Summary
Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.
Abstract
Peixe-zebra (Danio rerio) possuem orthologues para 84% dos genes conhecidos por serem associados com doenças humanas. Além disso, estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões. Avanços recentes no gene ferramentas de edição estão permitindo introdução precisa de mutações e de transgenes no zebrafish. Doença de modelagem no zebrafish frequentemente leva a fenótipos larvas e morte prematura, que pode ser um desafio para interpretar se genótipos são desconhecidos. Esta identificação precoce de genótipos é também necessário em experimentos que requerem pooling de amostra, tal como em estudos de espectrometria de expressão ou massa de gene. No entanto, extensa seleção genotípica é limitada pelos métodos tradicionais, que na maioria dos laboratórios são realizados somente em zebrafish adulto ou em larvas pós-morte. Resolvemos este problema, adaptando um método para o isolamento do DNA genômico de PCR-pronto de larvas de zebrafish ao vivo que pode ser alcançado logo em fertilização pós de 72 h (hpf). Desta vez e cost-effective técnica, melhorado a partir de um protocolo de genotipagem publicado anteriormente, permite a identificação de genótipos de biópsias de barbatana microscópica. As barbatanas regeneram rapidamente como as larvas se desenvolvem. Pesquisadores podem então selecionar e elevar os genótipos desejados para a vida adulta, utilizando este procedimento baseados em PCR genotipagem elevado-throughput.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo de vertebrados amplamente utilizado como um modelo para investigação de doença, bem como para testes pré-clínicos de hipóteses terapêuticas1,2,3. Estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões4. Através do crescente desenvolvimento do romance transgénico e gene edição tecnologias como zinco-dedo nucleases (ZFN)5, TAL como efetoras Nucleases (TALENs)6,7e o cluster regularmente intercaladas curto Palindromic repete (CRISPR) / CRISPR-associado 9 (Cas9) sistema8, o zebrafish está prestes a melhorar substancialmente a compreensão das várias condições patológicas. Essas tecnologias têm sido utilizadas para criar alvo nocautes em ambos somáticas e células da linha germinal no zebrafish, eficientemente, engendrando geneticamente modificado animais8. Exemplos recentes na literatura incluem o desenvolvimento bem sucedido de modelos genéticos de epilepsia e distúrbios metabólicos no zebrafish3,9,10,11,12 .
Com os progressos alcançados na edição de genoma de zebrafish, rápida e confiável de genotipagem tornou-se um inegável passo limitante. Identificação de mutações específicas de DNA adjacentes ao local de destino do genoma-edição prevista é uma etapa essencial do protocolo. Tradicionalmente, técnicas de genotipagem por recorte de barbatana são geralmente apenas realizada no zebrafish juvenil ou adulto. No entanto, o tempo gasto zebrafish levantando até a idade adulta (> 2 meses) atrasa consideravelmente os avanços na pesquisa. Em muitos casos, à idade adulta não pode ser realizada devido o nocaute de genes essenciais (por exemplo, na modelagem de doença) ou mutações de ganho-de-função, levando a efeitos fenotípicos prejudiciais. Além disso, vários ensaios exigem a conjugação de larvas, como na extração de RNA ou metabólito e, portanto, envolvem a prévia identificação de genótipos, que pode ser um desafio quando único post hoc técnicas de genotipagem estão disponíveis. Estes exemplos acima mencionados realçar a importância das técnicas de genotipagem larval que são ao mesmo tempo preciso e permitem a recuperação completa e normal desenvolvimento das larvas. Genotipagem de zebrafish fase precoce atualmente parece não ser amplamente utilizado; Isto é refletido por publicações recentes de modelos de doenças em que larval genótipos são identificados através de post-mortem genotipagem, ao invés de genotipagem antes da realização do experimento12,13,14. Neste trabalho, uma estratégia de clip de barbatana larval é apresentada com o objetivo de melhorar os procedimentos de genotipagem previamente estabelecidas.
