Summary
Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.
Abstract
Zebrafisch (Danio Rerio) besitzen Orthologe 84 % der Gene bekannt, um menschliche Krankheiten zugeordnet werden. Darüber hinaus diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost, und sind leicht zugänglich, genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen. Die jüngsten Fortschritte im Gen Bearbeitungstools ermöglichen präzise Einführung von Mutationen und transgene im Zebrafisch. Erkrankung oft im Zebrafisch Modellierung führt zu Larven Phänotypen und frühen Tod die schwierig sein kann, um zu interpretieren, wenn Genotypen unbekannt sind. Diese Früherkennung von Genotypen ist auch im Experimente erfordern Probe zu bündeln, wie z. B. Gen Ausdruck oder Mass Spectrometry Studien. Jedoch wird umfangreiche genotypischen Screening von den traditionellen Methoden begrenzt, die in den meisten Labors nur auf Erwachsene Zebrafisch oder im Post-mortem Larven durchgeführt werden. Wir haben dieses Problem durch Anpassung eine Methode zur Isolierung von PCR-Ready genomische DNA aus live zebrafischlarven, die so früh wie 72 h nach Befruchtung (hpf) erreicht werden kann. Diese Zeit- und kostengünstige Technik, verbesserte sich von einer zuvor veröffentlichten Genotypisierung-Protokoll ermöglicht die Identifikation von Genotypen aus mikroskopischen Fin Biopsien. Die Flossen regenerieren schnell wie die Larven entwickeln. Forscher können dann auswählen und die gewünschte Genotypen bis zum Erwachsenenalter durch die Nutzung dieser Hochdurchsatz-PCR-basierten Genotypisierung Verfahren zu erhöhen.
Introduction
Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist ein fest gefügten Organismus verbreitet als Modell für die Untersuchung der Krankheit sowie für präklinische Tests von therapeutische Hypothesen1,2,3. Diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost und genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen4leicht zugänglich sind. Durch die zunehmende Entwicklung neuartiger transgener und gen Bearbeitung Technologien wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)5, TAL-wie Effektor Nukleasen (TALENs)6,7, und die gruppierten regelmäßig dazwischen kurz Palindromische wiederholt (CRISPR) / CRISPR-assoziierten 9 (Cas9) System8, dem Zebrafisch wird balanciert, um das Verständnis der verschiedenen pathologischen Bedingungen wesentlich zu verbessern. Diese Technologien wurden verwendet, um gezielte Knockouts in beiden somatische erstellen und Keimbahnzellen im Zebrafisch, effizient erzeugt genetisch modifiziert Tiere8. Jüngste Beispiele in der Literatur sind die erfolgreiche Entwicklung von genetischen Modellen von Epilepsie und Stoffwechselstörungen im Zebrafisch3,9,10,11,12 .
Mit den Fortschritten im Zebrafish Genom-Bearbeitung ist schnelle und zuverlässige Genotypisierung eine unbestreitbare Bandbreitenbegrenzung Schritt geworden. Identifizierung von spezifischen DNA-Mutationen angrenzend an den vorhergesagten Erbgut Bearbeitung Zielstandort ist eine wichtige Etappe des Protokolls. Traditionell, sind Genotypisierung Techniken von Fin Clipping in der Regel nur bei Jugendlichen oder Erwachsenen Zebrafisch. Aber der Zeitaufwand erhöhen Zebrafisch bis zum Erwachsenenalter (> 2 Monate) Fortschritte in der Forschung erheblich verzögert. In vielen Fällen kann durch den Knockout der wesentlichen Gene (z. B. in der Krankheit Modellierung) oder Gain-of-Function-Mutationen führen zu schädlichen phänotypischen Auswirkungen Erwachsenenalter erreicht werden. Darüber hinaus mehrere Assays erfordern, Bündelung von Larven, z. B. in RNA oder Metaboliten Extraktion und beinhalten damit vorherige Identifizierung der Genotypen, die schwierig sein kann, wenn nur post-Hoc Genotyping Techniken verfügbar sind. Diese genannten Beispiele unterstreichen die Bedeutung der Larven Genotypisierung Techniken die zur gleichen Zeit präzise und vollständige Genesung und die normale Entwicklung der Larven zu ermöglichen. Frühen Stadium Zebrafisch Genotypisierung scheinen derzeit nicht am meisten benutzt sein; Dies spiegelt sich durch aktuelle Publikationen der Krankheitsmodelle in denen Larven Genotypen über Post-Mortem-Genotypisierung anstatt Genotypisierung vor der Ausführung des Experiments12,13,14identifiziert werden. In diesem Papier ist eine Larven Fin Clip Strategie vorgestellt, mit dem Ziel, vorher festgelegten Genotypisierung Verfahren zu verbessern.
