Summary
Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.
Abstract
위장 (GI) 상피에 Enterochromaffin (EC) 세포 enteroendocrine 세포의 가장 큰 부분 모집단을 구성합니다. 특수 감각 세포로 EC 셀 luminal 자극을 감지 하 고 세로토닌 (5-hyroxytryptamine, 5-HT) 출시 이벤트로 그들을 변환. 그러나, 그들은 어려운 문화 하 고 식별 하는 때문에이 세포의 전기 생리학 이해 가난 하 게 된다. 이 종이 윤곽선 주 EC 세포 배양에 메서드 단일 셀 전기 생리학에 대 한 최적화. 이 프로토콜은 혼합된 기본 문화권에서는, 전압 및 전류 클램프 모드에서 전체 세포 생리학의 높은-품질 레코딩 취득에 접근을 전진 마우스 EC 셀을 식별 하기 위해 유전자 변형 시안색 형광 단백질 (CFP) 기자를 활용 합니다.
Introduction
위장 (GI) 상피는 여러 종류의 세포로 구성 된 다양 한 커뮤니티입니다. Enteroendocrine 셀 약 모든 상피 세포의 1%를 구성 하 고 enterochromaffin (EC) 세포가 가장 큰 enteroendocrine 셀 인구1. 최근 학문은 enteroendocrine2 와 EC3,4 셀 전기 고르기는 보여준다. 우리 주 EC 세포 생리학을 이해에 관심이 있습니다. 따라서,이 연구의 목적은 전체 세포 생리학에 대 한 최적화 된 기본 EC 셀 문화를 확립 했다.
생산 5-HT (예를 들어, QGP-15,6봉, KRJ-17) 분 비와 전기 생리학5,8 검사에 사용 되는 일반적으로에서 생성 된 기존 EC 셀 불후 종양 약 조직입니다. 이러한 셀 라인에서 획득 한 정보는 귀중 한5,8, 1 차 셀 전기 생리학의 연구 EC 세포 생리학을 제대로 이해 하는 데 필요한 있습니다. 기본 EC 셀의 전기 생리학 격리 상피 문화의 낮은 생존 능력에 의해 제한 된 단일 상피 세포의 문화 필요 합니다.
이 연구에서 제시 하는 문화 메서드 Tph1 CFP9,이 연구에 사용 된 같은 붙일 레이블된 EC 세포와 유전자 변형 쥐에 의존 합니다. 메서드를 사용 하면 최적화 혼합된 기본 상피 문화 개발 이전 단일 셀 전기 생리학32,10 . 이전 방법 효소 소화에 대 한 트립 신/EDTA 플러스 콜라 A 또는 EDTA와 DTT의 조합을 사용 하 고 특히 격리 하 고 기니 돼지11 와 쥐 EC 셀12문화 밀도 그라디언트를 사용. 더 최근에, 장 organoids는 생성 하 고 기계적 electrophysiological 녹음4에 대 한 중단 했다. 이러한 방법을 사용 하 여 문화는 세로토닌 실험, 실시간 정량 분석을 발표 하 고, 그들은 전기 생리학, 사용 될 수 있는 동안은 시간이 걸리는 organoid 세대, EC 셀을 식별 하기 위해 밀도 기울기의 성공에 의존 하 고는 트립 신, EDTA의 세포 파괴 효과입니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 효소 및 기계적 치료, 자란 조건 최적화 향상과 전기 생리학에 필요한 높은 휴대 전화 표준에 대 한 적합 한 단일 하 고 건강 한 EC 전지를 생산 하는 절차를 간소화.
이 메서드는 과학자 들을 불멸 하 게 문화 보다는 오히려 혼합된 문화 주 EC 셀에 작동 하 고 단일 셀의 전기 생리학을 조사를 위해 유용할 것 이다. 그러나, 그것은 덜 필요로 정렬 또는 장기 문화 생존 과거 72 h를 필요로 하는 세포 인구를 공부에 대 한 적절 한 증명할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 메이 요 클리닉에 의해 승인 되었습니다. 이 프로토콜의 기본 셀 문화 부분 이전에 게시 방법을 참조할 수 있는 추가 정보10을 기반으로 합니다. 모든 실험 절차 (IACUC)에 의해 찬성 되어야 한다 그리고 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 해야 합니다.
1. 문화 준비
-
미디어입니다.
- EC 셀 완전 한 문화 미디어 준비 높은 포도 당으로 [4500 mg/L] Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 보충 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스 (표 1).
참고: 미디어 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 한 달 동안. - EC 셀 완전 한 문화 미디어를 필터링 하 고 미디어의 25 mL 50 mL 튜브 37 ° c.에
- 높은 포도 [4, 500 mg/L] 0.1% 보충 DMEM 소화 미디어 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1).
- 소화 미디어를 필터링 하 고 별도 50 mL 튜브 4 10 mL aliquots 미디어의 장소 37 ° C 물 욕조에 품 어.
참고: 미디어 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 한 달 동안.
- EC 셀 완전 한 문화 미디어 준비 높은 포도 당으로 [4500 mg/L] Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 보충 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스 (표 1).
-
효소입니다.
