Summary
Sebrafisk har vært brukt som pålitelig genetisk modell organismer i biomedisinsk forskning, spesielt med advent av gen-redigering teknologiene. Når larver fenotyper forventes, kan DNA utvinning og genotype identifikasjon være utfordrende. Her beskriver vi en effektiv genotyperingteknologi prosedyre for sebrafisk larvene, av halen klipping, så tidlig som 72-h etter befruktning.
Abstract
Sebrafisk (Danio rerio) har orthologues for 84% av genene kjent for å være knyttet til menneskelige sykdommer. I tillegg disse dyrene ha kort generasjon, er lett å håndtere, vise en høy reproduktive rente, lave kostnader, og er lett mottakelig for genetisk manipulasjon av microinjection av DNA i embryoer. Nylige fremskritt innen genet redigeringsverktøy aktiverer presis innføring av mutasjoner og effekter av transgener i sebrafisk. Sykdom modellering i sebrafisk ofte fører til larver fenotyper og tidlig død som kan være utfordrende for å tolke hvis genotyper er ukjent. Denne tidlig identifisering av genotyper er også nødvendig eksperimenter krever eksempel pooling, slik som gene uttrykk eller masse massespektrometri studier. Imidlertid er omfattende genotypic screening begrenset av tradisjonelle metoder, som i de fleste laboratorier utføres bare på voksne sebrafisk eller i postmortem larver. Vi adresserte problemet ved å tilpasse en metode for isolering av PCR-klar genomisk DNA fra live sebrafisk larver som kan oppnås så tidlig som 72 h etter befruktning (hpf). Denne gangen og kostnadseffektiv teknikk, forbedret fra en tidligere utgitt genotyperingteknologi protokoll, kan identifikasjon av genotyper fra mikroskopiske fin biopsier. Finnene generere raskt som Larvene utvikler seg. Forskere er deretter merke og heve de ønskede genotyper til voksen ved å benytte denne høy gjennomstrømming PCR-baserte genotyperingteknologi prosedyren.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) er en virveldyr organisme mye brukt som en modell for sykdom undersøkelse så vel som for prekliniske testing terapeutiske hypoteser1,2,3. Disse dyrene ha kort generasjon, er lett å håndtere, vise en høy reproduktive rente, lave kostnader, og er lett mottakelig for genetisk manipulasjon av microinjection av DNA i embryo4. Gjennom økende utviklingen av romanen transgene og gene redigering teknologiene som sink-Finger nucleases (ZFN)5, TAL-lignende effektor Nucleases (TALENs)6,7og den gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentas (CRISPR) / CRISPR-assosiert 9 (Cas9) system8, sebrafisk er klar til å vesentlig forbedre forståelsen av patologisk betingelsene. Disse teknologiene har brukt til å opprette målrettede knockouts i både somatisk og germline celler i sebrafisk, effektivt engendering genetisk endret dyr8. Nyere eksempler i litteraturen er den vellykkede utviklingen av genetisk modeller av epilepsi og metabolske forstyrrelser i sebrafisk3,9,10,11,12 .
Med fremdriften i sebrafisk genomet redigering, blitt rask og pålitelig genotyperingteknologi et unektelig hastighetsbegrensning skritt. Identifikasjon av spesifikke DNA mutasjoner tilstøtende spådd genomet-redigering målområdet er en avgjørende fasen av protokollen. Tradisjonelt er genotyperingteknologi teknikker av fin klipping vanligvis bare utføres i juvenile eller voksen sebrafisk. Men tiden tilbrakte heve sebrafisk til voksen (> 2 måneder) forsinkelser betydelig fremskritt i forskningen. I mange tilfeller kan ikke voksen oppnås på grunn av fortrengingen i viktige gener (f.eks i sykdom modellering) eller gevinst-av-funksjon mutasjoner fører til fenotypiske skadevirkninger. I tillegg flere analyser krever av larvene, som RNA eller metabolitten utvinning, og dermed involvere tidligere identifikasjon av genotyper, som kan være utfordrende når bare legge hoc genotyperingteknologi teknikker er tilgjengelige. Eksemplene nevnte markere betydningen av larver genotyperingteknologi teknikker som samtidig presis og full gjenvinning og normal utvikling av larvene. Tidlig stadium sebrafisk genotyperingteknologi vises ikke for tiden å bli mye brukt; Dette gjenspeiles ved siste publikasjoner av sykdom modeller som larver genotyper identifiseres via post mortem genotyperingteknologi i stedet for genotyperingteknologi før eksperimentet12,13,14. I dette papiret vises en larver fin klipp strategi å forbedre tidligere etablerte genotyperingteknologi prosedyrer.