In der Vergangenheit Leben Strategien beschäftigen Proteinase K-Verdauung, Genotyp Zebrafisch, die Larven zu Variablen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Effizienz15geführt haben. Obwohl mehr vor kurzem mikroskopische Schweif Biopsie Technik zur Verfügung gestellt viel versprechende Ergebnisse16veröffentlicht, waren wir und andere Gruppen nicht in der Lage, die hohe Effizienz und DNA Wiederherstellung berichtet von den Autoren zu reproduzieren. Ein schwerer Rückschlag des Protokolls von Wilkinson Et Al. beschrieben 16 kann die Übertragung des Gewebes Heck mit dem PCR-Rohr. Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist es hart, um sicherzustellen, dass die Flosse wurde ordnungsgemäß gesammelt und durch pipettieren verzichtet. Um diese Barriere zu begegnen, haben wir eine verbesserte Protokoll für die Genotypisierung zahlreicher live zebrafischlarven mit fast 100 % Wirkungsgrad9entwickelt. Mit einer Microscalpel, die Fin Schwanzspitze entfernt und auf ein Stück Filterpapier gelegt. Das Stück Filterpapier mit dem Gewebe kann leicht visualisiert und in ein PCR-Röhrchen korrekt platziert. Genomische DNA-Extraktion erfolgt dann, gefolgt von PCR-Amplifikation der Region von Interesse zum Genotyp der Probe. Die Vorteile dieser Methode sind eine hohe Effizienz der PCR, einer niedrige false-positive-Rate und eine niedrige Sterblichkeitsrate. Darüber hinaus ist die Genotypisierung einer großen Anzahl von Embryonen möglich unter Verwendung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Fin-Clipping von Hunderten von Larven innerhalb von 2-3 Stunden mit diesem Ansatz und korrekte Identifizierung der genotypisiert Fisch und Schweif Regeneration innerhalb von zwei Tagen.
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Protocol
Verfahren mit tierische Themen genehmigt worden und sind nach Tierbetreuung Richtlinien zur Verfügung gestellt von der Canadian Council Tier Pflege und der University of Ottawa Tierbetreuung Ausschüsse.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie die Dissektion Oberfläche durch Abkleben 9 cm Petrischale Deckel mit Autoklav Band über seine innere Oberfläche. Positionieren Sie es unter dem Stereo-Mikroskop.
- Legen Sie 3 bis 5 Tage nach Befruchtung (Dpf) zebrafischlarven in ein Petri-Schale und in ˜1.5 mM Tricaine in 1 x E3 Embryo Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2) zu betäuben.
- Zum Jahresende ein P1000 PIPETTENSPITZE mit einem Paar der Schere oder einer Rasierklinge auf einen Durchmesser von 2 mm bis 3 Dpf Larve mit minimalem Stress Platz abgeschnitten.
2. Fin Clipping von Zebrafischlarven
- Einem narkotisierten Larve mit der modifizierten P1000 Mikropipette abholen und legen der Zebrafisch-Larve auf das positionierte Autoklav-Band auf dem Deckel der Petrischale.
- Entfernen Sie überschüssige Tricaine Lösung rund um die Larve mit einer Mikropipette. Das Gebiet sollte so trocken wie möglich, erfolgreich Abschnitt und holen die Flosse aber noch feucht ist, Überleben zu sichern.
