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Biology

Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Las células enterocromafines (EC) constituyen un subconjunto pequeño de las células epiteliales gastrointestinales. CE las células son eléctricamente excitables y liberación de serotonina, sin embargo, las dificultades en el cultivo y la identificación de células EC limitada estudios fisiológicos. El método presentado aquí establece un modelo de cultivo primario susceptible de examen de las células EC por electrofisiología.

Abstract

Las células enterocromafines (CE) en el epitelio gastrointestinal (GI) constituyen la mayor subpoblación de células enteroendocrinas. Como las células sensoriales especializadas, células CE sensación estímulos luminales y convierten en eventos de lanzamiento de la serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Sin embargo, la electrofisiología de estas células es mal entendido porque son difíciles para la cultura y para identificar. El método presentado en este papel contornos primaria CE los cultivos celulares optimizado para electrofisiología celular único. Este protocolo utiliza un reportero de la proteína fluorescente ciánica transgénicos (PPC) para identificar células de ratón CE en cultivos primarios mixtos, avanzar en el enfoque a la obtención de grabaciones de alta calidad de electrofisiología celular todo en modos de voltaje y corriente abrazadera.

Introduction

Epitelio gastrointestinal (GI) es una comunidad diversa que consta de varios tipos celulares. Enteroendocrinas células constituyen aproximadamente el 1% de todas las células epiteliales y células enterocromafines (CE) son el más grande células enteroendocrinas población1. Estudios recientes muestran que enteroendocrinas2 y CE3,4 células eléctricamente excitables. Estamos interesados en la comprensión de electrofisiología de la célula de primaria CE. Así, el propósito de este estudio fue establecer cultivos primarios de células de CE optimizados para electrofisiología celular todo.

Célula de CE existente líneas que producen y secretan 5-HT (p. ej., QGP-15, BON6, KRJ-17) y se han utilizado para estudiar la electrofisiología5,8 se generan típicamente de inmortalizó neoplásicas tejidos. Mientras que la información obtenida de estas líneas celulares es valioso5,8, estudios de electrofisiología celular primaria son necesarios para entender correctamente fisiología de la célula de CE. La electrofisiología de las células primarias de la CE requiere el aislamiento y cultivo de células epiteliales, que se ha visto limitada por la baja viabilidad de cultivos epiteliales.

El método de cultura presentado en este estudio se basa en ratones transgénicos con fluorescencia marcado CE las células, como Tph1-CFP9, utilizado en este estudio. El método optimiza la primaria mixto epiteliales culturas desarrollaron previamente2,10 de unicelular electrofisiología3. Los métodos anteriores utilizan combinaciones de tripsina/EDTA más A de colagenasa o EDTA y TDT para la digestión enzimática y utilizan gradientes de densidad para aislar específicamente y la cultura de conejillo de Indias11 y rata de células CE12. Más recientemente, organitas intestinales generaron y mecánicamente interrumpió las grabaciones electrofisiológicas4. Culturas mediante estos métodos son adecuadas para serotonina liberar experimentos, análisis de RT-qPCR y, aunque podría utilizarse para electrofisiología, dependen el éxito de la generación de organoide desperdiciador de tiempo, gradientes de densidad para identificar células de CE y la celulares efectos perturbadores de la tripsina y EDTA. Por el contrario, el protocolo descrito aquí mejora tratamientos enzimáticos y mecánicos, optimiza las condiciones de cultivo y agiliza los procedimientos para producir células CE únicas y saludables adecuadas para los estándares celulares necesarios para electrofisiología.

Este método será útil para los científicos que desean trabajar en las células primarias de EC en cultivos mixtos en lugar de culturas inmortalizadas y quieren investigar la electrofisiología de las células. Sin embargo, puede resultar menos adecuada para el estudio de poblaciones de células que necesitan cultivos de clasificación o a largo plazo que requieren supervivencia pasado 72 h.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Clínica Mayo. La porción de la cultura de célula primaria de este protocolo se basa en métodos previamente publicados que se pueden hacer referencia para más detalles10. Todos los procedimientos experimentales deben ser aprobados por el (IACUC), y todos los experimentos deben realizarse con arreglo a las normas y directrices pertinentes.