- (공장)에 대 한 4 mg 또는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 콜라 사이 [≥800 단위/m g]의 24 mg (결 장)에 대 한 무게.
참고: 콜라는 최대 1 년 동안-20 ° C에서 안정적입니다. - 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +얼음 차가운 PBS의 1 mL에 aliquot 콜라 resuspend 와 동을 철저 하 게 결합 하 여, 얼음에 솔루션.
- (공장)에 대 한 4 mg 또는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 콜라 사이 [≥800 단위/m g]의 24 mg (결 장)에 대 한 무게.
-
코팅 문화 접시입니다.
- 얼음에 4 ˚C에서 하룻밤 세포 외 매트릭스의 150 µ L 해빙
- 얼음 처럼 차가운 높은 포도 당을 혈 청 무료 DMEM의 2 mL와 함께 해 동된 세포 외 매트릭스의 100 µ L를 혼합 하 여 5 %w / v 세포 외 매트릭스 솔루션을 확인 합니다.
참고: 기질 실 온에서 고형화 하 고 코트 요리 준비까지 미리 냉장된 펫, 튜브, 및 미디어 처리 합니다. - 즉시 5% 세포 외 매트릭스 솔루션의 250 µ L와 유리 하단 35 m m의 유리 내부 원 코트. 이 제조 법을 8 접시를 다룰 것입니다.
- 나머지 셀 문화 격리 단계 동안 37 ° C 배양 기에서 유리 하단 접시를 놓습니다. 세포 외 매트릭스 설정 1 h의 최소 소요 하지만 다른 격리 단계를 수행 하는 동안 최대 2.5 h에 대 한 알을 품을 수 있다.
참고: 외피 3 h 기질 방해 수 있는 빌드를 만들 수 있습니다 이상 인감 전체 세포 생리학 동안 형성.
2. 조직 분리
- 윤리 지침에 따라 희생 한 3to 6 주 된 남성 또는 여성 CFP Tph1 유전자 변형 마우스 (잭슨 실험실 주식: 028366)9 또는 다른 기자 스트레인.
참고: 우리 죽음을 보장 하기 위해 보조 수단으로 이산화탄소와 자 궁 경부 전위의 상승 수준의 치명적인 복용량을 사용 합니다. 안락사에 AVAM 위원회 또한 자 궁 경부 전위 동물은 진정 처음 하는 경우 그것의 사용에서 훈련 하는 개인에 의해 허용 기본 안락사 방법을 고려 합니다. - 21g 바늘을 사용 하 여 폴리스 티 렌 거품 해 부 무대에서 안락사 마우스를 밖으로 고정 합니다. 70% 에탄올과 마우스 복 오염을
- 마이크로 해 부 집게 (#5)를 사용 하 여 긴장 된 마우스 피부를 당겨 하 고 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 마우스 복 부 복 구멍을 노출 하단에 가로 절 개를 만들기 위해. 흉 곽 노출 될 때까지 복 부를 수직으로 다른 절 개를 확인 합니다.
- 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 맹 콜론의 명확한 보기를 달성 하기 위해 마우스의 왼쪽으로 이동.
- 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 두 번째 원심 배를 잘라 (하지만 여전히 직장에 인접) 콜론의 가장 말 초 부분을 잘라 하. 100 x 15 m m2 페 트리 접시에 추출 된 창 가득 20 mL의 얼음 처럼 차가운 인산 염 장소 식 염 수 (PBS) 버퍼링.
- 작은 눈금자를 사용 하 여 측정 하 고 중간 콜론 또는 공장의 10cm를 잘라. 결 장의 proximally 항문 위에 찍은 첫 컷에 있는 10 cm 세그먼트 밖으로 측정 하 여 추출. 반 전체 소장으로 접는 하 고 중간 지점에서 첫 번째 절 개를 하 고 두 번째 절 개를 10cm 첫 근 잘라 하 여 공장을 식별 합니다.
참고: 계속 얼음에 모든 후속 격리 단계를 수행 합니다. - 얼음 차가운 PBS를 가진 6 mL 주사기를 추출된 장 세그먼트의 루멘에 주사기 바늘을 놓습니다. 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 클램프 주사기 바늘 주위 내장을 봉인 하 고 부드럽게 떨어져 대변 린스를 루멘을 통해 PBS의 10 mL를 플러시.
- 장 조직을 반전 하 여 부드럽게 루멘을 통해 마이크로 해 부 집게 직물, 창 자 벽을 곤란 하 게는 집게의 끝에 인접 조직 축소. 세그먼트 내부-아웃 될 때까지이 과정을 반복 바깥쪽에 직면 하는 루멘과.
- 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 조직 세그먼트 1cm 조각으로 잘라.
- 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 조직 세그먼트 5 mL 살 균 PBS 가득 50 mL 비 커에 전송. 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 조직 조각 가스용 용기 일관성을 말하다.
- 전송 피 펫, 깨끗 한 50 mL 튜브에 다진 조직과 얼음 차가운 PBS의 15 mL를 놓습니다. 전송 피 펫과 2 번 triturate, 정착, PBS 상쾌한의 15 mL 고 신선한 PBS와 조직에 대 한 대기. PBS는 분명 때까지 세 번이이 프로세스를 반복 합니다.