- Verwenden ein Mikro Skalpell, Abschnitt der Schwanzflosse unter dem Stereo-Mikroskop, wie in Abbildung 1angezeigt, wie im Wilkinson Et al.16beschrieben. Während die Inzision gelten Sie stetigen Druck innerhalb der Pigment-Baulücke der Schwanzflosse, distale bis an die Grenze der Durchblutung (Abbildung 1A). Üben Sie sanften Druck zur Vermeidung von Schäden der Chorda.
- Visualisieren Sie die geschnittenen Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Microscalpel Klinge (Abbildung 2A). Legen Sie die Microscalpel mit der Flosse auf der Oberfläche von einem kleinen Stück Filterpapier.
Hinweis: Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten in der durchtrennten Gewebes ermöglicht diesen Schritt Visualisierung der Finne als kleiner schwarzer Fleck (Abb. 2 b). - Mit Schere und Pinzette (Abbildung 2), übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse, eine 96-Well-PCR-Platte, enthält 25 μL 50 mM NaOH Lösung pro Bohrloch (Abb. 2D).
- Bereiten Sie eine flach-Boden-96-Well-Platte, Nummerierung des Brunnens nach dem Etikett der PCR Platte. Mit der veränderten P1000 Pipette gefüllt mit 200 µL frische 1 x E3 Embryo Medien, sorgfältig sammeln Sie die Zebrafisch-Larven mit leichtem Druck. Die Larve in der Gewebekultur 96-Well-Platte im gleich gut wie die PCR-Platte (Abb. 2E) Nummer zu verzichten.
- Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gut in der Lösung (Abbildung 2F) untergetaucht ist. Reinigen Sie die Klinge des Microscapel und Pinzette zwischen jedem Schnitt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden durch Eintauchen in 70 % EtOH Lösung. Wischen Sie die Klinge mit sauberem Papier Gewebe/wischen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, bis alle Embryonen abgeschnitten worden.
- Speichern Sie die Larven in 96-Well-Platte bei 28 ° C, bis die Genotypen identifiziert wurden.
Hinweis: Der Embryo Medien muss nicht geändert werden, da das Protokoll bequem in weniger als 2 Tagen abgeschlossen werden kann. Wenn mehr Zeit erforderlich ist, empfiehlt sich ein Medienwechsel.
(3) genomische DNA-Extraktion
- Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte und Zentrifuge, die die Proben bei 1.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere innerhalb der NaOH-Lösung getaucht werden.
- Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.
- Fügen Sie 6 μL von 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 zu jeder Probe. Vortex.
- Zentrifugieren Sie kurz die Platte bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie 1,5 μl des Überstands DNA pro PCR-Reaktion.
- Bereiten Sie einer PCR Genotyp der Larven, wie in Tabelle 1-2.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde für zwei Anwendungen getestet: multiplex-PCR-Reaktionen enthüllt den Genotyp mit Agarose Gele9und Heteroduplex schmelzen Assay (HMA) enthüllt die Genotypen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)17.
4. alternative genomische Extraktion mittels eine Komplexbildner Harz
- Komplette Schritt 2.5 indem Filterpapier mit beschnittenen Fin zu einer 96-Well-PCR-Platte mit 30 μl 5 % chelatisierenden Harz (Styrol-Divinylbenzene-Copolymeren mit gekoppelten Iminodiacetate-Ionen).
Hinweis: Diese Art des Harzes wird häufig für Gewebe-Lyse und Vorbereitung von PCR-Ready DNA in eine schnelle und effiziente Weise18verwendet. - Führen Sie die Schritte 2.6-2.8, wie angegeben.
- Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und kurz Zentrifugieren Sie die Proben um sicherzustellen, dass alle Filterpapier innerhalb der Komplexbildner Harz eingetaucht ist.
- Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.
Hinweis: In diesem Schritt können Lyse und anschließende Bindung von polar harzkügelchen, zellulären Komponenten, während DNA und RNA in Lösung bleiben. - Zentrifugieren Sie kurz die Proben um die harzkügelchen pellet und die DNA in der Suspension zu erhalten.
- Führen Sie die Schritte 3,5-3,6, Genotypisierung Verfahren abzuschließen.