1. cultura preparación

  1. Los medios de comunicación.
    1. Preparar CE celular completo medios de cultivo con glucosa alta [4500mg/L] Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino Fetal (FBS), 1% L-glutamina y 1% penicilina-estreptomicina (tabla 1).
      Nota: Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por un mes.
    2. Los medios de cultivo completado CE célula del filtro y coloque 25 mL de medio en un tubo de 50 mL a 37 ° C.
    3. Preparar medios de digestión con glucosa alta [4.500 mg/L] DMEM suplementado con 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) (tabla 1).
    4. Filtro de los medios de comunicación de digestión y colocar cuatro alícuotas de 10 mL de medio en tubos de 50 mL separados e incubar en un baño de agua de 37 ° C.
      Nota: Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por un mes.
  2. Enzima.
    1. Pesar 4 mg (yeyuno) o 24 mg (dos puntos) de colagenasa XI [≥800 unidades/mg] en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      Nota: Colagenasa es estable a-20 ° C hasta por un año.
    2. Resuspender la colagenasa alícuota de 1 mL de PBS frío hielo con Ca2 + y Mg2 +. Vórtice la solución bien combinar, y coloque en hielo.
  3. Revestimiento placas.
    1. Descongele los 150 μL de matriz extracelular durante la noche a 4 ° c en hielo.
    2. Hacer una solución de matriz extracelular 5% w/v al mezclar 100 μl de matriz extracelular descongelada con 2 mL de DMEM libre de suero glucosa alta helada.
      Nota: Matriz extracelular se solidifica a temperatura ambiente y debe ser manejada con pipetas previamente enfriadas, tubos y medios de comunicación hasta platos de capa.
    3. Inmediatamente recubra el círculo de vidrio de platos de fondo de cristal de 35 mm con 250 μl de la solución de la matriz extracelular de 5%. Esta receta cubrirá hasta 8 platos.
    4. Coloque los platos de fondo de cristal en una incubadora de 37 ° C durante los pasos restantes de aislamiento de la cultura de célula. La matriz extracelular tiene un mínimo de 1 h a establecido pero puede incubarse hasta 2,5 h mientras se realizan otras medidas de aislamiento.
      Nota: Más tiempo 3 h puede crear una acumulación de matriz extracelular que puede impedir las incubaciones sello formación en electrofisiología celular todo.

2. tejido aislamiento

  1. Según las pautas éticas, sacrificar un 3Para 6 semanas de edad hombre o mujer Tph1-CFP transgénicos ratón (los valores de laboratorio de Jackson: 028366)9 u otra cepa de reportero.
    Nota: Utilizamos una dosis fatal de aumento de los niveles de dióxido de carbono y una luxación cervical como medio secundario para asegurar la muerte. El Comité de AVAM sobre la eutanasia también considera la dislocación cervical un método de eutanasia primaria permitida por individuos entrenados en su uso si los animales están sedados primero.
  2. Pin el ratón eutanasia hacia fuera en una etapa de la disección de la espuma de poliestireno utilizando una aguja de 21 G. Descontaminar el abdomen de ratón con etanol al 70%.
  3. Tire de piel de ratón tenso con unas pinzas de disección micro (#5) y luego usar sharp tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal en la parte inferior del abdomen para exponer la cavidad intraperitoneal ratón. Hacer otra incisión vertical hasta el abdomen hasta que la caja torácica está expuesta.
  4. Utilice las pinzas de disección micro para mover el ciego a la izquierda del ratón para obtener una visión clara de los dos puntos.
  5. Utilice las tijeras de disección micro para cortar la porción más distal del colon (pero todavía proximal al recto) y hacer un segundo corte distal hasta el estómago. Lugar los intestinos extraídos en un 100 x 15 mm2 caja de Petri con 20 mL de helado fosfato tampón salino (PBS).
  6. Utilice una pequeña regla para medir y cortar 10 cm de cualquiera medio colon o yeyuno. Extraer dos puntos midiendo el segmento de 10 cm de intestino situado proximalmente al primer corte tomado por encima del recto. Identificar el yeyuno doblando el intestino entero por la mitad y hacer una primera incisión en el punto medio y una segunda incisión de 10 cm proximal a la primera corte.
    Nota: Seguir para llevar a cabo todas las medidas de aislamiento posterior en el hielo.
  7. Llene una jeringa de 6 mL con PBS frío hielo y colocar la aguja de la jeringa en el lumen del segmento intestinal extraído. Utilice las pinzas de disección micro para fijar y sellar los intestinos alrededor de la aguja de la jeringa y suavemente enjuague 10 mL de PBS a través del lumen para enjuagar a materia fecal.
  8. Para invertir el tejido intestinal suavemente tejido el fórceps de disección micro a través del lumen, pellizcando una pared intestinal, y contracción del tejido proximal a la punta de las pinzas. Repita este proceso hasta que el segmento es de adentro hacia fuera con la luz hacia afuera.
  9. Utilice tijeras de disección micro para cortar el segmento de tejido en trozos de 1 cm.
  10. Utilizar pinzas de disección micro para transferir los segmentos de tejido en un vaso de precipitados de 50 mL con 5 mL PBS estéril. Utilice las tijeras de disección micro para picar las piezas de tejido con una consistencia licuada.
  11. Coloque el tejido picada y 15 mL de PBS frío de hielo en un tubo de 50 mL limpio con una pipeta de transferencia. Triturate 2 veces con la pipeta, esperar a que el tejido colocar, retirar 15 mL del sobrenadante de PBS y colocar con PBS fresco. Repita este proceso tres veces hasta que el PBS es claro.
  12. Coloque el tubo de 50 mL con piezas de tejido lavado sobre hielo y el cubo de hielo en una campana de cultivo de tejidos.

