Summary
Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.
Abstract
Pez cebra (Danio rerio) poseen orthologues 84% de los genes conocidos por estar asociados con enfermedades humanas. Además, estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones. Los avances recientes en gene de herramientas de edición permiten precisa introducción de mutaciones y los transgenes en el pez cebra. Modelado en el pez cebra a menudo la enfermedad conduce a fenotipos larvas y muerte temprana que puede ser difícil de interpretar si genotipos son desconocidos. Esta temprana identificación de genotipos es también necesaria en los experimentos que requieren muestra puesta en común, como en estudios de gene expresión o masa espectrometría. Sin embargo, amplia selección genotípica está limitada por los métodos tradicionales, que en la mayoría de los laboratorios se realizan sólo en pez cebra adulto o larvas post mortem. Abordamos este problema mediante la adaptación de un método para el aislamiento de ADN genómico de PCR-listo de larvas de pez cebra vivo que se puede lograr tan pronto como fertilización después de 72 h (hpf). Esta vez y técnica rentable, mejoró a partir de un protocolo de genotipificación publicados anteriormente, permite la identificación de genotipos procedentes de biopsias de fin microscópica. Las aletas se regeneran rápidamente como desarrollan de las larvas. Los investigadores entonces son capaces de seleccionar y criar los genotipos deseados a la edad adulta mediante la utilización de este procedimiento de genotipificación basada en PCR de alto rendimiento.
Introduction
El pez cebra (rerio del Danio) es un organismo vertebrado, ampliamente utilizado como modelo para la investigación de la enfermedad así como para ensayos preclínicos de hipótesis terapéuticas1,2,3. Estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones4. A través del desarrollo creciente de novela transgénico y genes edición tecnologías como Zinc-Finger nucleasas (ZFN)5, TAL como efectoras nucleasas (TALENs)6,7y el cluster regularmente otro corto Palindrómico repite (CRISPR) / CRISPR asociados 9 (Cas9) sistema8, el pez cebra va a mejorar sustancialmente la comprensión de varias condiciones patológicas. Estas tecnologías se han utilizado para crear knockouts dirigidas tanto somáticas y células germinales en el pez cebra, eficientemente engendrar genéticamente modificación animales8. Ejemplos recientes en la literatura incluyen el desarrollo de modelos genéticos de la epilepsia y trastornos metabólicos en el pez cebra3,9,10,11,12 .
Con los progresos realizados en la edición del genoma del pez cebra, genotipificación rápida y confiable se ha convertido en un indiscutible paso de limitación de velocidad. Identificación de mutaciones de ADN específicas junto al sitio de destino prevista-edición genómica es una etapa esencial del protocolo. Técnicas de genotipado por recorte de aleta son tradicionalmente, generalmente sólo en juveniles o adultos pez cebra. Sin embargo, el tiempo invertido en pez cebra aumento a la edad adulta (> 2 meses) retrasa considerablemente los avances en la investigación. En muchos casos, la edad adulta no puede lograrse por el knockout de genes esenciales (por ejemplo, en el modelado de la enfermedad) o ganar-de-función mutaciones conducen a efectos fenotípicos perjudiciales. Además, diversos estudios requieren la puesta en común de las larvas, tales como extracción de ARN o metabolito y así involucran previa identificación de los genotipos, que puede ser difícil cuando se dispone de técnicas de genotipado único post hoc . Estos ejemplos mencionados destacan la importancia de las técnicas de Genotipado de larvas que son al mismo tiempo precisa y permitir la recuperación completa y el desarrollo normal de las larvas. Genotipificación de pez cebra de etapa temprana actualmente parece no ser utilizado; Esto se refleja en publicaciones recientes de modelos de la enfermedad en la que genotipos larvarios se identifican mediante Genotipado de post-mortem en lugar de genotipado antes de la ejecución del experimento12,13,14. En este trabajo, se presenta una estrategia de clip de larvas de aleta con el objetivo de mejorar los procedimientos de genotipado previamente establecidas.