- 얼음에 씻어 조직 조각 50 mL 튜브를 놓고 조직 문화 후드에 얼음 양동이가지고.
3. 효소 및 기계적 소화
-
첫 번째 소화
- 물 목욕에서 미리 데워 진된 소화 미디어의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브 중 하나를 검색 합니다. 50 mL 튜브에 PBS 콜라 솔루션의 다진된 장 조직 조각 250 µ L를 추가 합니다.
참고: 이전 세척 단계에서 어떤 PBS를 포함 하지 않도록 주의 하십시오. - 37 ° c.에서 5 분 (콜론 또는 공장) 50 mL 튜브 물 욕조에 배치 2 튜브를 흔들어 당 분 x.
참고: 최적의 타이밍 및 기계적 소화의 강도 다를 수 있습니다 및 사용자에 의해 결정 될 필요가 있을 것 이다. 최적의 소화 상태를 확인 하려면 각 소화 후 셀의 10 µ L 약 수를 볼 수 있습니다. 소화 1 년 동안은 상쾌한 셀의 덩어리로 이루어져 있어야 한다. - 천천히 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 한 번 조직 triturate. 짧게 조각 정착, 조직 하자 다음 전송 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 전체 10 mL을 제거 합니다.
- 물 목욕에서 미리 데워 진된 소화 미디어의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브 중 하나를 검색 합니다. 50 mL 튜브에 PBS 콜라 솔루션의 다진된 장 조직 조각 250 µ L를 추가 합니다.
- 2 소화: 3.1.1 3.1.3 단계를 반복 하십시오. 콜론을 소화 하는 경우 보육 시간 10 분을 증가 하 고 공장에 대 일 분에 보육 시간을 유지.
참고: 관찰, 시는 상쾌한 이루어져 있어야 한다 여전히 셀의 큰 덩어리. -
3 소화
- 3.1.1 단계 반복
- 50 mL 튜브 (콜론 또는 작은 공장) 10 분 동안 37 ˚C 물 욕조에 배치 합니다. 흔들어 튜브 소화 1과 2 보다 더 높은 강도로 분 당 2-3 배.
- 천천히 위아래로 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 조직 플라스틱. 짧은 시간에 대 한 정착 조직 조각 허용.
참고:는 상쾌한 단일 세포 및 작은 덩어리의 조합을 이루어져 있어야 한다. - 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에는 상쾌한의 10 mL를 배치, EC의 데워 세포 완전 한 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 및 혼합 한 번 반전.
- 실 온에서 5 분 동안 100 x g 에서 회전 시키십시오 다음 전송 피 펫을 사용 하 여 제거는 상쾌한. 전송 피 펫을 사용 하 여 따뜻하게 EC 셀 완전 한 문화 미디어의 2.5 ml에서 나머지 펠 릿 resuspend.
- 4 소화: 3.3.1 3.3.5 단계를 반복 하십시오. 콜론에 대 한 보육 시간 15 분을 증가 하 고 공장에 대 일 분 유지.
참고:는 상쾌한 이제 단일 셀로 이루어져야 합니다.
4. 세포 배양
- 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브 (5 mL 전체 볼륨)에 소화 3 및 4에서 수집 셀 정지를 결합.
- 계산 하는 hemocytometer와 고 회전 실 온에서 5 분 동안 100 x g 에서 나머지 세포 현 탁 액 셀의 10 µ L 약 수를 제거 합니다.
참고: 마지막 셀 서 스 펜 션은 작은 덩어리와 단일 세포의 구성 됩니다. - 전송 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 mL 당 1000000 세포의 밀도에 EC 셀 완전 한 문화 미디어에 펠 릿을 resuspend.
참고: 마지막 볼륨 세포 현 탁 액의 최종 세포 수에 따라 달라 집니다. 전형적인 세포 에서부터 2000000 4000000 계산합니다. - 인큐베이터에서 코팅된 유리 하단 문화 요리를 제거 합니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 최종 세포 현 탁 액의 250 µ L 각 문화 접시에서 세포 외 기질을 바꿉니다.
참고: 기질 코팅 유리 하단 접시의 가장자리에 충실 하는 경향이. 특별 해야 합니다 주의 젤 형성을 방지 하기 위해 가장자리에서 코팅을 제거 하. - 1mm에서 바위 억제제 Y-27632의 재고 솔루션을 확인 합니다. 각 접시에 10 µ M 바위 억제제의 작업 농도 달성 하기 위해 각 유리 하단 접시 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다.
참고:이 단계 공장 문화의 생존을 위해 중요 하지만 콜론에 대 한 선택 사항입니다. - 24 ~ 72 h (그림 1)에 대 한 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 각 문화 접시를 놓습니다.
5. 전체 셀 전기 생리학에 대 한 EC 셀의 준비
- 라인 두 5 x 0.5 cm 스트립 왁 스 영화는 오 링을 만들 현미경 스테이지의 내경. O-링 (그림 2A-B) 내에서 35 mm 셀 문화 접시를 탑재 합니다.