3. enzimática y mecánica de la digestión

  1. Primera digestión
    1. Desde el baño de agua, recuperar uno de los tubos de 50 mL que contiene 10 mL de medio de digestión precalentado. Al tubo de 50 mL, Añadir 250 μl de la solución de PBS colagenasa y piezas de tejido intestinal picada.
      Nota: tenga cuidado para evitar incluso cualquier PBS desde pasos anteriores de lavado.
    2. Coloque el tubo de 50 mL en un baño de agua durante 5 minutos (colon o yeyuno) a 37 ° C. Agitar el tubo de 2 x por minuto.
      Nota: La sincronización óptima y la intensidad de la digestión mecánica pueden variar y deberán ser determinada por el usuario. Para determinar las condiciones de digestión óptima, una alícuota de 10 μl de las células puede verse después de cada digestión. Durante la digestión de 1, el sobrenadante debe consistir en grupos de células.
    3. Triturate lentamente el tejido una vez con una pipeta serológica de 10 mL. Brevemente deje el tejido colocan piezas, entonces utilizar una pipeta para extraer el entero 10 mL del sobrenadante.
  2. Segunda digestión: Repita los pasos del 3.1.1 a 3.1.3. Aumentar el tiempo de incubación de 10 min si digerir colon y mantener el tiempo de incubación a 5 min de yeyuno.
    Nota: A observación, el sobrenadante debe todavía consisten en grandes masas de células.
  3. Tercer digestión
    1. Repita el paso 3.1.1
    2. Coloque el tubo de 50 mL en un baño de agua de 37 ° c durante 10 min (colon o yeyuno pequeño). Agitar el tubo de 2-3 veces por minuto a una intensidad más alta que las digestiones 1 y 2.
    3. Lentamente Pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 mL. Deje que las piezas de tejido colocar para un a corto plazo.
      Nota: El sobrenadante debe consistir en una combinación de las células y grupos pequeños.
    4. Utilizar una pipeta Coloque 10 mL de sobrenadante en un nuevo tubo de 15 mL, agregar 2 mL caliente CE la célula completado de medios de cultivo y una vez invierta para mezclar.
    5. Vuelta a 100 x g por 5 min a temperatura ambiente y luego utilizar una pipeta para remover el sobrenadante. Utilizar una pipeta para Resuspender el precipitado quedado en 2,5 mL caliente CE la célula completado de medios de cultivo.
  4. Cuarta digestión: Repita los pasos del 3.3.1 al 3.3.5. Aumentar el tiempo de incubación a 15 min de colon y permanecer a 10 min de yeyuno.
    Nota: Ahora debe consistir el sobrenadante de células individuales.