5. Anwendung 1: Multiplex-PCR, gefolgt von Agarose-Gel-Analyse
- Nach Tabelle 1, Einrichten einer Multiplex-PCR-Reaktion ermöglicht die Unterscheidung zwischen reinerbigen Mutanten, Heterozygote und WT-Larven. Verwenden einer 96-Well-Thermocycler, PCR-Reaktionen mit den Radsport in Tabelle 3beschriebenen Bedingungen durchzuführen.
Hinweis: Die PCR-Reaktionen können auch in jeder anderen konventionellen PCR Thermocycler durchgeführt werden. Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Strategie von Pena, Et Al. verwendet 9 , aldh7a1 WT und 5-bp Einfügung mutierten Allele in der gleichen Multiplex-Reaktion zu identifizieren. - Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel in Natrium-Borat-Puffer, befleckt mit 1 X GelRed.
Hinweis: 20 x Natrium-Borat ausgleichslagers 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL DdH2O, pH 8,5 mit 76 g Borsäure angepasst und anschließend zu 2 L Endvolumen mit DdH2O. besteht aus - Führen Sie das Gel in 1 X Natrium-Borat-Puffer für 15 min bei 250 V. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Gel-System, das kompatibel mit Multichannel-mehrkanalpipette zu höheren Durchsatz ermöglichen durch die Reduzierung der Zeit zum Proben zu laden ist.
- Bild das Gel unter ultraviolettem (UV) Licht um Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.
6. Anwendung 2: Heteroduplex schmelzen Assay
- Bereiten Sie Seite 12 % Gele mit 1,5 mm Spacer Platte und die 15-Proben Kämme. Bereiten Sie zwei Seite-Gele mit 12,21 mL DdH2O, 2,52 mL 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 mL 30 % Acrylamid, 250 μl 10 % Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Verwenden Sie 1 X TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M Borsäure und 0,002 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)) als Puffer ausgeführt.
- Erhitzen Sie die PCR-Produkte bei 94 ° C für 5 min.
- Cool die Rohre auf Eis oder in den Thermocycler für 10 min bei 4 ° C.
- Last 10 μL pro PCR Probe und 8 μl Molekulargewicht Marker.
- Führen Sie die Seite 150 V 1 x TBE mit einem vertikalen Elektrophorese-System für 1 h oder bis das Molekulargewicht Marker fast erreicht die Linie der Glasplatte.
- Bild das Gel unter UV-Licht zur Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.
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Representative Results
Die Effizienz des Protokolls zeigte sich durch Genotypisierung der Nachzucht von einem heterozygoten Kreuz (aldh7a1+ / ot100, hier dargestellt als aldh7a1+ /-) ()Abbildung 3A- C)9. Die aldh7a1ot100mutierten Allels hat eine 5-Basenpaaren (bp) Einfügung in die ersten kodierenden Exon der Zebrafisch- aldh7a1 -Gens, das führt zu Frameshift und Verlust der Funktion aufgrund einer frühen Stopp-Codon9. Vier Grundierungen dienten in einer Multiplex-Reaktion zu drei markanten Bands, WT, heterozygot (aldh7a1+ /-) und homozygoten Mutante (aldh7a1- / -) Genotypen zu unterscheiden (von Pena, Et Al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ","Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3", "5 nt-ins-Specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ", und"WT-Specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3"). Die Verstärkung der beiden Allele mit Primer Gen1_FW und Gen1_RV führte zu einem 434 bp Amplikons. 