En el pasado, estrategias que emplea digestión proteinasa K a genotipo viven pez cebra larvas han llevado a polimerasa variable de eficiencia de la reacción en cadena (PCR)15. Aunque más recientemente publicaron la técnica de biopsia de cola microscópica proporcionada resultados más prometedores16, nosotros y otros grupos no fueron capaces de reproducir la alta eficiencia y recuperación de ADN, reportado por los autores. Un retroceso importante del protocolo descrito por Wilkinson et al. 16 podría ser la transferencia del tejido de la cola en el tubo PCR. Debido a su tamaño microscópico, es difícil para que la aleta fue debidamente recopilada y dispensada por pipeteo. Para hacer frente a esta barrera, hemos desarrollado un protocolo mejorado para un gran número de Genotipado de larvas de pez cebra vivo con casi 100% de eficiencia9. Con un microscalpel, la punta de la cola de la aleta se retira y coloca en un pedazo de papel de filtro. El pedazo de papel de filtro que contiene el tejido puede ser fácilmente visualizado y correctamente colocado en un tubo PCR. Se realiza la extracción de ADN genómica, seguido de la amplificación por PCR de la región de interés a genotipo la muestra. Las ventajas de este método incluyen una alta eficiencia PCR, un bajo índice de falsos positivos y una tasa de mortalidad baja. Además, Genotipado de un gran número de embriones es posible usando este protocolo. El protocolo descrito en el presente documento permite aleta-recorte de cientos de larvas dentro de 2-3 h con este enfoque y la correcta identificación de peces genotipo y regeneración de la cola dentro de dos días.
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Protocol
Procedimientos relacionados con temas de animales han sido aprobados y están de acuerdo con las pautas de cuidado de los animales proporcionan por el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal y la Universidad de Ottawa comités de cuidado de los animales.
1. preparación
- Preparación de la superficie de disección con cinta adhesiva una tapa de caja Petri de 9 cm con cinta de autoclave en toda su superficie interior. Colocarlo bajo un microscopio estéreo.
- Lugar de fertilización después de 3-5 días (PD) larvas de pez cebra en una Petri dish y anestesiar en ˜1.5 mM Metanosulfonato de 1 medio de x E3 de embriones (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4, pH 7,2).
- Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 con un par de tijeras o una cuchilla de afeitar a un diámetro de 2 mm para dar cabida a una larva 3 de PD con el mínimo esfuerzo.
2. aleta recorte de larvas de pez cebra
- Recoger una larva anestesia con la micropipeta P1000 modificada y colocar la larva del pez cebra en la cinta de autoclave situado sobre la tapa de la caja de Petri.
- Eliminar el exceso de solución de Metanosulfonato que rodea la larva mediante una micropipeta. El área debe ser tan seco como sea posible con éxito la sección y recoger la aleta pero todavía húmedo para garantizar la supervivencia.
- Con un bisturí micro, sección de la aleta caudal con un microscopio estéreo como se indica en la figura 1, como se describe en Wilkinson et al16. Durante la incisión, aplique una presión constante hacia abajo dentro del sitio de la brecha de pigmento de la aleta caudal, distal al límite de la circulación de la sangre (figura 1A). Aplique presión suave para evitar dañar el notocordio.
- Visualizar la aleta seccionada bajo el microscopio y coloque la pieza sobre la punta de la hoja de microscalpel (figura 2A). Coloque el microscalpel que contiene la aleta sobre la superficie de un pedazo pequeño de papel de filtro.
Nota: Debido a la presencia de melanocitos en el tejido seccionado, este paso permite la visualización de la aleta como un pequeño punto negro (figura 2B). - Usando tijeras y pinzas (figura 2) transfiera el papel de filtro que contiene la aleta a una placa PCR de 96 pocillos, conteniendo 25 μL de solución de NaOH de 50 mM por pozo (Figura 2D).
- Preparar una placa de 96 pocillos de fondo plano, numeración del pozo según la etiqueta de la placa de la polimerización en cadena. Con la modificada pipeta P1000 con 200 μL de fresco 1 x E3 embrión los medios de comunicación, recoger cuidadosamente la larva de pez cebra con una presión suave. Dispensar la larva en la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, en el mismo número así como la placa PCR (Figura 2E).
- Asegúrese de que el papel de filtro es bien sumergido en la solución (figura 2F). Limpiar la cuchilla de los microscapel y pinzas entre cada corte para evitar la contaminación cruzada por inmersión en solución EtOH al 70%. Limpie la cuchilla con tejido/toallita de papel limpia.