Tidligere strategier ansette proteinasen K fordøyelsen til genotype bor sebrafisk Larvene har ført til variabel utvalg kjedereaksjon (PCR) effektivitet15. Selv om en mer nylig publisert mikroskopiske hale biopsi teknikk gitt mer lovende resultater16, var vi og andre grupper ikke kjøpedyktig avbilde det høy effektivitet og DNA utvinning rapportert av forfatterne. Et stort tilbakeslag av protokollen beskrevet av Wilkinson et al. 16 kunne overføring av halen vevet til PCR røret. Mikroskopiske målene er det vanskelig å sikre at fin var riktig samlet og resept av pipettering. For å løse denne barrieren, har vi utviklet en forbedret protokoll for genotyperingteknologi stort antall levende sebrafisk Larvene med nesten 100% effektivitet9. Bruker en microscalpel, er spissen av halen fin fjernet og plassert på filter papir. Filteret arket som inneholder vevet kan lett visualisert og riktig plassert inn i et PCR-rør. Genomic DNA utvinning utføres deretter, etterfulgt av PCR forsterkning av regionen rundt til genotype prøven. Fordelene ved denne metoden inkluderer en høyeffektiv PCR, en lav falsk positiv rate og en lav dødelighet. I tillegg er genotyperingteknologi stort antall embryoer mulig bruker denne protokollen. Protokollen beskrevet her kan fin-klipping av hundrevis av Larvene innen 2-3 timer med denne tilnærmingen og riktig identifikasjon av genotyped fisk og hale regeneration innen to dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag er godkjent og er dyr omsorg retningslinjer gitt av den kanadiske Council på dyr omsorg og Universitetet i Ottawa dyr omsorg komiteer.
1. forberedelse
- Klargjør disseksjon overflaten ved taping 9 cm Petriskål lokk med autoklav tape over overflaten interiør. Plasser den under stereo-mikroskop.
- Plasser 3-5 dager etter befruktning (dpf) sebrafisk larver i en Petri rett og bedøve i ˜1.5 mM Tricaine i 1 x E3 embryoet media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7.2).
- Klipp av slutten av en P1000 pipette spissen med et par saks eller et barberblad til en diameter på 2 mm til en 3 dpf Larven med minimal belastning.
2. fin klipping av sebrafisk larver
- Plukke opp en bedøvet Larven bruker den endrede P1000 brønnene og plassere sebrafisk Larven på plassert autoklav tape på Petriskål lokket.
- Fjern overflødig Tricaine løsning rundt Larven ved hjelp av brønnene. Området bør være så tørr som mulig å delen og plukke opp fin men fortsatt våt å sikre overlevelse.
- Bruke micro skalpell, delen halefinnen under stereo-mikroskop som vist i figur 1, som beskrevet i Wilkinson et al16. I snitt, bruke en jevn press på pigment gapet området av halefinnen, distale til grensen på blodsirkulasjonen (figur 1A). Bruk milde press for å unngå skade på notochord.
- Visualisere inndelte fin under mikroskopet og plassere brikken på spissen av microscalpel blad (figur 2A). Plass microscalpel som inneholder fin på overflaten av et lite stykke filter papir.
Merk: På grunn av tilstedeværelsen av melanocytter i transected vev kan dette trinnet visualisering av fin en liten svart flekk (figur 2B). - Bruke saks og pinsett (figur 2C), overføres filter papir som inneholder fin en 96-brønns PCR platen, inneholder 25 μL 50 mM NaOH løsning per brønn (figur 2D).
