Summary
Zebrafisk har använts som tillförlitlig genetisk modellorganismer i biomedicinsk forskning, särskilt med tillkomsten av genredigering teknik. När larval fenotyper förväntas, kan DNA extraktion och genotyp identifiering vara utmanande. Här, beskriver vi en effektiv genotypning förfarande för zebrafiskar larver, genom svansen klippning, så tidigt som 72-h efter befruktning.
Abstract
Sebrafisken (Danio rerio) äger orthologues för 84% av de gener som förknippas med mänskliga sjukdomar. Dessutom, dessa djur har en kort generationstid, är lätt att hantera, Visa en hög reproduktionstakt, låg kostnad, och kan enkelt bli föremål för genetiska manipulationer av Mikroskop av DNA i embryon. Senaste framstegen inom genen redigering verktyg möjliggör exakt införandet av mutationer och transgener i zebrafiskar. Sjukdom modellering i zebrafiskar ofta leder till larval fenotyper och för tidig död som kan vara svårt för att tolka om genotyper är okänd. Detta tidig identifiering av genotyper är också behövs i experiment som kräver prov pooling, exempelvis i gen uttryck eller mass spectrometry studier. Omfattande genotypisk screening är dock begränsad av traditionella metoder, som i de flesta laboratorier utförs endast på vuxen zebrafiskar eller i efter döden larver. Vi tog upp detta problem genom att anpassa en metod för isolering av PCR-klar genomiskt DNA från levande zebrafiskar larver som kan uppnås så tidigt som 72 h efter befruktning (hpf). Denna tid och kostnadseffektiv teknik, förbättrad från ett tidigare publicerade genotypning protokoll, möjliggör identifiering av genotyper från mikroskopiska fin biopsier. Fenorna regenerera snabbt eftersom larverna utvecklas. Forskare kan sedan markera och höja de önskade genotyperna till vuxenlivet genom att utnyttja denna hög genomströmning PCR-baserad genotypning förfarande.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio) är en vertebrate organism som ofta används som en modell för sjukdom utredning samt när det gäller prekliniska tester av terapeutiska hypoteser1,2,3. Dessa djur har en kort generationstid, är lätt att hantera, Visa en hög reproduktionstakt, låg kostnad, och kan enkelt bli föremål för genetiska manipulationer av Mikroskop av DNA i embryon4. Genom den ökande utvecklingen av romanen transgena och gen redigering teknik såsom zink Finger nukleotider (ZFN)5TAL-liknande effektor nukleaser (TALENs)6,7och de klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepas (CRISPR) / CRISPR-associerade 9 (Cas9) system8, zebrafiskar är redo att avsevärt förbättra förståelsen av flera patologiska förhållanden. Dessa tekniker har använts för att skapa riktade knockouts i både somatiska och könsceller celler i zebrafiskar, effektivt engendering genetiskt modifierade djur8. Aktuella exempel i litteraturen är en framgångsrik utveckling av genetiska modeller av epilepsi och ämnesomsättningsrubbningar zebrafiskar3,9,10,11,12 .
Med de framsteg som gjorts i zebrafiskar gen editering, blivit snabba och tillförlitliga genotypning en obestridlig hastighetsbegränsande steget. Identifiering av specifika DNA mutationer angränsande till förutsedda editering target webbplats är ett viktigt steg i protokollet. Traditionellt, är genotypning tekniker av fin klippning vanligtvis endast utförs i juvenil eller vuxen zebrafiskar. Men tid som tillbringas prishöjande zebrafiskar till vuxen ålder (> 2 månader) avsevärt fördröjer framsteg inom forskning. I många fall kan inte vuxenlivet uppnås på grund av knockout av viktiga gener (t.ex. vid sjukdom modellering) eller vinst-av-funktion mutationer leder till skadliga fenotypisk effekter. Dessutom flera analyser kräver sammanslagning av larver, såsom i utvinning RNA eller metabolit, och således innebära tidigare identifiering av de genotyper som kan vara svårt när enda post hoc genotypning tekniker finns tillgängliga. Dessa ovan nämnda exempel belysa vikten av larval genotypning tekniker som samtidigt exakt och aktivera fullständig återhämtning och normal utveckling av larverna. Tidigt skede zebrafiskar genotypning verkar för närvarande inte användas i stor utsträckning; Detta återspeglas av de senaste publikationerna av sjukdomsmodeller där larver genotyper identifieras via post mortem genotypning i stället för genotypning före utförandet av experimentet12,13,14. I detta papper presenteras en larval fin klipp strategi som syftar till att förbättra tidigare etablerade genotypning förfaranden.