No passado, estratégias empregando digestão de proteinase K ao genótipo live zebrafish larvas conduziram a polimerase variável de eficiência de reação em cadeia (PCR)15. Embora mais recentemente publicou a técnica de biópsia microscópica cauda fornecida mais promissores resultados16, nós e outros grupos não foram capazes de reproduzir a alta eficiência e recuperação do DNA relatado pelos autores. Um grande revés do protocolo descrito por Wilkinson et al . 16 pode ser a transferência do tecido cauda para o tubo do PCR. Devido ao seu tamanho microscópico, é difícil garantir que a barbatana foi devidamente recolhida e dispensada por pipetagem. Para resolver esta barreira, nós desenvolvemos um protocolo melhorado para grandes números de genotipagem de larvas de zebrafish ao vivo com quase 100% de eficiência de9. Usando um microscalpel, a ponta da cauda a nadadeira é removida e colocada em um pedaço de papel de filtro. O pedaço de papel de filtro contendo o tecido pode ser facilmente visualizado e correctamente colocado em um tubo PCR. Extração de DNA genômica é executada em seguida, seguido de amplificação por PCR da região de interesse para o genótipo a amostra. As vantagens deste método incluem uma alta eficiência do PCR, uma baixa taxa de falsos positivos e uma taxa de mortalidade baixa. Além disso, a genotipagem de um grande número de embriões é possível usando este protocolo. O protocolo descrito neste documento permite barbatana-recorte de centenas de larvas dentro de 2-3 h usando esta abordagem e a correcta identificação dos peixes do genótipo e cauda regeneração dentro de dois dias.
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Protocol
Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados e estão em conformidade com as orientações de cuidados com animais fornecidos pelo Conselho canadense no cuidado Animal e a Universidade de Ottawa comités de cuidados com animais.
1. preparação
- Prepare a superfície de dissecação gravando uma tampa do prato de Petri de 9 cm com fita de autoclave, toda a sua superfície interior. Posicione-o sob um estereoscópio.
- Coloque a pós-fertilização de 3-5 dias (dpf) zebrafish larvas em uma Petri prato e anesthetize em ˜1.5 mM metanosulfonato de embriões x E3 1 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4, pH 7,2).
- Corte a extremidade de uma ponta da pipeta P1000 com um par de tesouras ou uma lâmina de barbear para um diâmetro de 2 mm para acomodar uma larva de dpf 3 com o mínimo de estresse.
2. fin recorte de larvas de Zebrafish
- Pegar uma larva anestesiada usando a micropipeta P1000 modificada e colocar a larva de zebrafish para a fita de autoclave posicionado na tampa da caixa de Petri.
- Remova o excesso tricaina solução em torno da larva usando uma micropipeta. A área deve ser seca como possível com êxito seção e pegar a barbatana mas ainda molhada para garantir a sobrevivência.
- Usando um micro bisturi, seção barbatana caudal num microscópio estéreo-conforme indicado na Figura 1, conforme descrito em Wilkinson et al.16. Durante a incisão, aplica uma pressão firme dentro do site de lacuna de pigmento da barbatana caudal, distal ao limite da circulação de sangue (figura 1A). Aplique uma pressão suave para não danificar a notocorda.
- Visualize a barbatana secionada ao microscópio e posicione a parte sobre a ponta da lâmina da microscalpel (Figura 2A). Coloque o microscalpel contendo a barbatana para a superfície de um pequeno pedaço de papel de filtro.
Nota: Devido à presença de melanócitos no tecido necrosante, esta etapa permite visualização da nadadeira como uma pequena mancha preta (Figura 2B). - Usando uma tesoura e pinça (Figura 2), transferi o papel de filtro contendo a barbatana de um prato PCR de 96 poços, contendo 25 μL de solução de NaOH 50 milímetros por alvéolo (Figura 2D).
- Prepare uma placa de 96 poços de fundo plano, numeração do poço de acordo com a etiqueta da placa do PCR. Com a pipeta de P1000 modificada preenchida com 200 µ l de fresco 1 x E3 embriões, cuidadosamente colete a larva de zebrafish usando uma pressão suave. Dispense a larva na placa de cultura de tecidos de 96 poços, no mesmo número bem como a placa PCR (Figura 2E).