4. cultivo celular

  1. Utilizar una pipeta para combinar las suspensiones de células recogidas de digestiones 3 y 4 en un nuevo tubo de 15 mL (5 mL de volumen total).
  2. Sacar una alícuota de 10 μl de las células a contar con un hemocitómetro y centrifugar la suspensión de células restantes a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: La suspensión de la célula final consistirá en grupos pequeños y células.
  3. Quite el sobrenadante con una pipeta de transferencia y resuspender el precipitado en CE celular completo medios de cultivo a una densidad de 1.000.000 de células por mL.
    Nota: El volumen final de la suspensión celular dependerá de la cuenta final de la célula. Célula típica cuenta entre 2.000.000 y 4.000.000.
  4. Quitar platos de cultura cubierto-fondo de cristal de la incubadora. Utilice una pipeta P1000 para reemplazar la matriz extracelular de cada placa de cultivo con 250 μl de la suspensión definitiva de la célula.
    Nota: Capa de matriz extracelular tiende a pegarse a los bordes del plato de fondo de cristal. Debe tenerse cuidado especial para quitar la capa de borde para evitar la acumulación de gel.
  5. Hacer una solución de inhibidor Y-27632 de la roca en 1 mM. Añadir 2,5 μl de solución stock a cada plato de fondo de vidrio para lograr una concentración de trabajo del inhibidor de roca de 10 μm en cada plato.
    Nota: Este paso es crítico para la supervivencia de las culturas de yeyuno pero es opcional para el colon.
  6. Colocar cada placa de cultivo en un incubador de2 CO 37 ° C y 5% por 24 a 72 h (figura 1).

5. preparación de células CE para todo celular electrofisiología

  1. El diámetro interno de la platina del microscopio con dos tiras de 5 x 0.5 cm de la película de cera para crear una junta tórica de la línea. Monte la placa de cultivo celular de 35 mm dentro de la junta tórica (figura 2A-B).
  2. Enjuague ambos desechos flotantes, como matriz extracelular independiente o células muertas y medios de cultivo suero completamente fuera de las células de la CE para impedir o de obstaculizar el sello de formación entre la célula de la CE y el electrodo. Uso de las tres siguientes opciones para lograr la completa celular lavado suficiente para electrofisiología:
    1. Opción 1: Intercambio de solución es más eficiente en una cámara mucha más que una circular del compartimiento. Puesto que las células EC fueron cultivadas en platos redondos de 35 mm, crear un inserto plástico elíptico para el plato.
      1. Crear el inserto por la impresión en 3D o por métodos de molienda tradicional. El inserto que fue molido de plástico acrílico con las siguientes dimensiones (en mm): diámetro externo, 34,5; elipse interior, 20 x 9; altura exterior, 10; altura interior, 1.5; palmo de la puente, 3 x 3; separación de la puente, 1.5; entrada y salida, 4 x 4 cada uno.
      2. Bajar el inserto en la placa de cultivo (figura 2A-B) y asegúrelo a la parte superior de la platina del microscopio con dos piezas de 0.15 a 0.2 g de plastilina en 1.2 x 0.3 x 0,1 rectángulos cm (figura 2A-C).
      3. Con una pipeta de plástico, agregue lentamente solución extracelular a un lado del plato (entrada) y aspiración desde el otro lado (salida).
    2. Opción 2: Sin un inserto plástico dirigido, Agregar solución extracelular pipeta de transferencia de un lado del plato (entrada) y aspiración desde el lado opuesto (salida). Gire lentamente la situación de la pipeta de transferencia (por ejemplo, N e a S) mientras que refleja la colocación de la aguja de aspiración en el lado opuesto (por ejemplo, S w a N).
    3. Opción 3: Matriz extracelular de la capa sobre cubreobjetos rectangulares en paso 1.3.3. y la suspensión de células en estos cubreobjetos en paso 4.4 de la cultura. Transferir este cubreobjetos a una cámara rectangular llenada con la solución extracelular, omitiendo el paso 5.1 y saltar paso 5.3. Enjuague el compartimiento con la solución extracelular de una pipeta de plástico, como se describe en la opción 1 (5.2.1.3).
  3. Vuelva a colocar la etapa con el cultivo celular sobre el microscopio invertido (figura 2D). Incubar el cultivo celular de CE en la solución extracelular libre de suero a temperatura ambiente.
  4. Después de 4 horas, enjuague la cultura otra vez con la solución extracelular como se describió anteriormente. Proceder con electrofisiología de células enteras.