- Repita los pasos 2.1-2.7 hasta que todos los embriones han sido recortados.
- Guardar las larvas en la placa de 96 pozos a 28 ° C hasta que los genotipos han sido identificados.
Nota: Los medios de comunicación de embrión no necesitan ser cambiado, puesto que el protocolo se puede realizar fácilmente en menos de 2 días. Si se necesita más tiempo, se recomienda un cambio de los medios de comunicación.
3. extracción de ADN genómica
- Sellar la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 1 min para asegurarse de que todos los papeles de filtro están sumergidas en la solución de NaOH.
- Para la lisis del tejido, calentar las muestras en un termociclador a 95 ° C por 5 min seguido de un enfriamiento a 4 ° C durante 10 minutos.
- Añadir 6 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 para cada muestra. Vortex.
- Centrifugar brevemente la placa a 1.500 xg por 5 min a temperatura ambiente.
- Utilizar 1,5 μL del sobrenadante de DNA por la reacción de PCR.
- Preparar una PCR genotipo las larvas, como se muestra en la tabla 1-2.
Nota: Este protocolo fue probado para dos aplicaciones: multiplexar reacciones de PCR, revela el genotipo utilizando geles de agarosa9y heteroduplex fusión ensayo (HMA) revelando los genotipos usando poliacrilamida gel electroforesis (PAGE)17.
4. alternativa extracción Genomic usando una resina quelante
- Paso completa 2.5 añadiendo filtro de papel con la aleta recortada a una placa PCR de 96 pocillos, con 30 μL de 5% quelantes de resina (copolímero de estireno-divinilbenceno que contienen iminodiacetate pares de iones).
Nota: Este tipo de resina se utiliza comúnmente para la lisis de tejido y la preparación de ADN PCR-listo en una manera rápida y eficiente18. - Siga los pasos 2.6-2.8 como se indica.
- Sellar la placa PCR de 96 pocillos y centrifugar brevemente las muestras para asegurarse de que todo el papel filtro se sumerge dentro de la resina quelante.
- Para la lisis del tejido, calentar las muestras en un termociclador a 95 ° C durante 15 min, seguido de un enfriamiento a 4 ° C durante 10 minutos.
Nota: Este paso permite lisis y posterior unión de los granos de resina polar a componentes celulares mientras que el ADN y el ARN permanecen en solución. - Centrifugar brevemente las muestras para los granos de la resina de la pelotilla y obtener el ADN de la suspensión.
- Siga los pasos 3.5-3.6 trámite de genotipificación.
5. aplicación 1: Multiplex PCR seguida por análisis del Gel de agarosa
- Siguiente tabla 1, establecer una reacción de PCR multiplex para permitir la discriminación entre mutantes homocigotos, heterocigotos y larvas WT. Utiliza a un termociclador 96 pocillos para llevar a cabo las reacciones de PCR utilizando el ciclismo condiciones descritas en la tabla 3.
Nota: Las reacciones de PCR se pueden realizar también en cualquier otro convencional PCR termociclador. Este ejemplo describe la estrategia PCR utilizada por Peña, et al. 9 identificar aldh7a1 WT y alelos mutantes de inserción 5-puntos de ebullición en la misma reacción multiplex. - Preparar un gel de agarosa al 1% en tampón borato de sodio, con 1 x GelRed.
Nota: 20 x stock de buffer de borato de sodio se hace de 40 mL de 10 M NaOH, 1800 mL de ddH2O, pH ajustado a 8.5 con 76 g de ácido bórico y luego completar a volumen final de 2 L con ddH2O. - Correr el gel en solución tampón de borato de sodio 1 x min 15 a 250 V. Para facilitar el proceso, si es posible, utilice un sistema de gel que es compatible con pipetas multicanales para permitir mayor capacidad de rendimiento al reducir el tiempo para cargar las muestras.
- El gel bajo luz ultravioleta (UV) para permitir la discriminación de los diferentes genotipos de la imagen.