293-bp Band entstand aus spezifische Verstärkung des mutierten Allels, und eine 195-bp-Band wurde speziell für das WT-Allel erhalten, wie in Abbildung 3Agezeigt. Nach PCR, 8 µL jeweils 20 µL Reaktionsvolumen wurde auf einem 1 % Agarose/Natrium-Borat-Gel, analysiert, wie in Abbildung 3 bgezeigt. Ausreichend Larven DNA wurde erholte sich von 98 % (n = 576) der Proben, was zu einer hohen Rate der PCR-Effizienz. DNA-Extraktion mit der NaOH-Technik erhält durchschnittlich 4,7 0,5 ng/µL DNA-Larven pro Probe nach dem Fin-Biopsie-Verfahren in ~ 30 µL Volumen. DNA-Extraktion mit Komplexbildnern Harz ergibt sich eine ähnliche Rendite durchschnittlich 3,8 0,5 ng/µL DNA pro Probe. Diese Menge an DNA gesammelt von Larven Fin Transections erzeugt PCR-Ready genomischen DNA von ausreichender Qualität, um die Identifizierung von Genotypen zu ermöglichen. Jede DNA-Probe kann in ˜30 PCR Amplifikationen verwendet werden. Amplifikationsprodukte erhalten mit Primer Gen1_FW und Gen2_RV auch Sequenzierung Anwendungen9, einsetzbar für die 5-bp-Einfügung in den reinerbigen Mutanten (aldh7a1- / -) (Abbildung 3 erfolgreich identifiziert ). Sanger Sequenzierung erfolgte über einen externen Dienstleister zu testen, ob die PCR-Produkte für diese Anwendung geeignet waren. DNA-Proben von Agarose-Gel bestätigt reinerbigen Mutanten und WTs (n = 3 Stück) wurden verwendet. Phred19 Highscores (> 30) stammen, hochwertige liest, mit Ausnahme der ersten und letzten 40 Basenpaare angibt.
Dieses Protokoll wurde in der Folge zu Genotyp verschiedene andere Zebrafisch-Mutationen von Heteroduplex schmelzen Analyse verwendet. Die Plpbpot101 und Plpbpot102 mutierten Allelen des Plpbp -Gens (Abb. 4A-D) jedes führen zu einer Frameshift und frühen Stopp-Codon. Um Plpbpzu identifizieren-null zebrafischlarven, zwei Primer wurden verwendet, um die ersten kodierenden Exon einschließlich der Mutation Website zu verstärken (Plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "und Plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3"). Die Verstärkung des Plpbp Fragments in WT Tiere führt ein 272-bp Amplifikate (Homoduplex). Der Amplifikate gewonnenen Plpbpot101 (4-bp Löschung Allel, Abbildung 4) besteht aus einem Fragment von 268-bp und der Plpbpot102 (5bp-Substitution, 2-bp Löschung Allel, Abbildung 4), 270-bp, wie in Abbildung 4A-Bzu sehen. Nach Denaturierung und Glühen würde der PCR-Fragmente von heterozygote Tiere Heteroduplex und Homoduplex DNA17enthalten. Homoduplex und Heteroduplex Bands können leicht getrennt werden und mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) visualisiert. Das Vorhandensein von einem offenen Winkel zwischen abgestimmt und nicht übereinstimmende DNA-Stränge verursacht durch unvollkommene Glühen durch das Auftreten von Mutationen verursachen Heteroduplex DNA, deutlich langsamer als Homoduplex DNA-17zu migrieren. Unterschiedliche Migrationsmuster entstehen durch unterschiedliche Mutationen. Die heterozygoten Genotypen (Plpbp+ / ot101, Plpbp+ / ot102) würde daher Heteroduplex DNA-Fragmente, als auch das Compound-heterozygot (Plpbpot101/ot102) (Abbildung anzeigen 4a-B). Präzise Genotypisierung ergibt sich durch diese Heteroduplex Assay schmelzen, wie ein einzigartiges Seite Muster sich für jeden Genotyp ergibt und unterschiedliche heterozygote Mutationen visualisiert werden (Abbildung 4A-B). Reinerbige Mutanten würde eine Homoduplex Muster in die Seite Gel anzeigen und daher WTs nicht zu unterscheiden. Um diesen Genotypen zu unterscheiden, sollte eine weitere Runde der Seite Gel Analysen in die PCR-Produkte von WT Allele müssen mit den Proben untersucht werden, vermischt werden, wie an anderer Stelle17beschrieben durchgeführt werden.