6. toda célula electrofisiología de CE células de cultivo primario

  1. Lograr un sello de Giga de células enteras
    1. Tire una docena de electrodos a una resistencia de 1 a 5 MΩ.
      Notas: Pipetas de resistencia MΩ de 1-2 10-100 GΩ sellos que funcionar mejor. No es necesario para lograr sellos GΩ fuego pulido las puntas de los electrodos.
    2. Aplique uniformemente el cono de nariz de pipetas todos con polímero. Sostenga la pipeta horizontal al suelo y perpendicular al frente de una pistola de calor. Gire lentamente la pipeta hasta que el polímero se endurece.
    3. Vierta una parte alícuota de la solución intracelular en un tubo cónico de 15 mL. Transferencia de 1,2 mL de esta solución en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por jeringa de 1 mL. Retirar otros 0,7 mL de solución intracelular en la jeringa. Disipar el aire desde el extremo de la jeringa. Fije un flexible 34 G, aguja de 67 mm a la jeringa y eliminar todo el aire restante de esta aguja.
    4. Identificar un Tph1-PPC + célula que no está en contacto con otras células o restos.
    5. Llene la punta del electrodo con la solución intracelular. Rellene la pipeta por la jeringuilla. Flick con cuidado la pipeta con una uña para disipar la interfaz de burbuja de aire.
    6. Con el émbolo con 0.3 mL de aire, acople una jeringa de 6 mL a la salida del titular de la tubería. Montar el electrodo en el soporte.
      Nota: Conecte la jeringa a la tubería antes de que el electrodo entra en la solución del baño para mantener la presión neutra o positiva en la solución intracelular antes del sellado.
    7. Un protocolo de pinza de voltaje de dos etapas que registra corrientes activadoras estacionaria por una escala de tensión en el primer paso y graba las corrientes disponibles de una sola tensión en el segundo paso de la carga. Abrir la prueba de sello (5 mV a 50 kHz).
    8. Bajar el electrodo en la solución del baño. Con los micromanipuladores, maniobrar el electrodo punta en plano horizontal directamente y con de la célula. Expulsar a los 0,3 mL de aire de la jeringa.
    9. Mueva suavemente el electrodo horizontal a lo largo del eje x a la celda. Tenga cuidado con un hoyuelo que aparecen en la celda de CE o un aumento en la resistencia de la membrana en la prueba de sello. Si es necesario, vuelva a ajustar el electrodo hacia abajo a lo largo del eje z u horizontalmente a lo largo del eje x, no se ha movido más allá de la línea media de la célula.
    10. Aplicar 0,1 – 0,2 succión de mL en la jeringa de 6 mL. Sujete firmemente el émbolo hasta MΩ 100, luego suelte el agarre del émbolo. Espere a que la celda al sello de giga. Desconecte suavemente la jeringa con un movimiento de desenroscado.
      Nota: Si una célula CE no sellar inicialmente, podría ser posible volver a sellar con un intento posterior. Para ello, tire suavemente el electrodo de una celda de CE con < 20 resistencia de sello MΩ. Manejo el electrodo gastado con los micromanipuladores, circunnavegar la célula específica CE matriz manualmente claro lejos o escombros. Entonces, intento para sellar la celda CE con un electrodo nuevo.
  2. Registro celular todo voltaje-bloqueado Na+ actuales.
    1. Conecte una jeringa de 3 mL con 0.5 – 1.0 aire mL. Aplique un toque rápido de aspiración (0.1 – 0.5 mL) en una jeringa de 3 mL. Repetir hasta logra el acceso de células enteras, luego desconecte suavemente la jeringa.
      Nota: el rendimiento de una jeringa puede variar inicialmente y cambian gradualmente con el tiempo y uso, práctica con la jeringa de 3 mL (sellado al final con un dedo índice) para asegurar que el émbolo retrocederá en 0,1 – 0,2 mL de su a partir de la posición. Si no, entonces cambio la jeringa para una nueva.
    2. Activar compensación de capacitancia de células enteras. Ajuste resistencia capacitancia y serie. Activar compensación de resistencia de la serie. Con retraso de 60 ms, ajuste prevista entonces corregida la compensación de resistencia serie. Cerca de la prueba de sello.
    3. Registrar un promedio de 5 funcionamientos de la corriente de Na+ voltaje de célula entera (figura 3A).
    4. Rápidamente tome nota de dos parámetros de la corriente de Na+ voltaje: el voltaje en la ventana actual (figura 3B, símbolos rojos, la intersección de las curvas de activación e inactivación de estado estable) y la corriente máxima de Na+ densidad.
      Nota: Células de CE con corrientes de pico Na+ más pA-50 en modo de pinza de voltaje comúnmente pasarán a fuego potenciales provocó en el modo actual de la abrazadera. Además, corrientes mayores de pA-200 en la abrazadera de tensión (figura 3A) entonces generalmente disparar potenciales de acción espontáneamente en pinza de potenciales de membrana (línea roja, figura 3D) cerca de la tensión de la ventana actual (símbolos rojo, figura 3B).
  3. Registro produce potenciales de acción.
    1. Desactivar la compensación de la resistencia de la serie. Desactivar el comando externo. Cambiar el modo de V-clamp-Abrazadera. Ajuste de la ganancia. Cargar un protocolo actual episódica de la abrazadera. Ajustar el nivel de explotación actual a 0 PA. Activar el comando externo.
      PRECAUCIÓN: No cambie de V-clamp-Abrazadera (o viceversa) sin apagar primero el comando externo.
    2. Tenga en cuenta el potencial de membrana de reposo. Ajustar la explotación actual de la entrada para que el potencial de membrana se lee debajo de la ventana actual (por ejemplo, -80 a -100 mV). Ajuste el protocolo actual episódica de la abrazadera de modo que el intervalo de paso de entrada de corriente es menor que el valor de la explotación actual (figura 3C detalle, + 2 pasos de pA para pA-3 tenencia actual).
    3. Registro produce potenciales de acción. Tenga en cuenta la menor cantidad de corriente inyectada para disparar un potencial de acción (figura 3C, 3 de 5, un paso pA + 4 de pA-3 manteniendo de barrido = pA + 1).
  4. Registrar los potenciales de acción espontáneos.
    1. Desactivar el comando externo. Cargar un protocolo de abrazadera actual boquete-libre (no episódico).
      Nota: No vuelva a encender el comando externo hasta que la cantidad de mantener corriente en el protocolo actual de boquete-libre de la abrazadera ha sido verificada para ser conveniente para la célula.
    2. Cambiar la explotación actual a ser la cantidad de corriente inyectada en el último barrido en el protocolo provocó que no dispara un potencial de acción (figura 3D, la entrada de la corriente durante el segundo, un paso + 2 pA de pA-3 manteniendo = pA-1).
    3. Activar el comando externo. Comprobaremos que la celebración prevista actual trae el potencial umbral para disparar un potencial de acción de membrana. Ajustar la explotación actual si es necesario. Registro actividad espontánea.