I förflutnan live strategier anställa proteinas K matsmältningen att genotyp zebrafiskar larver har lett till varierande polymeras-kedjereaktion (PCR) effektivitet15. Även om en mer nyligen publicerade mikroskopiska svans biopsi tekniken tillhandahålls mer lovande resultat16, kunde vi och andra grupper inte återge hög effektivitet och DNA återhämtning rapporteras av författarna. Ett stort bakslag i protokollet beskrivs av Wilkinson et al. 16 kunde vara överföring av svans vävnaden till PCR-röret. På grund av dess mikroskopiska storlek är det svårt att säkerställa att fenan ordentligt samlades in och ut genom pipettering. För att lösa denna barriär, har vi utvecklat ett förbättrat protokoll för genotypning stort antal levande zebrafiskar larver med nästan 100% effektivitet9. Använder en microscalpel, tas spetsen av svansen fin bort och placeras på en bit av filterpapper. Filter papper innehållande vävnaden kan lätt visualiseras och placerade i en PCR-röret. Genomiskt DNA-extraktion utförs sedan, följt av PCR-amplifiering av regionen av intresse till genotyp preparatet. Fördelarna med denna metod är en högeffektiv PCR, en låg falsk positiv ränta och en låg dödlighet. Dessutom, är genotypning av stora mängder embryon möjligt använder detta protokoll. Protokollet beskrivs häri kan fin-klippning av hundratals larver inom 2-3 h med detta tillvägagångssätt och korrekt identifiering av genotypbestämts fisk och svans förnyelse inom två dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som omfattar animaliska ämnen har godkänts och i enlighet med djurvård riktlinjer som tillhandahålls av kanadensiska rådet om djur vård och University of Ottawa djurvård kommittéer.
1. beredning
- Förbereda dissektion ytan genom att tejpa 9 cm petriskål lock med autoklav tejp över dess inre yta. Håll den i stereo-Mikroskop.
- Placera 3-5 dagar efter befruktning (dpf) zebrafiskar larver i en Petri skålen och söva i ˜1.5 mM Tricaine i 1 x E3 embryo media (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2).
- Avskuren i slutet av en P1000 pipettspetsen med ett par saxar eller ett rakblad till en diameter av 2 mm att rymma en 3 dpf larv med minimal stress.
2. fin klippning av zebrafisk larver
- Plocka upp en sövda larv med den modifierade P1000 mikropipett och placera zebrafiskar larven på placerade autoklav bandet på petriskål locket.
- Ta bort överflödig Tricaine lösning kring larven med hjälp av en mikropipett. Området bör vara så torr som möjligt att framgångsrikt avsnitt och plocka upp fin men fortfarande våta för att överleva.
- Med en mikro skalpell avsnitt i stjärtfenan i stereo-Mikroskop som anges i figur 1, som beskrivs i Wilkinson et al16. Under snittet, tillämpa en stadigt nedåtgående tryck inom pigment gap platsen för stjärtfenan, distala till gränsen av blodcirkulationen (figur 1A). Applicera lätt tryck att undvika att skada ryggsträng.
- Visualisera den sektionerad fin under mikroskopet och placera bit ovanpå spetsen av bladet microscalpel (figur 2A). Placera den microscalpel som innehåller fenan på ytan av en liten bit av filterpapper.
Obs: På grund av närvaron av melanocyter i den transected vävnaden, detta steg kan visualisering av fenan som en liten svart fläck (figur 2B). - Med sax och pincett (figur 2 c), överföring det filtrerpappret med fenan till en PCR-plattan med 96 brunnar, som innehåller 25 μL 50 mm NaOH lösning per brunn (figur 2D).