- Certifique-se de que o papel de filtro é bem submersa na solução (Figura 2F). Limpe a lâmina do microscapel e pinças entre cada corte para evitar a contaminação cruzada por mergulhando-o em solução de EtOH 70%. Limpe a lâmina com tecido de papel limpo e limpa.
- Repita os passos 2.1-2.7 até que todos os embriões foram cortados.
- Armazene as larvas da placa de 96 poços a 28 ° C, até que os genótipos foram identificados.
Nota: A mídia do embrião não precisa ser alterado, desde que o protocolo pode ser facilmente concluído em menos de 2 dias. Se é necessário mais tempo, recomenda-se uma mudança de mídia.
3. extração de DNA genômica
- Selo da placa PCR de 96 poços e centrifugar as amostras a 1.000 x g por 1 min certificar-se de todos os papéis de filtro são submersos dentro da solução de NaOH.
- Para lise de tecido, aqueça as amostras em um thermocycler a 95 ° C por 5 min, seguido de resfriamento a 4 ° C por 10 min.
- Adicione 6 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 para cada amostra. Vórtice.
- Brevemente, centrifugar a placa a 1.500 x g, durante 5 min à temperatura ambiente.
- Use 1,5 μL do sobrenadante DNA por reação de PCR.
- Prepare um PCR ao genótipo as larvas, como mostrado na tabela 1-2.
Nota: Este protocolo foi testado para duas aplicações: multiplex reações de PCR, revelando o genótipo utilizando géis de agarose9e doheteroduplex de derretimento do ensaio (HMA), revelando os genótipos usando gel de polyacrylamide electroforese (página)17.
4. alternativa genômica extração usando uma resina quelante
- Complete etapa 2.5 adicionando o papel de filtro com a barbatana recortada em uma chapa de PCR de 96 poços, contendo 30 μL de 5% quelantes resina (copolímero de estireno-divinilbenzeno contendo íons de iminodiacetate pareados).
Nota: Este tipo de resina é comumente usado para lise de tecido e preparação do DNA de PCR-pronto em uma maneira rápida e eficiente de18. - Siga os passos 2.6-2.8 conforme indicado.
- Selar a placa PCR de 96 poços e brevemente Centrifugar as amostras para certificar-se de que todo o papel filtro é submerso dentro da resina quelante.
- Para lise de tecido, aqueça as amostras em um thermocycler a 95 ° C por 15 min, seguido de resfriamento a 4 ° C por 10 min.
Nota: Este passo permite que Lise e posterior ligação dos grânulos polares resina para componentes celulares enquanto DNA e RNA permanecem em solução. - Brevemente Centrifugar as amostras para granular os grânulos de resina e obter o DNA na suspensão.
- Siga os passos para completar o processo de genotipagem de 3.5-3.6.
5. aplicação 1: Multiplex PCR seguida pela análise do Gel do Agarose
- A tabela 1, a seguir configurar uma reação de PCR multiplex para permitir a discriminação entre os mutantes homozigotos, heterozigotos e larvas WT. Use um termociclador 96 poços para realizar as reações de PCR usando ciclismo condições descritas na tabela 3.
Nota: As reações de PCR também podem ser realizadas em qualquer outro convencional PCR termociclador. Este exemplo descreve a estratégia PCR usada por Pena, et al 9 identificar aldh7a1 WT e alelos mutantes de inserção de 5-bp na mesma reação de multiplex. - Preparar um gel de agarose 1% em tampão de borato de sódio, corado com 1 x GelRed.
Nota: 20 x estoque de tampão de borato de sódio é feito de 40 mL de NaOH de M 10, 1800 mL de DDQ2O, pH ajustado para 8,5 com 76 g de ácido bórico e depois completou para volume final de 2 L usando ddH2O. - Funcione o gel em tampão de borato de sódio 1x por 15 min em 250 V. Para facilitar o processo, se possível, use um sistema de gel que é compatível com pipetas multicanais para habilitar os recursos de produtividade mais elevados, reduzindo o tempo para carregar amostras.
- Imagem do gel sob raios ultravioleta (UV) para permitir a discriminação de diferentes genótipos.