6. aplicación 2: Heteroduplex ensayo de fusión
- Preparar página 12% geles con la placa del separador de 1,5 mm y los peines de 15 muestras. Preparar dos geles de la página 12,21 ml de ddH2O, 2,52 mL de 10 x 10 mL de acrilamida 30%, borato/Tris/EDTA (TBE), 250 μL de persulfato de amonio 10% (APS) y 20 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED). Utilizar 1 buffer x TBE (0.089 M Tris-HCl, 0,089 M el ácido bórico y 0.002 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA)) como almacenador intermediario de funcionamiento.
- Calentar los productos PCR a 94 ° C durante 5 minutos.
- Enfríe los tubos en hielo o en el termociclador durante 10 min a 4 ° C.
- Cargar 10 μL por muestra PCR y 8 μL de marcador de peso molecular.
- Ejecutar la página de 150 V en 1 x TBE utilizando un sistema de electroforesis vertical durante 1 hora o hasta que el marcador de peso molecular casi alcanza la línea de pie de la placa de vidrio.
- El gel bajo luz UV para permitir la discriminación de los diferentes genotipos de la imagen.
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Representative Results
La eficiencia de la protocolo fue demostrada por genotipificación la descendencia de un cruce heterocigoto (aldh7a1+ ot100, aquí se muestra como aldh7a1+-) ()Figura 3A- C)9. El alelo mutante aldh7a1ot100tiene una inserción de par 5-bajo (bp) en el primer exón de codificación del gene aldh7a1 del pez cebra que conduce a mutágeno ' frameshift ' y pérdida de función debido a una temprana parada codon9. Cuatro cebadores se usaron en una reacción multiplex para obtener tres bandas característicos para diferenciar entre peso, heterozigótico (aldh7a1+-) y genotipos homocigoto mutante (aldh7a1- / -) (de la Peña, et al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' y "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). La amplificación de ambos alelos utilizando los cebadores Gen1_FW y Gen1_RV dio como resultado un amplicon de 434-bp. Una banda de 293-bp surgió de amplificación específica del alelo del mutante, y se obtuvo una banda 195-bp específicamente para el alelo WT, como se muestra en la Figura 3A. Después de la polimerización en cadena, 8 μl de cada volumen de reacción de 20 μl se analizan en un gel de borato de sodio agarosa 1%, como se muestra en la figura 3B. Suficiente ADN larval fue recuperado de 98% (n = 576) de las muestras, dando por resultado una alta tasa de eficiencia PCR. Extracción de ADN mediante la técnica de NaOH obtiene en promedio 4,7 0,5 ng/μl de ADN larvas por muestra siguiendo el procedimiento de biopsia de aleta, de volumen de 30 μl. Extracción de ADN usando la resina quelante se traduce en un rendimiento similar, en promedio 3,8 0,5 ng/μl de ADN por muestra. Esta cantidad de DNA obtenido transections aleta larval genera lista para PCR DNA genomic de calidad suficiente para permitir la identificación de genotipos. Cada muestra de ADN puede ser utilizado en reacciones de amplificación de PCR ˜30. Productos de amplificación obtenidos mediante cebadores Gen1_FW y Gen2_RV pueden utilizarse también para la secuencia aplicaciones9, que identifica con éxito la inserción 5-bp en los mutantes homocigóticos (aldh7a1- / -) (figura 3 ). Sanger secuenciación fue realizada vía un servicio externo para comprobar si los productos PCR fueron convenientes para esta aplicación. Muestras de ADN de gel de agarosa confirmaron mutantes homocigóticos y WTs (n = 3) fueron utilizados. Phred19 puntuaciones altas (> 30) se obtuvieron indicando lecturas de alta calidad, excepto el primeros y últimos 40 pares de bases.