- Förbereda en platt-bottenplatta med 96 brunnar, numrering brunnen enligt etiketten av PCR-plattan. Använder modifierad P1000 pipetten fylld med 200 µL av färsk 1 x E3 embryo media, omsorgsfullt samla zebrafiskar larven med lätt tryck. Dosera larven i 96 brunnar vävnadsodling plattan, i samma bra nummer som PCR-plattan (figur 2E).
- Kontrollera att pappersfiltret väl är nedsänkt i lösningen (figur 2F). Rengöra bladet av microscapel och pincett mellan varje snitt att förhindra korskontaminering genom att doppa den i 70% EtOH lösning. Torka bladet med rent papper vävnad/torka.
- Upprepa steg 2,1-2,7 tills alla embryon har klippts.
- Lagra larver i plattan med 96 brunnar vid 28 ° C tills genotyperna har identifierats.
Obs: Embryo media behöver inte ändras, eftersom protokollet kan fullgöras enkelt på mindre än 2 dagar. Om mer tid behövs, rekommenderas en media förändring.
3. genomisk DNA-extraktion
- Täta det PCR-plattan med 96 brunnar och centrifugera proverna vid 1 000 x g för 1 min att se till att alla filter papper är nersänkta i NaOH-lösningen.
- För vävnad lysis, värma proverna i en termocykler vid 95 ° C i 5 min, därefter svalning till 4 ° C i 10 min.
- Tillsätt 6 μL av 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 till varje prov. Vortex.
- Kort Centrifugera plattan på 1 500 x g, under 5 minuter i rumstemperatur.
- Använd 1,5 μL av supernatanten DNA per PCR-reaktion.
- Förbereda en PCR till genotyp larverna, som visas i tabell 1-2.
Obs: Detta protokoll testades för två program: multiplex PCR-reaktioner avslöjar genotypen använda agaros gel9och heteroduplex smältande assay (HMA) avslöjar de genotyper som använder Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan)17.
4. alternativa genomisk extraktion med hjälp av ett kelaterande harts
- Komplett steg 2.5 genom att lägga till filterpapper med urklippta fenan en PCR-plattan med 96 brunnar, som innehåller 30 μL av 5% kelaterande harts (styren-divinylbensen-sampolymer som innehåller Parade iminodiacetate joner).
Obs: Denna typ av harts används ofta för vävnad lysis och beredning av PCR-klar DNA i ett snabbt och effektivt sätt18. - Följ steg 2,6-2,8 som anges.
- Försegla av PCR-plattan med 96 brunnar och kort Centrifugera proverna att se till att alla filterpapper är nedsänkt inom kelaterande kådan.
- För vävnad lysis, värma proverna i en termocykler vid 95 ° C i 15 min därefter svalning till 4 ° C i 10 min.
Obs: Detta steg kan Lys och efterföljande bindande av polar harts pärlor till cellulära komponenter medan DNA och RNA förblir i lösning. - Kort Centrifugera proverna till pellet harts pärlor och skaffar DNA i suspensionen.
- Följ steg 3.5-3.6 att slutföra genotypning proceduren.
5. programmet 1: Multiplex PCR följt av agarosgel analys
- Följande tabell 1, Ställ in en multiplex PCR-reaktion att aktivera diskrimineringen mellan homozygota mutanter, heterozygoter och WT larver. Använd en 96 brunnar termocykel för att utföra PCR reaktioner med cykling villkoren i tabell 3.
Obs: PCR reaktioner kan också utföras i några andra konventionella PCR termocykel. Detta exempel beskriver den PCR-strategi som används av Pena, o.a. 9 att identifiera aldh7a1 WT och 5-bp införande muterade alleler i samma multiplex reaktion. - Förbereda en 1% agarosgel i natriumborat buffert, målat med 1 x GelRed.
Obs: 20 x natriumborat buffertlagret är tillverkad av 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL ddH2O, pH justeras till 8,5 med 76 g borsyra och sedan avslutat till 2 L slutlig volym använder ddH2O. - Kör gelen i 1 x natriumborat buffert för 15 min på 250 V. För att underlätta processen, Använd om möjligt ett gel system som är kompatibelt med multikanal att möjliggöra högre genomströmning kapacitet genom att minska det dags att ladda prover.