6. aplicação 2: Doheteroduplex ensaio de fusão
- Prepare página 12% géis usando a placa de espaçador de 1,5 mm e os pentes 15-amostras. Prepare dois géis de página usando 12,21 mL de DDQ2O, 2,52 mL de 10 x Tris/borato/EDTA (TBE), 10 mL de acrilamida 30%, 250 μL de persulfato de amónio de 10% (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Use 1 buffer de x TBE (0.089 M Tris-HCl, ácido bórico de 0,089 M e 0,002 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) como tampão em execução.
- Aqueça os produtos PCR a 94 ° C por 5 min.
- Legal os tubos em gelo ou a thermocycler durante 10 minutos a 4 ° C.
- Carrega 10 μL por amostra PCR e 8 μL de marcador de peso molecular.
- Execute a página 150 V em 1x TBE usando um sistema de eletroforese vertical por 1 h ou até que o marcador de peso molecular quase atinge a pé de linha da placa de vidro.
- Imagem do gel sob luz UV para permitir a discriminação de diferentes genótipos.
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Representative Results
A eficiência do protocolo foi demonstrada por genotipagem a prole de um cruzamento de heterozigoto (aldh7a1+ ot100, aqui mostrado como aldh7a1+ /-) (Figura 3A- C)9. O alelo mutante aldh7a1ot100tem uma inserção de pares de base 5 (bp) no primeiro exon codificação do zebrafish aldh7a1 gene que leva ao frameshift e perda de função devido a um início stop códon9. Quatro primeiras demão foram usadas em uma reação de multiplex para obter três bandas distintas para diferenciar entre WT, heterozigotos (aldh7a1+ /-) e genótipos homozigoto mutante (aldh7a1- / -) (da Pena, et al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' e"WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). A amplificação de ambos os alelos utilizando os primers Gen1_FW e Gen1_RV resultou em um amplicon 434-bp. Uma banda de 293-bp surgiu de amplificação específica do alelo mutante, e uma banda de 195-bp obteve-se especificamente para o alelo WT, conforme mostrado na Figura 3A. Após a PCR, 8 µ l de cada volume de reação 20 µ l foi analisada em um gel de borato de sódio agarose 1%, conforme mostrado na Figura 3B. Suficiente DNA larval foi recuperado de 98% (n = 576) das amostras, resultando em uma alta taxa de eficiência PCR. Extração de DNA utilizando a técnica de NaOH obtém em média 4,7 0,5 ng / µ l de DNA larval por seguir o procedimento de biópsia de barbatana, em volume de ~ 30 µ l de amostra. Extração de DNA usando resina quelante resulta em um rendimento similar, em média 3,8 0,5 ng / µ l de DNA por amostra. Esta quantidade de DNA coletado de transeções barbatana larval gera pronto para PCR de DNA genômico de qualidade suficiente para permitir a identificação de genótipos. Cada amostra de DNA pode ser usada em reações de amplificação do PCR ˜30. Produtos de amplificação obtidos usando as primeiras demão, Gen1_FW e Gen2_RV também podem ser usados para sequenciamento aplicações9, que identificou com sucesso a inserção de 5-bp nos mutantes homozigotos (aldh7a1- / -) (Figura 3 ). Sanger sequenciamento foi realizado através de um serviço externo para testar se os produtos PCR foram adequados para esta aplicação. Amostras de DNA de gel de agarose confirmaram homozigotos mutantes e WTs (n = 3 cada) foram utilizados. Pontuações mais altas PQV19 (> 30) foram obtidos indicando leituras de alta qualidade, excepto os primeiros e o últimos 40 pares de base.
