉल भी विशेष रूप से परिपक्वता के लिए विशिष्ट पादी के लार्वा की स्थापना के लिए उपयोगी है । लार्वा genotyping अभी तक व्यापक रूप से दुनिया भर में zebrafish प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल नहीं किया है और इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इस तकनीक के प्रसार की सुविधा है । जबकि transected पंख जोड़ तोड़, इस विधि का उपयोग नमूना के भीतर डीएनए की उपस्थिति के लिए के रूप में विश्वास प्रदान करता है; फिन बायोप्सी आसानी से हैंडलिंग प्रक्रिया भर में फिल्टर पेपर पर एक अंधेरी जगह के रूप में visualized किया जा सकता है । यह Wilkinson एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है । 16.
प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण चरणों गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए ठीक से पालन किया जाना चाहिए । और सबसे पहले, लार्वा फिन के transection वर्णक अंतराल के भीतर होने चाहिए, रक्त परिसंचरण की सीमा के बाहर, खून बह रहा से बचने के लिए । यह पंख बायोप्सी के दौरान लार्वा की उत्तरजीविता सुनिश्चित करता है । इसके अलावा, फिल्टर कागज पर एक काले डॉट, फिन के स्थान अंकन, NaOH समाधान में फिल्टर कागज रखने से पहले मनाया जाना चाहिए । यह एक नमूना अच्छी तरह से पंख ऊतक (और इसलिए, डीएनए) की उपस्थिति का आश्वासन दिया । फिल्टर कागज भी सेल lysis और सफल डीएनए निष्कर्षण की गारंटी के लिए NaOH समाधान के भीतर डूब जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल की तुलना में छोटी उंर के लिए परीक्षण नहीं किया गया 3 dpf के रूप में ही रची लार्वा का इस्तेमाल किया गया । छोटे भ्रूण जीनोटाइप करने के लिए (unहैच < 3 dpf) चोरियों को हटाने की आवश्यकता होगी । मामले में है कि अपर्याप्त पीसीआर प्रवर्धन होता है, मानक पीसीआर अनुकूलन रणनीतियों लागू किया जाना चाहिए (जैसे, प्राइमर एकाग्रता बदलती, एनीलिंग तापमान, और/ हालांकि पर्याप्त डीएनए सफलतापूर्वक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के कई प्रकार के प्रदर्शन के लिए निकाला जाता है (जैसा कि aldh7a1 और plpbp genotyping उदाहरण के लिए दिखाया गया है), डीएनए की एकाग्रता इस पंख कतरन प्रक्रिया के बाद प्राप्त की छोटी है (~ 5 एनजी/µ एल प्रति नमूना) और इस प्रकार, पीसीआर प्रतिक्रिया में डीएनए की एकाग्रता में वृद्धि प्रवर्धन की अधिक से अधिक सफलता के लिए अनुमति दे सकता है ।
लार्वा फिन इस प्रोटोकॉल के साथ निकाले डीएनए कई प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लार्वा zebrafish पादी की सटीक पहचान की अनुमति है और एक उच्च प्रवाह तरीके से । एक heteroduplex पृष्ठ जैल में पिघलने परख के लिए अलग17उत्परिवर्तनों की पहचान किया जा सकता है । यह देखते हुए कि ~ डीएनए के 30 μL नमूना प्रति प्राप्त की है, और ~ 1-१.५ डीएनए के μL प्रति पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग किया जाता है, लगभग 30 पीसीआर प्रतिक्रियाओं निकाले नमूना प्रति चलाया जा सकता है । पीसीआर उत्पादों भी सैंज अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं; पढ़ता के उच्च गुणवत्ता प्राप्त किया गया, aldh7a1के लिए WT और homozygous उत्परिवर्ती दृश्यों की सटीक पुष्टि की अनुमति । जीनोमिक-लार्वा zebrafish से डीएनए निष्कर्षण अनुसंधान में कई आवेदन किया है । इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए मूल लक्ष्य को प्रभावी ढंग से जीनोटाइप लार्वा है कि aldh7a19में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के कारण वयस्कता तक पहुंच नहीं कर सकते थे । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सक्षम पादी के अलगाव और मिर्गी के प्रेक्षण से जुड़े phenotypes में विशेष रूप से aldh7a1-/ मछली लार्वा चरण से आगे9। आरएनए निष्कर्षण या metabolite निष्कर्षण जैसे दृष्टिकोण के लिए प्रत्येक जीनोटाइप के लार्वा का पूलिंग सही ढंग से genotyping के बाद इस लार्वा फिन कतरन प्रक्रिया9का उपयोग कर मार डाला जा सकता है । अंत में, प्रशिक्षण की एक छोटी अवधि के बाद, एक अनुभवी अन्वेषक इस सरल और समय कुशल प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं, केवल न्यूनतम और सस्ती रिएजेंट की आवश्यकता होती है, नियमित रूप से प्रति दिन फिन क्लिप के सैकड़ों प्रदर्शन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभव बनाया अनुसंधान पेना एट अल द्वारा वर्णित है । और उंमीद है कि व्यापक Zebrafish समुदाय के लिए एक समान उद्देश्य की सेवा करेंगे ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखक दुर्लभ रोग मॉडल और तंत्र (RDMM) नेटवर्क का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा (स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) और जीनोम कनाडा के कनाडाई संस्थानों द्वारा वित्त पोषित) । CK एक UROP छात्रवृत्ति पुरस्कार (ओटावा विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित है । DLJ एक वाणी कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । आईएपी एक कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) postdoctoral फैलोशिप पुरस्कार के संस्थानों द्वारा समर्थित है । लेखक इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित करने की अनुमति देने के लिए और पेना, एट अलसे पूरक चित्रा 5 के एक अनुकूलन का उपयोग करने के लिए अमेरिका के जेनेटिक्स सोसायटी धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