-
첨부 되지 않은 기질 또는 죽은 세포, 그리고 문화 미디어 혈 청에서 방해를 방지 하기 위해 EC 셀에서 완전히 봉인 EC 셀과 전극 사이의 형성 같은 두 부동 파편을 씻어. 철저 한 셀 전기 생리학에 대 한 충분 한 세척을 달성 하기 위해 다음 세가지의 사용:
- 옵션 1: 솔루션 exchange은 더 효율적인 긴 챔버에는 원형 보다 챔버. 때문에 EC 셀 라운드 35mm 요리에 교양 있었다, 요리에 대 한 플라스틱 타원형 삽입을 만듭니다.
- 3D 인쇄 또는 전통적인 밀링 방법으로 삽입을 만듭니다. 우리가 사용 하는 삽입 (mm)에 다음 크기와 아크릴 플라스틱에서 가공 했다: 외부 직경, 34.5; 안쪽 타원, 20 x 9; 외부 높이, 10; 내부 높이, 1.5; 다리 경 간, 3 x 3; 브릿지 클리어런스, 1.5; 입구와 출구, 4 x 4 각
- 삽입 (그림 2A-B) 문화 접시에 낮은 고 1.2 0.1 c m 사각형 (그림 2A-C) x 0.3 x에 클레이 모델링의 두 0.15 0.2 g 가지 현미경 스테이지의 상단에 그것을 확보.
- 플라스틱 전송 피 펫, 천천히 추가할 extracellular 해결책 접시 (입구)의 1 개의 측에 다른 쪽 (콘센트)에서 발음 하는 동안.
- 옵션 2: 엔지니어링된 플라스틱 삽입 하지 않고 추가 extracellular 솔루션 전송 피 펫에 의해 접시 (입구)의 한쪽에서 반대편 (출구)에서 발음 하는 동안. 천천히 (예를 들어, S w n) 반대편에 포부 바늘의 위치를 미러링 하는 동안 전송 피 펫 (예를 들어, N e s)의 위치를 회전 합니다.
- 옵션 3: 1.3.3 단계에서 사각형 coverslips에 외 투 기질., 4.4 단계에서 이러한 coverslips에 세포 현 탁 액 문화. 이 coverslip extracellular 솔루션, 5.1 단계를 생략 하 고 단계 5.3 건너뛰는 가득 직사각형 약 실에 전송 합니다. 옵션 1 (5.2.1.3)에 설명 된 대로 플라스틱 전송 피 펫에서 세포 외 솔루션 챔버를 씻어.
- 옵션 1: 솔루션 exchange은 더 효율적인 긴 챔버에는 원형 보다 챔버. 때문에 EC 셀 라운드 35mm 요리에 교양 있었다, 요리에 대 한 플라스틱 타원형 삽입을 만듭니다.
- 다시 연결 하는 거꾸로 한 현미경 (그림 2D) 위에 세포 배양 무대. 실 온에서 세포 외 혈 청 무료 솔루션의 EC 세포 배양 품 어.
- 4 시간 후, 위에서 설명한 대로 extracellular 해결책으로 다시 문화를 씻어. 전체 셀 전기 생리학 진행.
6. 전체 셀 주 문화에서 EC 셀의 전기 생리학
-
전체 셀 기가 물개를 달성
- 1-5 m ω의 저항을 한 다스 전극을 당겨.
참고: 10-100 GΩ 물개를 생성 하는 1-2 m ω 저항의 펫 잘 수행 합니다. 화재 전극 팁 연마 GΩ 물개를 달성 하기 위해 필요 하지 않습니다. - 균등 하 게 코트 폴리머와 모든 펫의 원뿔. 잡아 땅에 피 펫 수평 및 수직 열 총의 앞에. 천천히 돌려 피펫으로 폴리머 견고.
- 15 mL 원뿔 튜브에 세포내 솔루션의 약 수를 부 어. 1 mL 주사기를 통해이 솔루션의 1.2 mL 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송. 세포내 솔루션의 또 다른 0.7 mL 주사기로 철회 한다. 주사기의 끝에서 공기를 해소. 유연한 34g, 67 m m 바늘, 주사기를 연결 하 고이 바늘에서 남아 있는 어떤 공기를 밖으로 플러시.
- Tph1 식별-CFP + 셀을 다른 셀 또는 파편 접촉 하지 않습니다.
- 세포내 솔루션에 전극 팁을 채우십시오. 백필 주사기로 피 펫입니다. 신중 하 게 공기 거품 인터페이스를 쫓아 손톱으로 피 펫을 터치 합니다.
- 공기의 0.3 mL와 함께 그려진 플런저와 함께 6 mL 주사기 튜브 홀더의 콘센트에 연결 합니다. 전극 홀더에 탑재 합니다.
참고: 전극 밀봉 전에 세포내 솔루션 내에서 중립적인 또는 긍정적인 압력을 유지 하기 위해 목욕 솔루션을 입력 하기 전에 튜브에 주사기를 연결 합니다. - 첫 번째 단계에 전압 사다리 정상 활성화 전류를 기록 하 고 두 번째 단계에서 단일 전압으로 사용할 수 있는 전류를 기록 하는 2 단계 전압 클램프 프로토콜을 로드 합니다. 열 인감 테스트 (5 mV에 50 kHz).