Este protocolo foi posteriormente usada para genótipo várias outras mutações de zebrafish por doheteroduplex análise de fusão. Os alelos mutantes plpbpot101 e plpbpot102 do plpbp gene (Figura 4A-D) cada originar um frameshift e cedo códon de parada. A fim de identificar plpbp-larvas de zebrafish nula, duas primeiras demão foram utilizadas para amplificar o primeiro exon codificação, incluindo o local de mutação (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'e plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). A amplificação do fragmento plpbp em animais WT resulta em um amplicon 272-bp (homoduplex). Os amplicons obtidos de plpbpot101 (alelo 4-bp exclusão, Figura 4) consiste de um fragmento de 268-bp e a do plpbpot102 (5bp-substituição, alelo 2-bp exclusão, Figura 4), 270-bp, como visto na Figura 4A-B. Após desnaturação e recozimento, os fragmentos PCR de animais heterozigotos conteria de DNA doheteroduplex e homoduplex17. Bandas Homoduplex e doheteroduplex podem ser facilmente separadas e visualizadas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A presença de um ângulo aberto entre o combinado e incompatíveis de DNA causado pelo recozimento imperfeito devido à ocorrência de mutações causam a doheteroduplex DNA para migrar a um ritmo significativamente mais lento do que de DNA homoduplex17. Padrões de migração distintas são produzidos por mutações distintas. Os genótipos heterozigotos (plpbp+ ot101, plpbp+ ot102) exibiria, portanto, fragmentos de DNA de doheteroduplex, bem como o composto heterozigoto (plpbpot101/ot102) (Figura 4a-B). Precisa genotipagem é obtida por este doheteroduplex ensaio de fusão como um padrão único de página é obtido para cada genótipo e mutações distintas de heterozigotas podem ser visualizadas (Figura 4A-B). Homozigotos mutantes iria exibir um padrão homoduplex no gel página e, portanto, ser indistinguíveis a Sociedade Torre de vigia. Para distinguir estes genótipos, outra rodada de análises de gel de página deve ser executada em que produtos PCR de WT alelos precisa ser misturado com as amostras a ser estudado, conforme descrito em outro lugar17.
Cerca de 90% (88/98) do WT e embriões homozigóticos levantaram-se com êxito à idade adulta (> 2 meses). Como aldh7a1 e plpbp são mutantes de perda-de-função que exibem um fenótipo de morte precoce, animais não tratados não poderiam ser gerados até à idade adulta. No entanto, os genótipos de todos os sobreviventes do WT e adultos heterozigotos eram idênticos aos resultados de recorte larval barbatana, indicando uma taxa de precisão de 100% para a identificação de genótipos, usando o procedimento de biópsia de barbatana larval.
Figura 1. Clipe de barbatana larval. (A). barbatana larval não-cortada em pós-fertilização de três dias (dpf). A linha representa o site da transecção, localizado dentro do fosso de pigmento. A seta preta demonstra o limite o caudal da circulação de sangue. (B). procedimento de recorte no dpf 3 da aleta seguinte de Larva. (C). Larval zebrafish barbatana rebrota no dpf 5. Barbatana de regeneração de uma formação blastemal é observada a transecção de pós-barbatana apenas 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Procedimento para recorte de barbatana larval. (A). as larvas são colocadas sobre a fita e embriões em excesso é removido. Sob o microscópio, a barbatana é seccionada na região do diferencial do pigmento, como mostrado na figura 1A. Usando um microscalpel, a barbatana é coletada e colocada em um papel de filtro de superfície simplesmente pelo toque (B) e pode ser facilmente visualizado como uma mancha negra. Segure o pedaço de papel de filtro contendo a barbatana e corte um pequeno quadrado em torno da região desejada (C). Coloque o pequeno pedaço de papel de filtro contendo a aleta em um poço de um prato bem 96 (D). A larva correspondente deve ser colocada para a correspondente bem de uma placa de 96 poços de fundo plano em 200 µ l de embriões (E). O pedaço de papel de filtro deve ser submersa na solução de lise (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Genotipagem de aldh7a1 Cruz heterozigotos de biópsias de barbatana larval. (). Resultado esperado, onde a amplificação de alelos tanto WT e aldh7a1ot100 resulta em um amplicon 434-bp. Uma banda de 293-bp surge de amplificação do alelo mutante (aldh7a1ot100, inserção de 5-bp), e uma banda de 195-bp é obtida para o alelo WT. (B). amplificação por exemplo de PCR de tecidos de barbatana larval de aldh7a1 . Um marcador de peso molecular 1KB é mostrado na faixa 7. Faixas 1-6 representam uma biópsia única barbatana. Resultados PCR identificam aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genótipos (faixa 1), aldh7a1+ /- genótipos heterozigotos (aldh7a1+ ot100) (faixas 3, 4 e 5) e (WT aldh7a1+ +) genótipos (faixas 2 e 6). (C). alinhamento entre o WT sequenciado e alelo aldh7a1ot100 mostrando a posição da mutação 5-bp inserção. Esta figura foi adaptada da Figura 5 suplementar da Pena et al 9 com permissão da sociedade genética da America. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Genotipagem de plpbp composto heterozigoto (2 bp exclusão 4 bp exclusão) de biópsias de barbatana larval. (). Resultado esperado, onde a amplificação do alelo WT resultou em um amplicon 272-bp. O alelo de exclusão 4-bp (plpbpot101) e a substituição de 5-bp com o alelo de exclusão de 2-bp (plpbpot102) produzem amplicon comprimentos de 268-bp e 270-bp, respectivamente. Um doheteroduplex é formado entre um alelo WT e o alelo mutante em um genótipo heterozigoto (plpbp+ /-). Formação de um doheteroduplex devido ao descasamento alelos causará retardo da banda dentro do gel em comparação com o WT homoduplex. (B). amplificação por PCR resultantes de recortes de barbatana larval do filho de um plpbp+ ot101x plpbp+ ot102 Cruz. Um marcador de peso molecular 1KB é mostrado na pista 1. Faixa 2-10 representa uma biópsia única barbatana. Resultados PCR identificam genótipos mutantes (plpbp-heterozigotos compostos nula plpbpot101/ot102, faixas 2, 4 e 8), genótipos WT (faixa 5) e genótipos heterozigotos (faixas 3, 6, 7, 9 e 10). (C). alinhamento entre o WT sequenciado e alelo plpbpot101 mostrando a posição da mutação exclusão 4-bp. (D). alinhamento entre o WT sequenciado e alelo plpbpot102 mostrando a posição do 2-bp exclusão e substituição de 5-bp (negrito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes | Reação de 20 μl | 100 reações | Conc. final |
| Livre de nuclease H2O | 7,45 ΜL | 745 ΜL | |
| Ir-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| cartilha Gen1_FW | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| cartilha 5 nt-ins-specific_FW | 0.3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Cartilha Gen2_RV | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| Primeira demão WT-specific_RV | 0.25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabela 1. Condições de reação de multiplex PCR usado para o aldh7a1 alelo no presente protocolo. Os primers utilizados são os seguintes: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' e"WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Primeira demão as existências eram 10 µM.
| Componentes | Reação de 13 μl | 100 reações | Conc. final |
| H2O | 3.25 ΜL | ΜL DE 325 | |
| Ir-Taq 2 x (Promega, M7122) | ΜL 6,25 | 625 ΜL | 1 x |
| primeira demão FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0,77 ΜM |
| Primeira demão RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0,77 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabela 2. Condições de reação de PCR usado para plpbp alelo neste protocolo. O primer frente usado foi PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'e O reverso, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Primeira demão as existências eram 10 µM.
| Etapa do ciclo | Temp. | Tempo | Ciclos de |
| Desnaturação inicial | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Desnaturação | 95 ° C | 30 seg | 36 |
| Recozer * | X ° C | 30 seg | |
| Extensão | 72 ° C | 20 seg/kb | |
| Extensão final | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | Segure |
Tabela 3. Condições do PCR usadas neste protocolo.
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Discussion
Gene, ferramentas de edição têm sido empregadas precisamente introduzir mutações e transgenes no zebrafish ao longo dos últimos anos5,6,7,8. Ao executar a doença modelagem no zebrafish, cedo fenótipos larvais ou juvenis são frequentemente observados9,12,13,14. O protocolo aqui apresentado descreve a extração de DNA de PCR-pronto de zebrafish pequenas biópsias de cauda larval, permitindo a genotipagem de larvas tão jovens quanto 3 dpf. A identificação precoce de genótipos é crucial para várias aplicações de laboratório, especialmente quando post hoc genotipagem não é possível9. Saber genótipos desde tenra idade também facilita estudos de sobrevivência e análise fenotípica de mutantes. Este protocolo também é particularmente útil para a criação de larvas de genótipos específicos à maturidade. Genotipagem larval não é ainda amplamente utilizada em laboratórios de zebrafish em todo o mundo e este protocolo visa facilitar a divulgação desta técnica. Ao mesmo tempo manipulando as barbatanas necrosante, o uso desse método fornece confiança quanto a presença de DNA dentro da amostra; a biópsia de barbatana pode ser visualizada facilmente como uma mancha escura no papel filtro durante todo o processo de manipulação. Isto representa uma melhoria importante do protocolo publicado por Wilkinson et al . 16.