- Forberede en flat bunn 96-brønns plate, nummerering brønnen etter etiketten for PCR platen. Bruker den endrede P1000 pipette fylt med 200 µL av fersk 1 x E3 embryoet media, nøye samle sebrafisk Larven bruke lett trykk. Dispensere Larven i 96-brønnen vev kultur plate, i samme nummer som PCR platen (figur 2E).
- Kontroller at filter papir er godt neddykket i løsningen (figur 2F). Rengjør bladet microscapel og pinsett mellom hvert snitt for å hindre kryss-kontaminering av dyppe den i 70% EtOH løsning. Tørk bladet med ren papir vev/tørk.
- Gjenta trinn 2.1-2.7 til alle embryoer har blitt avkuttet.
- Lagre Larvene i 96-brønnen platen på 28 ° C før genotyper har blitt identifisert.
Merk: Embryoet media ikke trenger å endres fordi protokollen lett kan gjennomføres på mindre enn 2 dager. Hvis mer tid er nødvendig, anbefales en media-endring.
3. genomisk DNA utvinning
- Sel på 96-brønns PCR plate og sentrifuger prøvene 1000 x g for 1 min sørge for alle dokumenter som filteret er neddykket i NaOH løsningen.
- For vev lyse, varme eksemplene i en thermocycler på 95 ° C i 5 min etterfulgt av kjøling til 4 ° C i 10 min.
- Legge til 6 μL 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 til hvert utvalg. Vortex.
- Kort sentrifuge platen ved 1500 x g, i 5 minutter ved romtemperatur.
- Bruke 1,5 μL DNA nedbryting per PCR reaksjon.
- Forberede en PCR til genotype larvene, som vist i tabell 1-2.
Merk: Denne protokollen ble testet for to programmer: multiplex PCR reaksjoner avsløre genotype agarose gels9og heteroduplex smelter analysen (HMA) avsløre genotyper bruker polyakrylamid gel geleelektroforese (side)17.
4. alternativ genomisk utvinning bruker en chelaterande harpiks
- Fullfører trinn 2.5 ved å legge til filter papir med avkuttet fin en 96-brønns PCR platen, inneholder 30 μL 5% chelaterande harpiks (styren-divinylbenzene copolymer inneholder parvise iminodiacetate ioner).
Merk: Denne typen harpiks brukes vanligvis for vev lyse og utarbeidelse av PCR-klar DNA i en rask og effektiv måte18. - Følg trinnene 2.6-2.8 som angitt.
- Seal 96-brønns PCR platen og kort sentrifuge prøvene å sikre at alle filter papir er neddykket i chelaterande harpiks.
- For vev lyse, varme eksemplene i en thermocycler på 95 ° C i 15 min etterfulgt av kjøling til 4 ° C i 10 min.
Merk: Dette trinnet kan lyse og påfølgende binding av polar harpiks perler til cellulære komponenter mens DNA og RNA fortsatt løsning. - Kort sentrifuge prøvene å pellets harpiks perler og få DNA i suspensjon.
- Fremgangsmåten 3.5-3.6 å fullføre genotyperingteknologi prosedyren.
5. programmet 1: Multiplex PCR etterfulgt av Agarose Gel analyse
- Følgende tabell 1, konfigurere en multiplex PCR reaksjon å aktivere diskriminering mellom homozygous mutanter, heterozygotes og WT larver. Bruk en 96-brønns termisk cycler for å utføre PCR reaksjonene med sykling forholdene beskrevet i tabell 3.
Merk: PCR reaksjonene kan også utføres i noen andre konvensjonelle PCR termisk cycler. Dette eksemplet beskriver PCR-strategi som brukes av Pena, et al. 9 for å identifisere aldh7a1 WT og 5-bp innsetting mutant alleler i samme multiplex reaksjon. - Forberede en 1% agarose gel i natriumborat buffer, med 1 x GelRed.
Merk: 20 x natriumborat reservelager er laget av 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL av ddH2O, pH justert til 8,5 med 76 g av borsyre og deretter fullført 2 L siste volum bruker ddH2O. - Kjør gel 1 x natriumborat buffer i 15 min på 250 V. For å forenkle prosessen, hvis mulig, bruk en gel system som er kompatibel med Pipetter for flergangsbruk aktivere høyere produksjon evner av slankende klokken å laste prøver.