- 목욕 솔루션으로 전극을 낮춥니다. Micromanipulators와 전극 팁에서-비행기와 직접 가로 셀에서 기동. 0.3 mL 주사기에서 공기의 추방.
- 부드럽게 전극 셀을 터치를 x 축 따라 수평으로 이동 합니다. 인감 테스트에 막 저항에 EC 셀 증가에 나타나는 보조 개에 대 한 감시. 필요한 경우, 또는 가로 셀의 중간 선 과거 이동 하지, x 축을 따라 z 축을 따라 아래로 전극 재조정.
- 0.1-0.2를 적용 6 mL 주사기에 mL 흡입. 100 m ω를 얻을 때까지 플런저를 꾸준히 잡고 플런저에서 그립을 놓습니다. 기가 물개를 기다립니다. 부드럽게 unscrewing 모션으로 주사기를 분리 합니다.
참고: 경우 EC 셀 처음 봉인 하지 않습니다, 그것 수 있습니다 다시 후속 시도 그것을 밀봉 하기 위하여. 이렇게 부드럽게 당겨 전극으로 EC 셀에서 < 20 m ω 인감 저항. micromanipulators로 보낸된 전극 스티어링, EC 대상된 셀 수동으로 분명 멀리 매트릭스 또는 파편 일주. 그런 다음, 신선한 전극으로 EC 셀을 봉인 하려고 합니다.
- 1-5 m ω의 저항을 한 다스 전극을 당겨.
-
레코드 전체 셀 전압-문이 나+ 현재.
- 0.5-1.0으로 그려진 3 mL 주사기를 연결 mL 공기. 흡입의 빠른 탭 적용 (0.1-0.5 mL) 3 mL 주사기에. 전체 셀 액세스를 얻을 때까지 반복 다음 주사기를 조심 스럽게 분리 합니다.
참고: 주사기의 성능을 처음 다를 수 있으며 점차 시간과 사용 (밀봉 집게 손가락 끝) 3 mL 주사기와 미리 연습 플런저 0.1-0.2에서 반동은 되도록 변경으로 mL의 시작의 위치. 그렇지 않은 경우에 다음 새로운 한 주사기를 교환. - 전체 셀 커패시턴스 보상을 켭니다. 커패시턴스와 직렬 저항을 조정 합니다. 시리즈 저항 보상을 켭니다. 60 ms에서 설정 하는 지연, 예측 후 수정 된 시리즈 저항 보상을 조정 합니다. 인감 테스트를 닫습니다.
- 전체 셀 전압-문이 나+ 전류(그림 3)의 5 실행의 평균을 기록 합니다.
- 나+ 전류 전압 개폐의 두 개의 매개 변수를 신속 하 게 숙지: 현재 창 (그림 3B, 빨간색 기호, 교차 정상 상태 활성화 및 비활성화 곡선의)와 피크 나+ 전류 전압 밀도입니다.
참고: EC 셀 피크 나+ 전류 전압 클램프 모드 일반적으로-50 pA 이끌려 잠재력 전류 클램프 모드에서를 갈 것입니다 보다 더 많은 함께. 또한, 전류 전압 클램프(그림 3)에서 다음 보통-200 pA 보다 큰 화재 막 잠재력 (빨간 선, 그림 3D) 근처의 전압에서에서 전류 클램프에 자발적으로 활동 전위는 창 현재 (빨간색 기호, 그림 3B).
- 0.5-1.0으로 그려진 3 mL 주사기를 연결 mL 공기. 흡입의 빠른 탭 적용 (0.1-0.5 mL) 3 mL 주사기에. 전체 셀 액세스를 얻을 때까지 반복 다음 주사기를 조심 스럽게 분리 합니다.
-
기록 활동 전위 elicited.
- 시리즈 저항 보상을 해제 합니다. 외부 명령을 해제 합니다. 클램프를 V-클램프에서 모드를 전환 합니다. 이득을 조정 합니다. 에피소드 현재 클램프 프로토콜을 로드 합니다. 양을 조절 하 여 전류를 0의 아빠 외부 명령 설정.
주의: 할 하지에서 전환 V-클램프-클램프 (또는 반대로) 첫 번째 외부 명령 해제 하지 않고. - 휴식 막 잠재력 note 그렇게 막 잠재력 현재 창 아래 읽습니다 입력 현재 지주를 조정 (예를 들어, -100-80 mV). 전류 입력의 단계 간격 (그림 3C 삽입, 현재 보유-3 pA + 2 pA 단계) 개최 현재 값 보다 작으면 에피소드 현재 클램프 프로토콜을 조정 한다.
- 기록 활동 전위 elicited. 전류 주입을 활동 전위의 최소 금액을 참고 (그림 3C, 청소 5, 들고-3 pA에서 + 4 pA 단계 3 + 1 pA =).