Etwa 90 % (88/98) von WT und heterozygot Embryonen wurden erfolgreich bis zum Erwachsenenalter erhöht (> 2 Monate). Wie aldh7a1 und Plpbp der Verlustfunktion Mutanten, die einen frühen Tod Phänotyp anzeigen, konnte unbehandelte Tieren nicht bis zum Erwachsenenalter erhöht werden. Allerdings waren die Genotypen von allen Überlebenden WT und heterozygot Erwachsenen identisch mit Larven Fin Clipping Ergebnissen, zeigt eine 100 % Trefferquote für die Identifizierung von Genotypen mit dem Larvenstadium Fin-Biopsie-Verfahren.
Abbildung 1: Larval Fin Clip. (A). nicht durchtrennt Larven Fin an drei Tagen nach Befruchtung (Dpf). Die Linie stellt die Website der Durchtrennung, befindet sich in der Pigment-Lücke. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die Grenze der kaudalen Durchblutung. (B). Larve folgenden fin Clipping Verfahren bei 3 Dpf. (C). Larven Zebrafisch Fin nachwachsen auf 5 Dpf. FIN-Regeneration von einer blastemal Formation ist nur 2 Tage nach dem Fin Durchtrennung beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verfahren für Larven Fin Clipping. (A). die Larven befinden sich auf dem Band und überschüssige Embryonen Medium entfernt. Unter dem Mikroskop ist die Flosse in den Bereich des Spaltes Pigment durchtrennten wie in Figur 1Adargestellt. Mit einer Microscalpel, die Flosse gesammelt und auf ein Filterpapier gelegt Oberfläche einfach durch Berührung (B), und kann ohne weiteres als ein schwarzer Fleck sichtbar gemacht. Halten Sie das Stück Filterpapier mit der Flosse und schneiden Sie ein kleines Quadrat, rund um die gewünschte Region (C). Legen Sie das kleine Stück Filterpapier mit der Flosse in einen Brunnen von einer 96-well-Platte (D). Die entsprechenden Larve sollte in das entsprechende gut von einem flach-Boden-96-Well-Platte in 200 µL der Embryo Medien (E) platziert werden. Das Stück Filterpapier darf in der Lyse-Lösung (F) in Wasser getaucht werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Genotypisierung von aldh7a1 heterozygot Flanke von Larven Fin Biopsien. (A). Erwartete Ergebnis Verstärkung des WT und aldh7a1ot100 Allele in einem 434 bp Amplikons führt. 293-bp Band entsteht durch Verstärkung des mutierten Allels (aldh7a1ot100, 5-bp Insertion), und eine 195-bp-Band ergibt sich für das WT-Allel. (B). Beispiel PCR Verstärkung von aldh7a1 Larven Fin Gewebe. Bahn 7 zeigt ein 1 kb Molekulargewicht Marker. Bahnen 1 bis 6 stehen für eine single-Fin-Biopsie. PCR-Ergebnisse ermitteln aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) Genotypen (Spur 1), aldh7a1+ / heterozygote Genotypen (aldh7a1+ / ot100) (Bahnen 3, 4 und 5) und () WT aldh7a1+ / +) Genotypen (Bahnen 2 und 6). (C). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und aldh7a1ot100 Allel zeigt die Position der Mutation 5-bp einsetzen. Diese Zahl wurde von den ergänzenden Abbildung 5 der Pena Et Al. angepasst. 9 mit Erlaubnis von der Genetics Society of America. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Genotypisierung von Plpbp compound heterozygot (2 bp Löschung 4 bp Deletion) von Larven Fin Biopsien. (A). Erwartete Ergebnis wo Verstärkung des WT-Allels in einer 272-bp Amplikons geführt. Das 4-bp Löschung Allel (Plpbpot101) und die 5-bp-Substitution mit 2-bp Löschung Allel (Plpbpot102) produzieren bzw. Amplikons Längen von 268-bp und 270-bp. Ein Heteroduplex wird zwischen einem WT-Allel und die mutierten Allels in ein heterozygoter Genotyp (Plpbp+ /-) gebildet. Bildung von Heteroduplex durch unpassende Allele verursacht Retardierung der Band innerhalb des Gels im Vergleich zu den WT-Homoduplex. (B). PCR Verstärkung aus Larven Fin Ausschnitte der Nachkommen von einer Plpbp+ / ot101X plpbp+ / ot102 überqueren. 1 kb Molekulargewicht Marker ist in Spur 1 gezeigt. 