- Bilde gel under ultrafiolett (UV) lys at diskriminering av de ulike genotyper.
6. programmet 2: Heteroduplex smelter analysen
- Forberede side 12% gels med 1,5 mm avstand platen og 15-prøver kammene. Forberede to siden gels med 12.21 mL ddH2O, 2.52 mL 10 x Tris/Borate/EDTA (TBE), 10 mL av 30% akrylamid, 250 μL av 10% ammonium persulfate (APS) og 20 μL tetramethylethylenediamine (TEMED). Bruk 1 x TBE buffer (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M borsyre og 0.002 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)) som kjører buffer.
- Varme PCR produktene 94 ° C i 5 minutter.
- Cool rørene på isen eller i thermocycler i 10 min på 4 ° C.
- Last 10 μL per PCR prøve og 8 μL molekylvekt markør.
- Kjøre siden på 150 V 1 x TBE med en vertikal geleelektroforese system i 1 time eller til molekylvekt markøren nesten når foten linjen av glassplaten.
- Bilde gel under UV-lys at diskriminering av de ulike genotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av betraktelig ble demonstrert av genotyperingteknologi avkom av en heterozygote cross (aldh7a1/ ot100, her vist som aldh7a1+/-) ((figur 3A)- C)9. Aldh7a1ot100mutant allelet har en 5-base par (bp) innsetting i den første koding ekson av sebrafisk aldh7a1 genet som fører til frameshift og tap-av-funksjon på grunn av en tidlig stopp codon9. Fire primere ble brukt i en multiplex reaksjon for å få tre særegne band å skille mellom WT, heterozygote (aldh7a1+/-) og homozygous mutant (aldh7a1- / -) genotyper (fra Pena, et al. 9): Gen1_FW 5-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ","Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3", "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ", og"WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3"). Forsterkningen på begge alleler bruker Gen1_FW og Gen1_RV primerne resulterte i en 434-bp amplicon. En 293-bp band oppsto fra bestemte forsterkning av det muterte allelet, og en 195-bp band ble utviklet spesielt for WT allelet, som vist i figur 3A. Etter PCR, 8 µL av hver 20 µL reaksjon ble analysert på en 1% agarose/natrium borate gel, som vist i figur 3B. Tilstrekkelig larver DNA ble gjenopprettet fra 98% (n = 576) av prøvene, resulterer i en høy PCR effektivitetssats. DNA utvinning ved hjelp av NaOH teknikken henter gjennomsnittlig 4.7 0,5 ng/µL av larver DNA per prøve følgende fin biopsi prosedyren i ~ 30 µL volum. DNA utvinning bruker chelaterande harpiks resulterer i en lignende avkastning, gjennomsnittlig 3,8 0,5 ng/µL av DNA per prøve. Dette beløpet av DNA fra larver fin transections genererer PCR-klar genomisk DNA av tilstrekkelig kvalitet å tillate for identifikasjon av genotyper. Hver DNA-prøve kan brukes i ˜30 PCR forsterkning reaksjoner. Forsterkning produkter får primere Gen1_FW og Gen2_RV kan også brukes for sekvensering programmer9, som identifisert 5-bp innsetting i homozygous mutanter (aldh7a1- / -) (Figur 3 c ). Sanger sekvensering ble utført via en ekstern tjeneste for å teste om PCR produktene var egnet for dette programmet. DNA-prøver fra agarose-gel bekreftet homozygous mutanter og WTs (n = 3 hver) ble brukt. Høy Phred19 score (> 30) ble oppnådd viser høy kvalitet lyder, bortsett fra de første og siste 40 base parene.