- Bild gelen under ultraviolett (UV) ljus att tillåta diskriminering av de olika genotyperna.
6. tillämpning 2: Heteroduplex smältande Assay
- Förbereda sidan 12% geler med 1,5 mm spacer plattan och de 15-prover kammar. Förbered två sida geler med 12.21 mL ddH2O, 2,52 mL 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 mL 30% akrylamid, 250 μL av 10% ammonium persulfatoxidation (APS) och 20 μL av tetramethylethylenediamine (TEMED). Använda 1 x TBE buffert (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M borsyra och 0,002 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)) som kör buffert.
- Värm de PCR-produkterna vid 94 ° C i 5 min.
- Cool rören på is eller i termocyklern under 10 minuter vid 4 ° C.
- Ladda 10 μL per PCR prov och 8 μL av molekylvikt markör.
- Kör sidan 150 V i 1 x TBE använder en vertikal elektrofores system för 1 tim eller tills molekylvikt markören nästan når foten linjen av glasplattan.
- Bild gelen under UV-ljus att tillåta diskriminering av de olika genotyperna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten i protokoll demonstrerades genom genotypning avkomman av en heterozygot kors (aldh7a1/ ot100, här visas som aldh7a1+/-) ()figur 3A- C)9. Den aldh7a1ot100muterade allelen har en 5-baspar (bp) isättning i den första kodning exon av zebrafisk aldh7a1 genen som leder till frameshift och förlust-av-funktion på grund av en tidig stop kodon9. Fyra grundfärger användes i en multiplex reaktion för att erhålla tre distinkt band att skilja mellan WT, heterozygot (aldh7a1+ /-) och homozygot mutant (aldh7a1- / -) genotyper (från Pena, et al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', ”Gen2_RV”: 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', ”5 nt-ins-specific_FW”: 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', och ”WT-specific_RV”: 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Förstärkning av båda alleler som använder Gen1_FW och Gen1_RV primers resulterade i en 434-bp amplikon. Ett 293-bp band uppstod från specifik amplifiering av muterade allelen och ett 195-bp band erhölls specifikt för den WT-allelen, som visas i figur 3A. Efter PCR, 8 µL av varje 20 µL reaktionsvolym analyserades på en 1% agaros, natrium Borat gel, som visas i figur 3B. Tillräcklig larval DNA återfanns från 98% (n = 576) av proverna, vilket resulterar i en hög effektivitetsgrad för PCR. DNA-extraktion med hjälp av NaOH teknik erhåller i genomsnitt 4,7 0,5 ng/µL av larval DNA per prov efter fin biopsi förfarande, i ~ 30 µL volym. DNA-extraktion med hjälp av kelaterande harts resulterar i en liknande avkastning, i genomsnitt 3,8 0,5 ng/µL av DNA per prov. Denna mängd DNA samlas in från larval fin transections genererar PCR-klar genomiskt DNA av tillräcklig kvalitet för att möjliggöra identifiering av genotyper. Varje DNA-prov kan användas i ˜30 PCR-amplifiering reaktioner. Förstärkning produkter som framställts med hjälp av primers Gen1_FW och Gen2_RV kan också användas för sekvensering program9, som framgångsrikt identifierat 5-bp insättningspunkten i homozygot mutanter (aldh7a1- / -) (figur 3 c ). Sanger sekvensering utfördes via en extern tjänst för att testa om PCR-produkterna var lämpliga för denna ansökan. DNA-prover från agarosgel bekräftade homozygot mutanter och WTs (n = 3 varje) användes. Höga Phred19 Poäng (> 30) erhölls som anger hög kvalitet läsningar, utom de första och sista 40 baspar.