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Representative Results

Culturas:
Las células epiteliales murinas primarias de un modelo transgénico de Tph1-CFP fijar a los platos después de 4 horas y están listas para experimentos fisiológicos entre 24 a 72 h. Cuando las condiciones de cultivo no habían sido optimizadas, la cultura de célula epitelial consistió en grumos grandes, flotante y detritos celulares, membranas dañadas y señal débil del PPC en las células de la CE (figura 1A). Culturas que se han optimizado para electrofisiología consistió en las células y grupos pequeños. Las células sanas de la CE fueron identificadas fácilmente por fluorescencia brillante de la política pesquera común y todavía se han adherido al plato después del lavado vigoroso (figura 1B).

Electrofisiología:
Células enteras de CE fueron obtenidas en sólo 15 ±4% de intentos de culturas de colon sin inhibidor de la roca (células todo 29 de 182 intentos de 22 culturas) 30 ±7% de intentos de culturas de colon con inhibidor de la roca (células enteras 27 de 102 intentos de 50 culturas) (< C1 > figura 4A; p < 0.05 por dos colas no paramétrica t-test, culturas de colon sin y con inhibidor de la roca). Del mismo modo, yeyuno CE las células sin inhibidor de la roca no sobrevivió bastante tiempo para electrofisiología, mientras CE células enteras se obtuvieron 41 ± 3% de los intentos de la cultura de yeyuno con inhibidor de la roca (186 células enteras de 447 intentos de 50 culturas) (figura 4A; p > 0.05 por dos colas no paramétrica t-test, yeyuno y colon con inhibidor de la roca).