- 시리즈 저항 보상을 해제 합니다. 외부 명령을 해제 합니다. 클램프를 V-클램프에서 모드를 전환 합니다. 이득을 조정 합니다. 에피소드 현재 클램프 프로토콜을 로드 합니다. 양을 조절 하 여 전류를 0의 아빠 외부 명령 설정.
-
기록 자발적인 활동 전위입니다.
- 외부 명령을 해제 합니다. 전류 클램프 간격 무료 (비 에피소드) 프로토콜을 로드 합니다.
참고: 현재 간격 없는 클램프 프로토콜에서 전류를 들고 양의 셀에 적합 하도록 확인 되었습니다 때까지 다시 외부 명령을 설정 하지 마십시오. - 전류는 활동 전위를 발생 하지 않았다 이끌려 프로토콜에서 마지막 청소에 주입 액 현재 보유 변경 (두 번째 스윕 동안그림 3D, 전류 입력, 들고-3 pA에서 + 2 pA 단계-1 pA =).
- 외부 명령 설정. 이중 확인 현재 예측된 지주 막 잠재력 활동 전위를 임계값을 제공 합니다. 필요한 경우 현재 지주를 조정 합니다. 자연 스러운 활동을 기록 합니다.
- 외부 명령을 해제 합니다. 전류 클램프 간격 무료 (비 에피소드) 프로토콜을 로드 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
문화:
기본 murine 상피 세포 유전자 변형 Tph1 CFP 모델에서 만든 4 시간 후 요리에 첨부 하 고 24 ~ 72 h 사이 생리 실험에 대 한 준비가 되어. 문화 조건 최적화 되지 했다 때 상피 세포 배양 세포 파편, 손상 된 세포 막, 및 약한 CFP 신호 EC 세포 (그림 1A)에 떠 있는 큰 덩어리의 구성 되어 있습니다. 전기 생리학에 대 한 최적화 된 문화는 단일 세포 및 작은 수 풀으로 이루어져 있다. 건강 한 EC 세포는 밝은 CFP 형광에 의해 쉽게 발견 했다 하 고 활발 한 세척 (그림 1B) 후 접시에 여전히 준수 했다.
전기 생리학:
EC 전체 셀 30 ±7% 락 억제제 (50 문화에서 102 시도에서 27 전체 세포)와 콜론 문화에서 시도 하지만 시도 록 억제제 (22 문화에서 182 시도에서 29 전체 셀) 없이 콜론 문화에서 15 ± 4 %에 가져온 (< c1 > 그림 4A; p < 0.05 비패라메트릭 두 꼬리 t-테스트, 대 락 억제제와 없이 콜론 문화). 마찬가지로, 공장 EC 세포 없이 바위 억제제 전기 생리학을 위해 충분히 길게 살아나지 않았다, EC 동안 전체 셀의 시도 록 억제제 (50 문화에서 447 시도에서 186 전체 세포)와 공장 문화에서 41 ± 3 %에 가져온 (그림 4A; p > 0.05 비패라메트릭 두 꼬리 t-테스트, 공장 대 장 바위 억제제와 함께).
전체 셀 전기 생리학, 여 Na+ 전류 클램프 전압 모드와 전류 클램프 모드에서 활동 전위 (AP)에 기록 되었다. 나+ 전류 TPH1의 81.3 ±4.0 %에서 기록 된-CFP + 셀 공장 또는 콜론3에서 64.1 ±9.2 %에서. 공장 문화-25 pA 보다 더 큰 나+ 피크 전류를 전압 클램프에 의해 확인에서 59 EC 셀의 전류 클램프 모드에서 19 EC 셀 해 자발적인 AP ("자발적인"), 29 EC 셀 AP elicited 전류 클램프에 단계 프로토콜에서 경우에 발생 모드 ("elicited 전용") 및 11 EC 셀 않았다 하지 AP를 자발적으로 화재 또는 의해 단계 프로토콜 ("비-발사") (그림 4B). 자연 스러운 세포는 평균 피크 나+ 전류 밀도 (I최대)-108.0의 했다 ±19.3 pA/pF, elicited 전용 셀 했다 I-60.2의피크 ±9.2 pA/pF, 비 발포 셀 했다 I-43.3의피크 ±14 pA/pF (그림 4 B; p < 0.05, 자발적인 대 elicited 전용 또는 비 발사 그룹; p > 0.05 elicited 전용 대 비 발사 그룹). 전류 밀도 차이 전체 셀 커패시턴스의 반영 되지 않은, 자발적인 (3.3 ± 0.2 pF), elicited 전용 (2.9 ± 0.2 pF), 그리고 아닌 발사 (3.1 ± 0.3 pF) 세포 했다 유사한 전체 셀 커패시턴스 (P > 0.05). EC 셀 나+ 전류 및 이끌려 AP [나+]o 농도 NaV1.3 저해3했다.