Vários passos críticos dentro do protocolo devem ser seguidos corretamente para obter resultados de qualidade. Primeiro e acima de tudo, a transecção da nadadeira larval deve ocorrer dentro da gap de pigmento, distal ao limite da circulação de sangue, para evitar sangramento. Isso garante a sobrevivência das larvas durante a biópsia de barbatana. Além disso, um ponto preto sobre o papel de filtro, marcando o posicionamento da nadadeira, deve ser observado antes de colocar o papel de filtro na solução de NaOH. Isto assegura a presença de tecido de barbatana (e, portanto, de DNA) em cada amostra bem. O papel de filtro também deve ser imerso dentro da solução de NaOH a garantia de sucesso extração de DNA e lise celular. Este protocolo não foi testado para idades mais jovens do que 3 dpf como apenas hachuradas larvas foram utilizadas. A mais jovens embriões genótipo (unhatched < 3 dpf) remoção córion seria necessária. No caso dessa amplificação por PCR insuficiente ocorre, estratégias de otimização padrão PCR devem ser aplicada (por exemplo, variando a concentração da primeira demão, recozimento a temperatura, e/ou concentração de DNA). Embora DNA suficiente é extraído para executar com êxito vários tipos de reações de PCR (como mostrado para exemplos de genotipagem de aldh7a1 e plpbp ), a concentração de DNA obtido após este procedimento de recorte de barbatana é pequena (~ 5 ng / µ l por amostra) e assim, aumentando a concentração de DNA na reação de PCR pode permitir maior sucesso de amplificação.
O barbatana larval DNA extraído com este protocolo pode ser usado para várias reações de amplificação, permitindo a identificação precisa de genótipos de zebrafish larval e em uma maneira de alta produtividade. Um doheteroduplex de derretimento do ensaio em géis de página pode ser usado para identificar diferentes mutações17. Dado que ~ 30 μL de DNA é obtido por amostra, e ~ 1-1,5 μL de DNA é usado por reação de PCR, aproximadamente 30 reações de PCR podem ser executadas por amostra coletada. Os produtos PCR também são adequados para aplicações de sequenciamento Sanger; obtiveram-se alta qualidade de leituras, permitindo a confirmação exata de WT e sequências mutantes homozigotos para aldh7a1. Extração de DNA genómico de zebrafish larval tem muitas aplicações na pesquisa. O objetivo original para desenvolver este protocolo foi efetivamente larvas de genótipo que não atingem a idade adulta devido a mutações específicas do aldh7a19. Além disso, este protocolo habilitado a segregação de genótipos e a observação dos fenótipos de epilepsia associada especificamente em aldh7a1- / - peixe desde a fase larval avante9. O pool de larvas de cada genótipo para abordagens tais como a extração do RNA ou extração de metabólito pode ser executado com precisão após a genotipagem utilizando esta nadadeira larval recorte procedimento9. Em conclusão, após um curto período de treinamento, um investigador experiente pode usar este protocolo tempo-eficiente e simples, exigindo somente reagentes mínimos e baixo custo, rotineiramente, realizar centenas de clipes de barbatana por dia. O uso deste protocolo tornou possível a pesquisa descrita por Pena et al e espero que vai servir a um propósito semelhante para a comunidade mais ampla de Zebrafish.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer aos modelos de doença rara e rede de mecanismo (RDMM) (financiado pelos institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR) e Canadá genoma). CK é suportado por um prêmio de bolsa UROP (Universidade de Ottawa). DLJ é apoiado por uma bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier. IAP é suportado por um prêmio de pós-doutorado de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Os autores agradecer o Genetics Society of America para a concessão de permissão para publicar este protocolo e usar uma adaptação da Figura 5 suplementar de Pena, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
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