2-10 Bahnen vertreten eine single-Fin-Biopsie. PCR-Ergebnisse identifizieren mutierte Genotypen (Plpbp-null compound heterozygot Plpbpot101/ot102, Spuren 2, 4 und 8), Heterozygote Genotypen (Bahnen 3, 6, 7, 9 und 10) und WT Genotypen (Bahn 5). (C). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und Plpbpot101 Allel zeigt die Position des 4-bp Deletion-Mutation. (D). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und Plpbpot102 Allel zeigt die Position des 2-bp-Löschung und 5-bp-Substitution (Fett). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Komponenten | 20 μl Reaktion | 100 Reaktionen | Endgültige Konz. |
| Nuklease-freie H2O | 7,45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| Primer Gen1_FW | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Primer 5 nt-ins-specific_FW | 0,3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Primer Gen2_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Grundierung WT-specific_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabelle 1. Reaktionsbedingungen für Multiplex PCR für verwendet die aldh7a1 Allel in diesem Protokoll. Die Primer verwendet werden wie folgt: Gen1_FW-5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-Specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3", und "WT-Specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ". Primer-Bestände wurden 10 µM.
| Komponenten | 13 μl Reaktion | 100 Reaktionen | Endgültige Konz. |
| H2O | 3.25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6.25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| Grundierung FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| Grundierung RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabelle 2: Reaktionsbedingungen für die PCR verwendet für Plpbp Allel in diesem Protokoll. Der forward Primer verwendet wurde PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "und die umgekehrte, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3". Primer-Bestände wurden 10 µM.
| Zyklus-Schritt | Temp. | Zeit | Zyklen |
| Anfängliche Denaturierung | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Denaturierung | 95 ° C | 30 Sek. | 36 |
| Glühen * | X ° C | 30 Sek. | |
| Erweiterung | 72 ° C | 20 Sek./kb | |
| Letzte Erweiterung | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | halten |
Tabelle 3. In diesem Protokoll verwendeten PCR-Zustände.
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Discussion
Gen Bearbeitungstools beschäftigt waren einzuführen genau Mutationen und transgene im Zebrafisch in den letzten Jahren5,6,7,8. Wenn Sie Krankheit Modellierung im Zebrafisch durchführen, sind frühe Larven- oder juvenile Phänotypen oft9,12,13,14beobachtet. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Extraktion von PCR-Ready DNA aus kleinen Zebrafisch Larven Schweif Biopsien, Genotypisierung von Larven im Alter von 3 Dpf ermöglichen. Früherkennung von Genotypen ist entscheidend für verschiedene Anwendungen im Labor, vor allem, wenn post Hoc Genotyp nicht möglich9. Genotypen von einem frühen Alter wissen erleichtert auch überleben Studien und phänotypische Analyse der Mutanten. Dieses Protokoll eignet sich auch besonders für die Aufnahme von Larven der spezifische Genotypen zur Reife. Larval Genotypisierung ist noch nicht weit verbreitet im Zebrafisch-Labors auf der ganzen Welt und dieses Protokoll zielt darauf ab, die Verbreitung dieser Technik zu erleichtern. Während die durchtrennten flossen zu manipulieren, bietet die Verwendung dieser Methode Vertrauen, das Vorhandensein von DNA in der Probe; die Fin-Biopsie kann ohne weiteres als einen dunklen Fleck auf dem Filterpapier in den Abfertigungsprozess visualisiert werden. Dies stellt eine wichtige Verbesserung des Protokolls von Wilkinson Et Al. veröffentlicht 16.
Mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind korrekt einzuhalten, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten. Zuallererst muss die Durchtrennung der Larven Flosse in der Pigment-Lücke, distale bis an die Grenze der Durchblutung, um Blutungen zu vermeiden auftreten. Dies sichert das Überleben der Larven während der Fin-Biopsie. Darüber hinaus muss ein schwarzer Punkt auf dem Filterpapier, markieren die Platzierung der Flosse beobachtet werden, vor dem Einlegen des Filterpapiers in die NaOH-Lösung. Dies sichert das Vorhandensein von Fin Gewebe (und somit DNA) in jeder Probe gut. Das Filterpapier muss auch innerhalb der NaOH-Lösung Zelle Lysis und erfolgreiche DNA-Extraktion garantieren eingetaucht werden. Dieses Protokoll wurde für jüngere Altersgruppen als 3 Dpf nicht getestet, da nur geschlüpfte Larven verwendet wurden. Genotyp jüngere Embryonen (ungeschlüpfte < 3 Dpf) Chorion Entfernung erforderlich wären. Für den Fall, dass nicht genügend PCR Verstärkung auftritt, sollte standard PCR Optimierungsstrategien angewendet (z. B. unterschiedliche Grundierung Konzentration, Glühen, Temperatur und/oder DNA-Konzentration). Obwohl genügend DNA extrahiert wird, um verschiedene Arten von PCR-Reaktionen (wie beispielsweise aldh7a1 und Plpbp Genotypisierung) erfolgreich durchzuführen, ist die Konzentration von DNA erhalten Fin Clipping folgt klein (~ 5 ng/µL pro Probe) und somit Erhöhung der Konzentration von DNA in der PCR-Reaktion für mehr Erfolg der Verstärkung gestatten.
Die Larven Fin DNA extrahiert mit diesem Protokoll einsetzbar für mehrere Amplifikationen, genaue Identifikation von Larven Zebrafisch Genotypen und in gewissem Sinne Hochdurchsatz-ermöglicht. Ein Heteroduplex schmelzen Assay in Seite Gele kann verwendet werden, um verschiedene Mutationen17zu identifizieren. Angesichts der Tatsache, dass ~ 30 μl DNA sich pro Probe ergibt, und ~ 1-1,5 μl DNA pro PCR-Reaktion verwendet wird, können rund 30 PCR-Reaktionen pro extrahierten Probe ausgeführt werden. Die PCR-Produkte eignen sich auch für Sanger-Sequenzierung-Anwendungen; hoher Qualität der Lesevorgänge wurden erhalten, ermöglicht genaue Bestätigung des WT und homozygot mutierten Sequenzen für aldh7a1. Genomische DNA-Extraktion aus Larven Zebrafisch hat viele Anwendungen in der Forschung. Das ursprüngliche Ziel bei der Entwicklung dieses Protokolls war effektiv Genotyp Larven, die Erwachsenenalter durch spezifische Mutationen in den aldh7a19nicht erreichen können. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Segregation von Genotypen und die Beobachtung der Epilepsie verbundenen Phänotypen speziell in aldh7a1- / - Fisch aus dem Larvenstadium Weiterreise9. Die Bündelung der Larven von jeder Genotyp für Ansätze z. B. RNA-Extraktion oder Metabolit Extraktion kann genau nach Genotypisierung mit dieser Larven Fin clipping Verfahren9ausgeführt werden. Zusammenfassend können ein erfahrener Ermittler nach kurzer Ausbildung dieses einfache und zeitsparende Protokoll erfordert nur minimale und kostengünstige Reagenzien, regelmäßig hunderte von Fin Clips pro Tag durchführen. Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die Erforschung von Pena Et Al. beschrieben und wird hoffentlich einen ähnlichen Zweck dienen, für die Allgemeinheit Zebrafisch.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchte die seltene Krankheitsmodelle und Mechanismus (RDMM) Netzwerk (gefördert durch den kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) und Genom-Kanada) zu danken. CK wird unterstützt durch ein Stipendium UROP (Universität von Ottawa). DLJ wird durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium unterstützt. IAP wird von einem kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) postdoctoral Fellowship Award unterstützt. Die Autoren danken der Genetics Society of America für die Erteilung der Erlaubnis, dieses Protokoll zu veröffentlichen und zu verwenden, eine Anpassung des zusätzliche Abbildung 5 von Pena, Et Al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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