그림 1 : 문화 결과의 대표 범위. DIC는 Tph1 CFP 마우스에서 기본 상피 공장 문화 epifluorescence 이미지 유리 하단 접시에 도금 고 24 h에 대 한 교양. 이 두 이미지는이 프로토콜에서 문화 결과의 범위를 보여 줍니다. CFP 형광 세포 (흰색) enterochromaffin (EC) 있습니다. (A) 전기 생리학에 대 한 품질 문화에서 대표 이미지. 문화 큰 덩어리, 손상 된 세포 막, 낮은 형광 신호, 및 부동 구성 되어 죽은 세포의 그룹. (B) 전기 생리학을 위해 최적화 된 문화에서 대표 이미지. 문화는 주로 단일, 건강 한 세포의 작은 수 풀은 접시에 준수 하는 구성 되어 있습니다. EC 셀이이 문화에 강한 형광 신호를 유지합니다. 눈금 막대 = 100 µ m; 패널은 배율된 1:1입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 전기 생리학에 대 한 세포의 준비 문화. 효율적이 고 철저 한 EC 세포 배양 세포 외 혈 청 무료 솔루션의 세 정에 대 한 전략은 세포 외 기질 및 인감 형성을 방해 하는 혈 청을 줄이기 위한 중요 합니다. (A) 자료입니다. 왼쪽 상단부터 시계 방향: 무대, 2 5 m m 넓은 스트립 왁 스 영화, 찰 흙, 플라스틱 전송 피 펫, #5 집게, 타원형 녹음 실, 35 m m 문화를 모델링의 두 200 mg 조각 유리 바닥 접시. (B) 준수는 무대의 내경을 왁 스 영화, 문화 접시에 타원형 챔버를 낮은 평평 하 게 흙 사각형 스트립으로. (C) 부드럽게 문화 접시 왁 스 영화 줄 단계에 누르고 무대에 상공에서 접시의 가장자리 위에 모델링 점토를 늘려서 기록 챔버를 고정. Extracellular 솔루션의 여러 볼륨으로 EC 셀 린스. (D) 돌아갑니다 무대는 거꾸로 한 현미경 위에 장착 브래킷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대표적인 전기 생리학 결과. (A) 전체 셀 나+ 전류, 2 단계 전압 클램프 프로토콜 (인세트)를 기록한. -120에서 50 ms depolarizations mV 0 2 단계 (○) 뮤직 비디오 채널을 아직 비활성화 하지 했다 활성화 추가 도발은 동안 1 단계 (●), 하는 동안 채널을 활성화 (즉, 열을 여전히 사용할 수 있습니다). 붉은 추적, 전류 전압 elicited 단계-120에서 0-40 mV. (B) 전류-전압 관계 패널 A, 피크 나+ 전류 (●, 정상 상태 활성화) 1 단계 또는 단계 2 (○, 정상 상태 비활성화). 정상 상태 활성화 및 비활성화 곡선의 교점 밝혀-40에서 현재 작은 창 mV (빨간색 기호). (C) 활동 전위 전류 자극 depolarizing 여 elicited. 활동 전위는 0 과거 불 수 mV (회색 선) 잠재적인 막 나+ 창의 현재 전압에 도달 하면 (레드 라인,-40 mV). 삽입, 전류 클램프 프로토콜, + 8 pA에 0-3의 베이스 라인에서 50 ms depolarizations에 대 한 주입 했다 아빠 (D) 활동 전위는-40에 depolarized는 자발적인 이벤트 꼭대기에서 발사 뮤직 비디오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 전체 세포 생리학의 처리량. (A) 부재 (-) 또는 바위 억제제 (10 µ M)의 존재 (+)에서 작품의 n 일 시도 당 전체 셀의 평균 백분율입니다. 공장에서 EC 셀 록 억제제 없이 문화에 24 시간 생존 하지 않았다. (B) 나+ 전류 밀도 n EC 셀, 활동 전위 (비 발사)를 발생 하지 않았다에서 전압 클램프로 측정 해 고 elicited 에피소드 전류 클램프 프로토콜에 의해 하는 경우에 (Elicited 전용), 또는 전류 클램프 간격-무료 모드 (자연)에서 자발적으로 해 고 (오차 막대는 SEM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EC 세포 기능을 완벽 하 게 이해 전체 세포 생리학에 대 한 셀을 생성 하는 높은-품질 주 문화 메서드를 필요 합니다. GI 상피의 기본 문화 어려운 낮은 생존 때문에 전통적으로 했다. 경감이 혼동 요인, 현재 메서드는 며칠 동안 살아남을 수 있는 작은 또는 큰 창 자에서 단 수 EC 세포의 문화를 생성 합니다.
우리는 다음 문화 전기 생리학에 적합 하도록 품질 향상을 위한 중요 한 발견: (1) 점 막 반전 보다는 그것, (2) 소화 미디어와 FBS BSA의 작은 금액을 추가 문화 미디어, (3) 낮추는 필 링은 콜라 사이 농도, (4) 조정 기간 및 수를 늘리기 위해 기계적 교 반 강도 및 바위 억제제와 경작과 낮은 농도, 그리고 (6)에 기질 도금 단일 셀, (5)의 건강.