Este protocolo fue utilizado para genotipo varias otras mutaciones de pez cebra por heterodúplex análisis de fusión. Los alelos del mutante plpbpot101 y plpbpot102 del plpbp gen (Figura 4A-D) cada llevan a un mutágeno ' frameshift ' y un codón de parada temprana. Con el fin de identificar plpbp-larvas de pez cebra null, dos cartillas fueron utilizadas para amplificar el primer exón de codificación incluyendo el sitio de mutación (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'y plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). La amplificación del fragmento de plpbp en animales de peso produce un amplicón de 272-bp (homoduplex). Los amplicones obtenidos plpbpot101 (alelo de la canceladura de 4 puntos, figura 4) consiste en un fragmento de 268 PB y de la plpbpot102 (sustitución de 5bp, alelo de la canceladura de 2 puntos, figura 4), 270-bp, como se ve en la Figura 4A-B. Después de la desnaturalización y recocido, los fragmentos PCR de animales heterocigotos contendría del heterodúplex y homoduplex ADN17. Bandas Homoduplex y del heterodúplex pueden ser fácilmente separadas y visualizaron usando electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE). La presencia de un ángulo abierto entre los filamentos de ADN emparejados y causado por recocido imperfecto debido a la ocurrencia de mutaciones causan del heterodúplex ADN para migrar a un ritmo significativamente más lento que homoduplex ADN17. Patrones de migración distintos son producidos por mutaciones distintas. Los genotipos heterocigotos (plpbp+ / ot101, plpbp+ ot102) por lo tanto mostrará fragmentos de la DNA del heterodúplex, así como el compuesto heterocigoto (plpbpot101/ot102) (figura 4a-B). Genotipificación precisa se obtiene por este del heterodúplex ensayo de fusión se obtiene un patrón de página único para cada genotipo y se pueden visualizar distintas mutaciones heterozigóticas (Figura 4A-B). Homocigóticas mutantes muestran un patrón homoduplex en el gel de la página y por lo tanto ser indistinguible a WTs. Para distinguir estos genotipos, debe realizarse otra ronda de análisis de gel de página en que productos PCR de necesidad de alelos WT que se mezcla con las muestras que se estudiarán, como se describe en otra parte17.
Cerca del 90% (88/98) de WT y heterozigóticos embriones fueron criado con éxito a la edad adulta (> 2 meses). Como aldh7a1 y plpbp son mutantes de pérdida de función que muestran un fenotipo de muerte temprana, animales no tratados no podrían levantar a la edad adulta. Sin embargo, los genotipos de todo superviviente WT y adultos heterocigotos eran idénticos a los resultados de recorte larvas de aleta, lo que indica una tasa de precisión de 100% para la identificación de genotipos mediante el procedimiento de biopsia de larvas de aleta.
Figura 1. Clip de aleta larval. (A). aleta larval no roto en la fertilización después de tres días (PD). La línea representa el sitio de corte transversal, situado dentro de la brecha de pigmento. La flecha negra muestra el límite de la circulación del caudal de la sangre. (B). la siguiente Larva fin procedimiento de recorte en PD 3. (C). larvas de pez cebra aleta recrecimiento en 5 PD. Regeneración de la aleta de una formación blastemal se observa sólo transección de aleta después de 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Procedimiento para el recorte de aleta larval. (A). las larvas se colocan en la cinta y se elimina el medio de exceso de embriones. Bajo el microscopio, la aleta es transversalmente en la región de la brecha de pigmento como se muestra en la figura 1A. Con un microscalpel, la aleta se recoge y se coloca sobre un papel de filtro la superficie simplemente por el tacto (B) y pueden visualizarse fácilmente como una mancha negra. Sostener la pieza de papel de filtro que contiene la aleta y corte un cuadrado pequeño que rodea la región deseada (C). Coloque el pequeño pedazo de papel de filtro que contiene la aleta en un pozo de una placa bien 96 (D). La larva correspondiente debe colocarse a los correspondientes de una placa de 96 pocillos de fondo plano en 200 μL de medio de embriones (E). El pedazo de papel de filtro debe estar sumergido en la solución de lisis (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Genotipado de Cruz heterozigótico aldh7a1 procedentes de biopsias de larvas de aleta. (A). Resultado esperado donde amplificación de alelos WT y aldh7a1ot100 produce un amplicón de 434-bp. Una banda de 293-bp surge de amplificación del alelo del mutante (aldh7a1ot100, inserción 5-bp), y se obtiene una banda 195-bp para el alelo WT. (B). la amplificación ejemplo de PCR de los tejidos de larvas de aleta aldh7a1 . En carril 7 se muestra un marcador de peso molecular de 1 kb. Carriles 1-6 cada uno representan una biopsia de la sola aleta. Resultados PCR identifican aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genotipos (carril 1), aldh7a1+- genotipos heterocigotos (aldh7a1+ ot100) (carriles 3, 4 y 5) y (WT aldh7a1+ / +) genotipos (carriles 2 y 6). (C). una alineación entre WT secuenciado y alelo aldh7a1ot100 mostrando la posición de la mutación de inserción 5-bp. Esta figura es una adaptación de la figura 5 suplementarios de Peña et al. 9 con permiso de la sociedad genética de América. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Genotipado de plpbp compuesto (2 bp deleción 4 bp canceladura heterozigótica) de las biopsias de larvas de aleta. (A). Resultado esperado donde amplificación del alelo WT resultó en un amplicon de 272-bp. El alelo de la canceladura de 4 puntos (plpbpot101) y la sustitución de la 5-bp con el alelo de la canceladura de 2 puntos (plpbpot102) producen longitudes de amplicones de bp 268 y 270 bp respectivamente. Un heteroduplex se forma entre un alelo WT y el alelo mutante en un genotipo heterocigoto (plpbp+-). Formación del heterodúplex debido a la disparidad entre alelos causará retraso de la banda en el gel en comparación con el homoduplex WT. (B). amplificación de la polimerización en cadena resultantes de recortes de aleta larval de la descendencia de un plpbp+ / ot101x plpbp+ ot102 Cruz. En carril 1 se muestra un marcador de peso molecular de 1 kb. Carriles 2-10 representan una biopsia de la sola aleta. Resultados PCR identifican genotipos mutantes (plpbp-null heterozigótico compuesto plpbpot101/ot102, carriles 2, 4 y 8), genotipos heterocigotos (carriles 3, 6, 7, 9 y 10) y los genotipos de la WT (carril 5). (C). una alineación entre WT secuenciado y alelo plpbpot101 mostrando la posición de la mutación de la canceladura de 4 puntos. (D). alineación entre WT secuenciado y alelo plpbpot102 mostrando la posición de la canceladura de 2 puntos de ebullición y la sustitución de la 5-bp (negrita). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes | Reacción de 20 μl | 100 reacciones | Concentrado final |
| Libre de nucleasas H2O | 7.45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| cartilla Gen1_FW | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| cartilla 5 nt-ins-specific_FW | 0,3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Cartilla Gen2_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| WT-specific_RV de primer | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| DNA | 1.5 ΜL | -- |
Tabla 1. Condiciones de la reacción de multiplex PCR usado para la aldh7a1 alelo en el presente Protocolo. Los cebadores utilizados son los siguientes: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3' y "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Las acciones de la cartilla fueron 10 μm.
| Componentes | 13 μl reacción | 100 reacciones | Concentrado final |
| H2O | 3.25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6,25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| cartilla de FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| Cartilla de RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| DNA | 1.5 ΜL | -- |
Tabla 2. Condiciones de reacción para PCR utilizado para plpbp alelo en el presente Protocolo. El primer avance utilizado fue PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'y el revés, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Las acciones de la cartilla fueron 10 μm.
| Paso de ciclo | A la temperatura. | Tiempo | Ciclos de |
| Desnaturalización inicial | 95 ° C | 3 min | 1 |
| La desnaturalización | 95 ° C | 30 seg. | 36 |
| Recocido * | X ° C | 30 seg. | |
| Extensión | 72 ° C | 20 seg. / kb | |
| Extensión final | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | Mantenga |
Tabla 3. Condiciones PCR utilizadas en este protocolo.
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Discussion
Gen se han empleado herramientas de edición precisamente introducir mutaciones y los transgenes en el pez cebra en los últimos años5,6,7,8. Cuando se realiza la enfermedad en pez cebra, primeros fenotipos larvales o juveniles a menudo se observan9,12,13,14. El protocolo que presentamos describe la extracción de ADN PCR-listo de biopsias de pequeño pez cebra cola larvaria, permitiendo el Genotipado de las larvas desde los 3 PD. La identificación temprana de genotipos es crucial para varias aplicaciones de laboratorio, especialmente cuando genotyping post hoc no es posible9. Conocer genotipos desde temprana edad facilita estudios de supervivencia y análisis fenotípico de los mutantes. Este protocolo también es útil para la cría de larvas de genotipos específicos a la madurez. Genotipado de larvas no es todavía ampliamente utilizado en laboratorios de pez cebra en todo el mundo y este protocolo tiene como objetivo facilitar la difusión de esta técnica. Mientras manipula las aletas seccionadas, el uso de este método proporciona confianza en cuanto a la presencia de ADN dentro de la muestra; la biopsia de fin puede visualizarse fácilmente como una mancha oscura sobre el papel de filtro durante todo el proceso de manipulación. Esto representa una mejora importante del protocolo publicado por Wilkinson et al. 16.