Denne protokollen ble senere brukt til genotype ulike andre sebrafisk mutasjoner av heteroduplex smelter analyse. De plpbpot101 og plpbpot102 mutant alleler av plpbp genet (figur 4A-D) hver føre til en frameshift og tidlig stopp codon. For å identifisere plpbp-null sebrafisk larvene, to primere ble brukt til å forsterke den første koding ekson inkludert webområdet mutasjon (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "og plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3"). Forsterkning av plpbp fragment i WT dyr resulterer i en 272-bp amplicon (homoduplex). Amplicon fra plpbpot101 (4-bp sletting allelet, figur 4C) består av et fragment av 268-bp og av plpbpot102 (5bp-substitusjon, 2-bp sletting allelet, Figur 4 d) 270-bp, som vist i figur 4A-B. Etter rødsprit og avspenning inneholder PCR fragmenter fra heterozygote dyr heteroduplex og homoduplex DNA17. Homoduplex og heteroduplex kan være lett atskilt og visualisert ved hjelp av polyakrylamid gel geleelektroforese (side). Tilstedeværelsen av en åpen vinkel mellom samsvarende og DNA tilnærmingene skyldes imperfektum annealing på grunn av forekomsten av mutasjoner føre heteroduplex DNA overføre merkbart saktere tempo enn homoduplex DNA17. Forskjellige migrasjon er produsert av forskjellige mutasjoner. De heterozygote genotyper (plpbp/ ot101, plpbp/ ot102) ville derfor vise heteroduplex DNA fragmenter, samt sammensatt heterozygote (plpbpot101/ot102) (figur 4a-B). Presis genotyperingteknologi oppnås ved dette heteroduplex smelter analysen som en unik side-mønster hentes for hver genotype og tydelig heterozygote mutasjoner kan visualiseres (figur 4A-B). Homozygous mutanter ville vise et homoduplex mønster i siden gel og derfor være utvisket WTs. For å skille disse genotyper, bør en ny runde av siden gel analyser utføres i hvilke PCR produkter fra WT alleler måtte blandes med prøvene å bli studert, som beskrevet andre steder17.
Ca 90% (88/98) av WT og heterozygote embryo var vellykket reist til voksen (> 2 måneder). Som aldh7a1 og plpbp er tap-av-funksjon mutanter som viser en tidlig død fenotype, kan ubehandlet dyr ikke heves til voksen. Men var genotyper alle overlevende WT og heterozygote voksne identisk med larver fin klipping resultater, som indikerer en 100% nøyaktighet rate for identifikasjon av genotyper å larver fin biopsi fremgangsmåten.
Figur 1. Larver fin klippet. (A). ikke-kuttet larver fin på tre dager etter befruktning (dpf). Linjen representerer området av transection, ligger pigment gapet. Svart pilspissen demonstrerer grensen på caudal blodsirkulasjonen. (B). Larven følgende fin klipping prosedyren på 3 dpf. (C). larver sebrafisk fin gjenvekst på 5 dpf. Fin fornyelse fra en blastemal formasjon er observert bare 2 dager etter finsk transection. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Prosedyre for larver fin klipping. (A). Larvene er plassert på båndet og overflødig embryoet media er fjernet. Under mikroskopet, er fin transected på regionen pigment gapet som vist i figur 1A. Bruker en microscalpel, fin samles og plasseres på et filter papir overflaten ved berøring (B), og kan visualiseres lett en svart flekk. Hold filter arket som inneholder fin og skjære en lite kvadrat som innkretset ønsket område (C). Sett lite stykke filter papir som inneholder fin i en godt av en 96 godt plate (D). Tilsvarende Larven plasseres i tilhørende godt av 96-brønnen-bunnplaten i 200 µL av embryoet media (E). Filter papir stykket bør være neddykket i lyse løsningen (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Genotyperingteknologi aldh7a1 heterozygote kors fra larver fin biopsier. (A). Forventet resultat hvor forsterkning av både WT og aldh7a1ot100 alleler resulterer i en 434-bp amplicon. En 293-bp band oppstår fra forsterkning av det muterte allelet (aldh7a1ot100, 5-bp innsetting), og en 195-bp band er oppnådd for WT allelet. (B). eksempel av PCR forsterkning fra aldh7a1 larver fin vev. En 1 kb molekylvekt markør vises i lane 7. Baner 1-6 hver representerer en enkelt fin biopsi. PCR resultater identifisere aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) genotyper (lane 1), aldh7a1+/- heterozygote genotyper (aldh7a1/ ot100) (baner 3, 4 og 5) og WT ( aldh7a1/ +) genotyper (baner 2 og 6). (C). justering mellom sekvensert WT og aldh7a1ot100 allelet viser plasseringen av 5-bp innsetting mutasjon. Dette tallet var tilpasset fra supplerende figur 5 av Pena et al. 9 med tillatelse fra genetikk Society of America. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Genotyperingteknologi av plpbp sammensatte heterozygote (2 bp sletting /4 bp sletting) fra larver fin biopsier. (A). Forventet resultat hvor forsterkning av WT allelet resulterte i en 272-bp amplicon. 4-bp sletting allelet (plpbpot101) og 5-bp substitusjonsbehandling med 2-bp sletting allelet (plpbpot102) produsere amplicon lengder 268-bp og 270-bp henholdsvis. En heteroduplex er dannet mellom en WT allelet og det muterte allelet i et heterozygote genotype (plpbp+/-). Dannelsen av en heteroduplex på grunn av armaturene alleler får retardasjon av bandet i gel sammenlignet WT homoduplex. (B). PCR forsterkning skyldes larver fin utklipp av avkom av en plpbp/ ot101x plpbp/ ot102 cross. En 1 kb molekylvekt markør vises i lane 1. Baner 2-10 hver representerer en enkelt fin biopsi. PCR resultater identifisere mutant genotyper (plpbp-null sammensatte heterozygote plpbpot101/ot102, baner 2, 4 og 8), heterozygote genotyper (baner 3, 6, 7, 9 og 10) og WT genotyper (lane 5). (C). justering mellom sekvensert WT og plpbpot101 allelet viser plasseringen av 4-bp sletting mutasjon. (D). justering mellom sekvensert WT og plpbpot102 allelet viser plasseringen av 2-bp sletting og 5-bp substitusjon (fet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponenter | 20 µL reaksjon | 100 reaksjoner | Siste Conc. |
| Nuclease-gratis H2O | 7.45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| primer Gen1_FW | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| primer 5 nt-ins-specific_FW | 0,3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Primer Gen2_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| Primer WT-specific_RV | 0,25 ΜL | 25 ΜL | 0.125 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabell 1. Reaksjonen forhold for multipleks PCR brukes til den aldh7a1 allelet i denne protokollen. Primere brukt er som følger: Gen1_FW 5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3", og "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ". Primer aksjer var 10 µM.
| Komponenter | 13 μl reaksjon | 100 reaksjoner | Siste Conc. |
| H2O | 3,25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6,25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| primer FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| Primer RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| DNA | 1,5 ΜL | -- |
Tabell 2. Reaksjonen forhold for PCR brukes for plpbp allelet i denne protokollen. Fremover primer brukes ble PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "og omvendt, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3". Primer aksjer var 10 µM.
| Syklus trinn | Temp. | Tid | Sykluser |
| Første rødsprit | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Denaturing | 95 ° C | 30 sek | 36 |
| Avspenning * | X ° C | 30 sek | |
| Utvidelse | 72 ° C | 20 sek/kb | |
| Endelig utvidelse | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | Hold |
Tabell 3. PCR betingelsene brukes i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene redigeringsverktøyene har vært ansatt nettopp introdusere mutasjoner og effekter av transgener i sebrafisk siste år5,6,7,8. Når du utfører sykdom modellering i sebrafisk, er tidlig larver eller juvenile fenotyper ofte observert9,12,13,14. Protokollen presenteres her beskriver utvinning av PCR-klar DNA fra små sebrafisk larver hale biopsier, aktivere genotyperingteknologi av Larvene så unge som 3 dpf. Tidlig identifisering av genotyper er avgjørende for flere laboratorium programmer, spesielt når legge hoc genotyperingteknologi ikke er mulig9. Å vite genotyper tidlig Letter også overlevelse studier og fenotypiske analyse av mutanter. Denne protokollen er også spesielt nyttig for hevingen av larver av bestemte genotyper til forfall. Larver genotyperingteknologi ennå brukes mye ikke i sebrafisk laboratorier over hele verden og denne protokollen skal lette formidling av denne teknikken. Mens manipulerer transected finnene, gir bruk av denne metoden tillit til tilstedeværelsen av DNA i prøven; fin biopsi kan visualiseres lett som en mørk flekk på filter papir gjennom håndteringen prosessen. Dette representerer en viktig forbedring av protokollen publisert av Wilkinson et al. 16.