마찬가지로, 다음 적응 패치 클램핑 하는 동안 전체 세포를 얻기 위한 중요 한 했다: 적어도 4 h, extracellular 솔루션에 서 서 셀 (1) 철저 하 게 rinsing extracellular 혈 청 무료 솔루션, (2) 시키는 EC와 문화 (3) 전극과 같은 보냈다 다시 어떤 purposing 실패 물개에서-도중 다음 EC 셀에, (4) 추가 10 µ M Gd3 + extracellular 솔루션 (있는 경우) 누설 전류를 차단 하 고 포유류 세포의 부착을 촉진 하기 위하여 파편을 멀리 맑게 하 유리에 정지입니다. 그러나 우리는 주의,는 Gd3 + 수 전압-문이 캘리포니아2 + 또는 mechanosensitive 채널 차단 EC 셀에 표현.
신중 하 게 자란 조건 최적화 하는 데에 불구 하 고 우리는 몇 가지 제한 사항을 발견: EC 셀을 완전히 첨부 ~ 72 시간 배양에서 후 만료 24 시간 필요 따라서, 그들은 그들이 electrophysiological 실험에 적합 될 것 이라고 때 48 시간 창이 있다. 종종 세포를 clumped 때문에 녹음에서 보상 될 수 없는 단일 EC 세포의 생성은 중요 한 커패시턴스 과도 소개 합니다. 그러나, 상피에서 EC 셀을 구분 하 여 셀 (즉, 높은 포도 당 미디어 소 태아 혈 청 및 인공 지하실 멤브레인으로 기질 꼭대기 바위 억제제) 아닌 네이티브 환경에서 살고 그리고 응답 수 있습니다. 자극에 전적으로 EC 셀의 대표는 vivo에서작동 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 EC 세포 주 배양 아직도 제공 한다 그들의 생리학에 대 한 통찰력을.
EC 셀 몸과 잘 작동 기 관을 유지 하는 중요 한 역할 그리고 등과 같은, EC 셀 전기 생리학에 대 한 이해를 개발 하는 많은 방법이 계속 있다. Enteroendocrine 및 EC 셀 전기 생리학은 불멸 하 게 셀 모델5,8,13, 기니 돼지11, 및 마우스3,4, 주 EC 셀 문화 조사 우리의 방법 셀 품질 보존 방법을 최소한 처리 및 네이티브 EC 셀을 반영 하는 문화를 만드는 데 사용 합니다. 우리는 Tph1-CFP, Tph1 존재9때 세포질에서 청록색 형광을 보여주는 유전자 변형 마우스 모델을 사용 합니다. 이 메서드는 또한 다른 기자 또는 계보 추적 enteroendocrine 셀 형식에 대 한 사용할 수 있습니다. 셀만 1 시간 미만 0.1 mg/mL (공장)와 0.6 mg/mL (콜론)의 최소 아직 효과적인 농도에 부드러운 콜라 사이에 노출 되는 우리의 방법은 또한 최소한의 시간에 효소 치료, 단일 EC 셀의 격리를 달성 한다. 이러한 수정 결과 EC 셀 electrophysiological 연구에 대 한 최적화 된 문화입니다.
성공적으로 전기 생리학 및 세로토닌 릴리스 murine EC 셀3에 공부를이 방법을 사용 했습니다. 능력을 성공적으로 분리, 식별, 그리고 문화 단일 EC 셀 용이 EC 세포 생리학에 대 한 연구에 중요 한 미래의 방향. 더 중요 한 경로 결정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다 및 채널 세로토닌과 다른 EC의 EC 셀 exocytosis 셀 전용 송신기 있습니다. 메서드 또한 격리 하 고 EC 셀 식별13acridine 오렌지를 사용 하 여 함께 인간 EC 세포의 생리 특성 수정 수 있습니다.
과학적인 프로토콜 개발, 것과 같이 통신 및 공평한 관찰이이 프로토콜의 문제 해결에 중요 한 했다. 우리가 우리의 문화의 생존을 위한 새로운 문화 방법을 테스트, 그건 형광 세포의 수를 계산 하는 생존 능력의 측정으로, 각 셀 밀도 접시, 그리고 많은 시간에 걸쳐 대표 사진 및 문화의 비디오 수집을 추정 하는 데 도움이 포인트입니다. 후 세포 문화에 24 h 과거 살아남을 수 있었다, 우리 전기 생리학 실험에 대 한 우리의 문화를 수정 했습니다. 이미지와 상세한 관측을 수집, 함께 그것은 기계적 소화와 보충 및 기질 농도, 조정에 관한 실험실 담당자 간의 명확한 의사 소통을 유지 하는 것이 중요 있도록 건강 한 EC 세포 준비 했다 electrophysiological 특성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
없음
Acknowledgments
저자는 관리 지원에 대 한 부인을 Lyndsay 버스 비와 씨 로버트 Highet 메이 요 클리닉 부문 엔지니어링 설계 및 3D 인쇄 문화 접시 삽입의에서 감사합니다. 이 작품 AB와 NIH에 셀 위장 (NIH P30DK084567)와 2015 미국 Gastroenterological 협회 연구 학술 상 (AGA RSA) 신호에 대 한 NIH K08 AB (DK106456), 조종사와 메이 요 클리닉 센터에서 ab 타당성 부여에 의해 지원 되었다 GF (DK52766)을 R01입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 15 mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1,000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6 mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3 mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).