Por electrofisiología de células enteras, corrientes de Na+ se registraron en modo de pinza de voltaje y potenciales de acción (AP) en el modo de la abrazadera de la corriente. Se registraron las corrientes na+ de 81,3% ±4.0 de TPH1-PPC + células del yeyuno o el 64,1% de ±9.2 de colon3. De 59 CE las células del yeyuno culturas confirmadas por voltaje-pinza para corrientes de pico de Na+ más grandes que el pA-25, 19 células EC en modo de corriente abrazadera dispararon AP espontánea ("espontánea"), células CE 29 dispararon AP sólo cuando provocada por un protocolo de paso de corriente-abrazadera modo "(produce" sólo), 11 CE células y no fuego AP espontáneamente ni por el paso protocolo ("no disparar") (figura 4B). Espontáneas células tenían un pico media Na+ densidad de corriente (Ipico) de-108.0 ±19.3 pA/pF, sólo produce células tenían unpico de-60.2 ±9.2 pA/pF, mientras que las células no disparar tenía unpico de-43.3 ±14 pA/pF (figura 4 B; p < 0.05, espontánea vs sólo sacaron o no disparar grupos; p > 0,05 sólo sacaron vs no disparar grupos). La diferencia de densidades de corriente no eran un reflejo de la capacidad de células enteras, como la espontánea (3,3 ±0. 2 pF), sólo produce (2,9 ±0. 2 pF) y no disparar (3.1 ±0. 3 pF) células tenían similar toda célula capacitancias (P > 0.05). CE la célula Na+ corrientes y AP provocó fueron sensibles a [Na+]o concentración y NaV1.3 inhibición3.

Figure 1
Figura 1 : Gama representativa de los resultados de la cultura. DIC con epifluorescencia imágenes de una cultura de yeyuno epitelial primario de un ratón de Tph1-CFP plateado en un plato de fondo de cristal y cultivados durante 24 h. Estas dos imágenes muestran una gama de resultados de la cultura de este protocolo. CFP fluorescente (blanco) las células son células enterocromafines (CE). (A) imagen representativa de una cultura que es de mala calidad para electrofisiología. La cultura consiste en grumos grandes, membranas celulares dañadas, señal de fluorescencia baja y flotante grupos de células muertas. (B) imagen representativa de una cultura que ha sido optimizada para electrofisiología. Cultura consiste principalmente en células individuales, sanas y pequeños grupos que se han adherido a la placa. Células EC en esta cultura mantienen una señal fuerte fluorescencia. Barra de escala = 100 μm; los paneles son escala 1:1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparación de la célula las culturas para electrofisiología. Una estrategia eficiente y cuidadoso lavado de cultivos celulares de CE con solución libre de suero extracelular es crítica para la reducción de la matriz extracelular y el suero que impediría la formación de sello. (A) materiales. Hacia la derecha, de arriba a la izquierda: etapa, dos tiras de 5 mm ancho de la película de cera, dos piezas de 200 mg de modelado de arcilla, pipeta de transferencia plástica, fórceps #5, cámara de grabación elíptica, cultura de 35 mm plato con fondo de cristal. (B) adherirse la película de cera que el diámetro interno de la etapa, baje la cámara elíptica en la placa de cultivo y aplane la arcilla en tiras rectangulares. (C) suavemente presionar la placa de cultivo en la etapa de revestimiento de película de cera e inmovilizar la cámara grabación estirando la arcilla de modelado sobre el borde del plato, de la cámara a la escena. Enjuague las células CE con varios volúmenes de la solución extracelular. (D) retomar la etapa de los soportes de montaje sobre el microscopio invertido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Resultados de electrofisiología representante. (A) células enteras Na+ las corrientes, registradas por un protocolo de pinza de voltaje de dos etapas (recuadro). ms de 50 despolarizaciones desde -120 mV activar canales en el paso 1 (●), mientras que una despolarización más a 0 mV en el paso 2 (○) activa los canales que todavía no habían inactivado (es decir, todavía están disponibles para abrir). Rastro rojo, pasos de corriente provocada por la tensión de -120 a -40 a 0 mV. (B) relación de corriente-voltaje de las corrientes de Na+ pico del panel A, paso 1 (●, activación de estado estacionario) o paso 2 (○, inactivación de estado estable). La intersección de las curvas de activación e inactivación de estado estable revela una pequeña ventana actual a -40 mV (símbolos rojo). (C) los potenciales de acción sacados por los actuales estímulos de despolarizante. Un potencial de acción puede disparar más allá de 0 mV (línea gris) cuando el potencial de membrana alcanza el voltaje de la ventana del Na+ actual (línea roja, -40 mV). Recuadro, protocolo corriente-abrazadera, en el que se inyectó 0 a + 8 pA para ms de 50 despolarizaciones desde una línea de base de -3 PA. Potenciales de acción (D) el fuego de encima eventos espontáneos que han despolarizado a -40 mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Rendimiento de electrofisiología celular todo. (A) porcentaje medio de células enteras por intento de números días de trabajo en ausencia (-) o (+) presencia de inhibidor de la roca (10 μm). Células EC de yeyuno no sobrevivió 24 h en cultivo sin inhibidor de la roca. (B) Na+ densidades de corriente medidas en la abrazadera de tensión de las células EC n , en el que los potenciales de acción no fuego (no disparo), que se desencadena sólo cuando provocada por un protocolo de corriente abrazadera episódico (suscitada solamente), o encendió espontáneamente en modalidad boquete-libre corriente-pinza (espontánea) (barras de error son SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Comprender cabalmente la función de la célula CE requiere un método de cultivo primario de alta calidad para generar células para electrofisiología de células enteras. Cultivos primarios de epitelio GI tradicionalmente han sido difíciles debido a la baja supervivencia. Aliviar este factor de confusión, el presente método rendimientos de cultivos de células CE singular del intestino pequeño o grande que son capaces de sobrevivir durante varios días.