Flere kritiske trinn i protokollen etterfølges riktig for å få kvalitet. Først og fremst må transection av larver fin være innenfor pigment gapet, distale til grensen på blodsirkulasjonen, å unngå blødning. Dette sikrer overlevelse av Larvene under den fin biopsy. Videre må en svart prikk på filter papir, merking plasseringen av fin, følges før du plasserer filter papir i NaOH løsningen. Dette sikrer tilstedeværelsen av fin tissue (og derfor DNA) i hvert eksempel godt. Filter papir må også være nedsenket i NaOH løsningen å garantere celle lyse og vellykket DNA utvinning. Denne protokollen ble ikke testet for yngre alder enn 3 dpf som bare skravert Larvene ble brukt. Til genotype yngre embryo (unhatched < 3 dpf) plasmocitara fjerning ville være nødvendig. I tilfelle at utilstrekkelig PCR forsterkning oppstår, skal standard PCR optimalisering strategier anvendt (f.eks varierende primer konsentrasjon, annealing temperatur og/eller DNA konsentrasjon). Selv om tilstrekkelig DNA trekkes for å utføre flere typer PCR reaksjoner (som vist for aldh7a1 og plpbp genotyperingteknologi eksempler), konsentrasjonen av DNA oppnådd denne fin klipping fremgangsmåten er liten (~ 5 ng/µL per utvalget) og dermed øker konsentrasjonen av DNA i PCR reaksjonen kan tillate større suksess forsterkning.
Larver fin DNA utdraget med denne protokollen kan brukes for flere forsterkning reaksjoner, slik at nøyaktig identifikasjon av larver sebrafisk genotyper og høy gjennomstrømming. En heteroduplex smelter analysen i siden gels kan brukes til å identifisere ulike mutasjoner17. Gitt at ~ 30 μL DNA oppnås per prøve, og ~ 1-1,5 μL DNA brukes per PCR reaksjon, kan ca 30 PCR reaksjoner kjøre per utdraget prøve. PCR produktene er også egnet for Sanger sekvensering programmer. høykvalitets lyder ble innhentet, gir nøyaktig bekreftelse av WT og homozygous mutant sekvenser for aldh7a1. Genomic-DNA utvinning fra larver sebrafisk har mange programmer i forskning. Det opprinnelige målet for utvikling av denne protokollen var å effektivt genotype larver som ikke kan nå voksen alder på grunn av spesifikke mutasjoner i aldh7a19. I tillegg aktivert denne protokollen segregering av genotyper og observasjon av epilepsi-assosiert fenotyper i aldh7a1- / - fisk fra larvestadiet videre9. Av larver av hver genotype for tilnærminger som RNA utvinning eller metabolitten utvinning kan nøyaktig utføres etter genotyperingteknologi bruker denne larver fin klipping prosedyren9. I konklusjonen, etter en kort periode av trening, kan en erfaren etterforsker bruke denne enkle og tidseffektive protokollen, krever bare minimal og rimelig reagenser, rutinemessig utfører hundrevis av fin klipp per dag. Bruk av denne protokollen gjort mulig forskning beskrevet av Pena et al. og forhåpentligvis vil tjene en lignende formål for bredere sebrafisk samfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke sjelden sykdom modeller og mekanisme (RDMM) nettverk (finansiert av kanadiske institutter for helse forskning (CIHR) og Genome Canada). CK er støttet av en UROP scholarship award (Universitetet i Ottawa). DLJ støttes av en Vanier Canada Graduate Scholarship. IAP støttes av en kanadisk institutter for helse forskning (CIHR) postdoktorstipend award. Forfatterne takker de genetikk Society of America for å gi tillatelse til å publisere denne protokollen og bruke en tilpasning av supplerende figur 5 fra Pena, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