Detta protokoll sedermera brukade genotyp olika andra zebrafiskar mutationer av heteroduplex smältande analys. De plpbpot101 och plpbpot102 muterade allelerna av plpbp -genen (figur 4A-D) varje leda till en frameshift och tidig stop kodon. För att identifiera plpbp-null zebrafiskar larver, två primers användes för att förstärka den första kodning exon inklusive webbplatsen mutation (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'och plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). Förstärkning av plpbp fragmentet i WT djur resulterar i en 272-bp amplikon (homoduplex). Ospädd erhålls från plpbpot101 (4-bp radering allel, figur 4 c) består av ett fragment av 268-bp och som av den plpbpot102 (5bp-substitution, 2-bp radering allel, figur 4 d), 270-bp, som kan ses i figur 4A-B. Efter denaturering och glödgning, skulle PCR-fragmenten från heterozygot djur innehålla heteroduplex och homoduplex DNA17. Homoduplex och heteroduplex band kan lätt separeras och visualiseras med hjälp av polyakrylamid gelelektrofores (sidan). Förekomsten av en öppen vinkel mellan matchade och avvikande DNA-strängar som orsakas av bristfällig glödgning på grund av förekomsten av mutationer orsaka heteroduplex DNA att migrera i betydligt långsammare takt än homoduplex DNA17. Distinkta migrationsmönster produceras av olika mutationer. De heterozygota genotyperna (plpbp/ ot101, plpbp/ ot102) skulle därför Visa heteroduplex DNA-fragment, liksom föreningen-heterozygot (plpbpot101/ot102), (figur 4a-B). Exakt genotypning erhålls genom denna heteroduplex smältande assay som unikt sida mönster erhålls för varje genotyp och distinkta heterozygota mutationer kan visualiseras (figur 4A-B). Homozygot mutanter skulle visa ett homoduplex mönster i sidan gel och därför vara omöjlig att skilja till WTs. För att skilja dessa genotyper, bör ytterligare en omgång sida gel analyser utföras i vilken PCR-produkter från WT alleler behöver blandas med proverna studeras, som beskrivs på andra ställen17.
Ca 90% (88/98) av WT och heterozygot embryon togs framgångsrikt upp till vuxen ålder (> 3 månader). Som aldh7a1 och plpbp är förlust-av-funktion mutanter som visar en tidig död fenotyp, kan obehandlade djur inte höjas till vuxen ålder. Dock var genotyperna av alla överlevande WT och heterozygot vuxna identiska med larver fin klippning resultat, som visar en 100% noggrannhet för identifiering av genotyper med larver fin biopsi procedur.
Figur 1. Larval fin klipp. (A). icke-avhuggna larval fin på tre dagar efter befruktning (dpf). Linjen representerar platsen för transection, ligger inom pigment klyftan. Svart pilspetsen visar gränsen på stjärtfenan blodcirkulationen. (B). larv följande fin klippning förfarande på 3 dpf. (C). Larval zebrafiskar fin återväxt på 5 dpf. Fin förnyelse från en blastemal formation observeras endast 2 dagar efter fin transection. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Förfarande för larval fin klippning. (A). larverna placeras på bandet och överflödig embryo media tas bort. Under mikroskopet, är fenan transected på regionen i pigment klyftan som visas i figur 1A. Använder en microscalpel, fenan samlas in och placeras på ett filterpapper surface helt enkelt genom touch (B) och lätt kan visualiseras som en svart fläck. Håller bit av filtrerpappret med fenan och skär ett litet torg som omger önskad region (C). Placera den lilla bit av filtrerpappret med fenan i en bra 96 väl platta (D). Motsvarande larven bör placeras i motsvarande väl av en platt botten plattan med 96 brunnar i 200 µL av embryo media (E). Filtrerpapper lappa bör vara nedsänkt i Lys lösningen (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Genotypning av aldh7a1 heterozygot kors från larval fin biopsier. (A). Förväntade resultatet där förstärkning av både WT och aldh7a1ot100 alleler resulterar i en 434-bp amplikon. Ett 293-bp band uppstår genom förstärkning av muterade allelen (aldh7a1ot100, 5-bp införande), och ett 195-bp band erhålls för den WT-allelen. (B). exempel av PCR-amplifiering från aldh7a1 larver fin vävnader. 1 kb molekylvikt markör visas i lane 7. Lanes 1-6 varje representerar en enda fin biopsi. PCR-resultat identifiera aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genotyper (lane 1), aldh7a1+/- heterozygota genotyper (aldh7a1/ ot100) (körfält 3, 4 och 5) och WT ( aldh7a1+/ +) genotyper (körfält 2 och 6). (C). justering mellan sekvenserade WT och aldh7a1ot100 -allel som visar läget för 5-bp införande mutationen. Denna siffra var anpassad från den kompletterande figur 5 i Pena o.a. 9 med behörighet från Genetics Society of America. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Genotypning av plpbp sammansatt heterozygot (2 bp borttagning /4 bp borttagande) från larval fin biopsier. (A). Förväntade resultatet där amplifiering av WT-allelen resulterade i en 272-bp amplikon. Producerar amplikon längder 268-bp och 270-bp respektive den 4-bp radering allelen (plpbpot101) och 5-bp substitution med 2-bp radering allel (plpbpot102). En heteroduplex bildas mellan en WT-allelen och den muterade allelen i en heterozygot genotyp (plpbp+ /-). Bildandet av en heteroduplex på grund av obalansen alleler kommer att orsaka utvecklingsstörning i bandet inom gelen jämfört med de WT homoduplex. (B). PCR-amplifiering följd larval fin gräsklippet avkomman av en plpbp/ ot101x plpbp+/ ot102 cross. 1 kb molekylvikt markör visas i lane 1. Körfält 2-10 varje representerar en enda fin biopsi. PCR-resultat identifiera mutant genotyper (plpbp-null sammansatt heterozygot plpbpot101/ot102, körfält 2, 4 och 8), heterozygot genotyper (körfält 3, 6, 7, 9 och 10) och WT genotyper (lane 5). (C). justering mellan sekvenserade WT och plpbpot101 -allel som visar läget för 4-bp radering mutationen. (D). justering mellan sekvenserade WT och plpbpot102 -allel som visar placering av 2-bp radering och 5-bp substitution (fetstil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponenter | 20 μl reaktion | 100 reaktioner | Slutliga konc. |
| Nuclease-fri H2O | 7.45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| primer Gen1_FW | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| primer 5 nt-ins-specific_FW | 0.3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Primer Gen2_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Primer WT-specific_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabell 1. Reaktion villkor för multiplex PCR används för den aldh7a1 allel i detta protokoll. De primers som används är följande: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', ”Gen2_RV”: 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', ”5 nt-ins-specific_FW”: 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', och ”WT-specific_RV”: 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Det var 10 µM grundfärg aktier.
| Komponenter | 13 μl reaktion | 100 reaktioner | Slutliga konc. |
| H2O | 3.25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6,25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| primer FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| Primer RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabell 2. Reaktion villkor för PCR används för plpbp allel i detta protokoll. Forward primer används var PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 'och den omvända, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. Det var 10 µM grundfärg aktier.
| Cykel steg | Temp. | Tid | Cykler |
| Inledande denaturering | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Denaturering | 95 ° C | 30 SEK | 36 |
| Glödgning * | X ° C | 30 SEK | |
| Förlängning | 72 ° C | 20 SEK/kb | |
| Slutliga förlängning | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | Håll |
Tabell 3. PCR-villkor som används i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen redigeringsverktyg har anställts för att just introducera mutationer och transgener i zebrafiskar över tidigare år5,6,7,8. När du utför sjukdom modellering i zebrafiskar, observeras ofta tidiga larver eller juvenil fenotyper9,12,13,14. Det protokoll som presenteras här beskriver utvinning av PCR-klar DNA från små zebrafiskar larval svans biopsier, aktivera genotypning av larver så unga som 3 dpf. Tidig identifiering av genotyper är avgörande för flera laboratorium tillämpningar, särskilt när post hoc genotypning inte är möjligt9. Att veta genotyper från tidig ålder underlättar också överlevnad studier och fenotypiska analys av mutanter. Detta protokoll är också särskilt användbart för lyfta av larver av specifika genotyper till förfall. Larval genotypning ännu används inte ofta i zebrafiskar laboratorier över hela världen och detta protokoll syftar till att underlätta spridning av denna teknik. Samtidigt att manipulera transected fenor, ger användningen av denna metod förtroende när det gäller förekomst av DNA i provet, fin biopsi kan lätt visualiseras som en mörk fläck på filterpapperet under hela hanteringen. Detta är en viktig förbättring av protokollet publiceras av Wilkinson et al. 16.