Varios pasos críticos en el protocolo deben seguirse correctamente para obtener resultados de calidad. Primero y principal, la sección transversal de la aleta larvas debe ocurrir dentro de la brecha de pigmento, distal al límite de la circulación de la sangre, para evitar el sangrado. Esto asegura la supervivencia de las larvas durante la biopsia de la aleta. Por otra parte, un punto negro en el papel de filtro, marcando la posición de la aleta, debe observarse antes de colocar el papel de filtro en la solución de NaOH. Esto asegura la presencia de tejido de la aleta (y por lo tanto, el ADN) en cada muestra bien. El papel de filtro también debe estar inmerso dentro de la solución de NaOH para garantizar la lisis celular y extracción de ADN exitosa. Este protocolo no fue probado para edades más tempranas que PD 3 como sólo las larvas eclosionadas fueron utilizadas. A los embriones más jóvenes genotipo (eclosionados < PD 3) sería necesario retiro del corion. En caso insuficiente amplificación por PCR, estrategias de optimización de PCR estándar deben ser aplicado (por ejemplo, variando la concentración de la cartilla, recocido temperatura o concentración de ADN). Aunque se extrae ADN suficiente para realizar con éxito varios tipos de reacciones de PCR (como se muestra ejemplos de genotipado aldh7a1 y plpbp ), la concentración de ADN obtenido siguiendo este procedimiento de recorte de aleta es pequeña (~ 5 ng/μl muestra) y por lo tanto, aumentando la concentración de ADN en la reacción de PCR puede permitir mayor éxito de la amplificación.
La larvas de aleta la DNA extraída con este protocolo puede utilizarse para varias reacciones de amplificación, que permite la identificación precisa de los genotipos de larvas de pez cebra y de un modo de alto rendimiento. Un heteroduplex análisis en geles de la página de fusión puede utilizarse para identificar mutaciones diferentes17. Dado que ~ 30 μL del ADN se obtiene por muestra, y se utiliza ~ 1-1.5 μL de DNA por reacción de polimerización en cadena, aproximadamente 30 reacciones de PCR se pueden ejecutar por la muestra extraída. Los productos PCR también son adecuados para aplicaciones de secuenciación de Sanger; alta calidad de Lee fueron obtenidos, permitiendo la confirmación precisa de WT y secuencias mutantes homocigóticas para aldh7a1. La extracción de ADN de genómica de pez cebra larval tiene muchas aplicaciones en la investigación. El objetivo original para el desarrollo de este protocolo fue eficazmente larvas de genotipo que no alcanzan la edad adulta debido a mutaciones específicas en el aldh7a19. Además, este protocolo permitió la segregación de genotipos y la observación de fenotipos asociados a epilepsia específicamente en aldh7a1peces- / - de la etapa larval adelante9. La puesta en común de las larvas de cada genotipo para los acercamientos tales como extracción de RNA o extracción del metabolito puede ser ejecutado con precisión después de genotipado utilizando larvas aleta recorte procedimiento9. En conclusión, después de un corto período de entrenamiento, un investigador experimentado puede utilizar este Protocolo simple y eficiente, que requieren solo mínima y de bajo costo reactivos, realizar habitualmente cientos de clips de aleta por día. El uso de este protocolo hace posible la investigación descrita por Peña et al. y que servirá a un propósito similar para la comunidad de pez cebra.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los modelos raros de la enfermedad y mecanismo (RDMM) red (financiada por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR) y genoma Canadá). CK es apoyada por una beca de la UROP (Universidad de Ottawa). DLJ es apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá. IAP es apoyado por un premio de beca postdoctoral de institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Los autores agradecen la Genetics Society of America para la concesión de permiso para publicar este protocolo y utilizar una adaptación de la figura 5 suplementarios de Pena, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
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