Flera kritiska steg inom protokollet måste följas korrekt för att få kvalitetsresultat. Först och främst måste transection av larval fenan inträffa inom pigment klyftan, distalt gränsen för blodcirkulationen, att undvika blödning. Detta säkerställer överlevnaden av larverna under fin biopsi. Dessutom måste en svart prick på filterpapperet, markera placeringen av fenan, påpekas innan du placerar pappersfiltret i NaOH-lösningen. Detta försäkrar förekomsten av fin vävnad (och därför DNA) i varje prov väl. Pappersfiltret måste också vara nedsänkt i NaOH-lösningen att garantera cell lysis och framgångsrika DNA-extraktion. Detta protokoll har inte testats för yngre åldrar än 3 dpf som endast kläckta larver användes. Genotyp yngre embryon (okläckta < 3 dpf) chorion avlägsnande skulle krävas. I fall att otillräcklig PCR-amplifiering uppstår, bör standard PCR optimering strategier tillämpas (t.ex. varierande primer koncentration, glödgning temperatur och/eller DNA-koncentration). Även om tillräcklig DNA extraheras för att framgångsrikt utföra flera typer av PCR-reaktioner (som visas för aldh7a1 och plpbp genotypning exempel), koncentrationen av DNA som erhållits efter proceduren fin klippning är små (~ 5 ng/µL per prov) och således öka koncentrationen av DNA i PCR-reaktionen kan tillåta för större framgång av förstärkning.
Larval fin DNA extraheras med detta protokoll kan användas för flera förstärkning reaktioner, så att korrekt identifiering av larval zebrafiskar genotyper och hög genomströmning sätt. En heteroduplex smältande test på sidan geler kan användas för att identifiera olika mutationer17. Med tanke på att ~ 30 μL av DNA erhålls per prov, och ~ 1-1.5 μL av DNA används per PCR-reaktion, kan du köra ca 30 PCR-reaktioner per extraherade prov. PCR-produkterna är också lämpliga för Sanger sekvensering. hög kvalitet av läser erhölls, att tillåta korrekt bekräftelse av WT och homozygot muterad sekvenser för aldh7a1. Molekylärbiologisk-DNA-extraktion från larval zebrafisk har många tillämpningar inom forskning. Det ursprungliga målet för att utveckla detta protokoll var att effektivt genotyp larver som inte kan nå vuxen ålder på grund av specifika mutationer i aldh7a19. Dessutom aktiverat detta protokollet segregeringen av genotyper och observation av epilepsi-associerade fenotyper specifikt i aldh7a1- / - fisk från larvstadium framåt9. Sammanslagning av larver av varje genotyp för strategier som RNA-extraktion eller metabolit utvinning kan utföras korrekt efter genotypning använder denna larval fin klippning förfarande9. Sammanfattningsvis, efter en kort utbildning, kan en erfaren utredare använda detta enkelt och tidseffektivt protokoll, som kräver endast minimal och billig reagenser, rutinmässigt utföra hundratals fin klipp per dag. Användning av detta protokoll möjliggjort forskningen beskrivs av Pena o.a. och kommer förhoppningsvis tjänar ett liknande syfte för bredare zebrafiskar gemenskapen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de sällsynta sjukdomsmodeller och mekanism (RDMM) nätverk (finansieras av kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR) och Genome Canada). CK stöds av en UROP stipendiet (University of Ottawa). DLJ stöds av Vanier Kanada Graduate stipendium. IAP stöds av en kanadensisk institut för hälsa forskning (CIHR) postdoktorsstipendium award. Författarna tackar den Genetics Society of America för att bevilja tillstånd att publicera detta protokoll och använda en anpassning av den kompletterande figur 5 från Pena, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