Encontramos que los siguientes eran críticos para mejorar la calidad de cultivos adecuados para electrofisiología: (1) invertir la mucosa en vez de pelar, (2) agregando una pequeña cantidad de BSA a los medios de digestión y SBF a los medios de cultivo, (3) reducir la Concentración de colagenasa XI, (4) ajuste de la duración y la intensidad de la agitación mecánica para aumentar el número y la salud de las células, (5) la matriz extracelular en una concentración baja y (6) cultivo con inhibidor de la roca de la galjanoplastia.

Del mismo modo, las siguientes adaptaciones fueron críticas para la obtención de células enteras mientras que afianza con abrazadera del remiendo: (1) completamente aclarado las culturas con la solución extracelular libre de suero, (2) dejar que la CE las células de soporte en la solución extracelular durante al menos 4 h, (3). reasignar cualquier pasado electrodos-como los de los sellos-para quitar escombros en la ruta a la siguiente celda EC, (4) agregando 10 μm Gd3 + a la solución extracelular para bloquear las corrientes de fuga (si existe) y para facilitar la adherencia de células de mamífero suspensiones para vidrio. Sin embargo, advertimos que Gd3 + podría bloquear canales voltaje-bloqueados Ca2 + o mechanosensitive expresados en las células EC.

A pesar de haber optimizado cuidadosamente las condiciones de cultivo, encontramos algunas limitaciones: CE células necesitan 24 h totalmente fije pero caducan después de ~ 72 h en la cultura; por lo tanto, también tienen una ventana de 48 horas sería convenientes para los experimentos electrofisiológicos. Porque las células agrupadas a menudo introducen transitorios de capacitancia que no pueden ser compensadas de grabaciones, la generación de células CE son críticos. Sin embargo, separando las células CE del epitelio, las células viven en un ambiente de no nativos (es decir, medios de glucosa alta con suero bovino fetal e inhibidor de la roca en la cima de la matriz extracelular como una membrana artificial del sótano) y podrían responder a los estímulos no totalmente representativos de células CE funciona en vivo. A pesar de estas limitaciones, aún el cultivo primario de células EC proporciona penetración en su fisiología.

Las células de la CE juegan un papel crítico en mantener un buen funcionamiento tracto GI y el cuerpo y como tal, ha habido muchos métodos para ganar una comprensión sobre electrofisiología celular de CE. Electrofisiología de células enteroendocrinas y EC fue investigada en células inmortalizadas modelos5,8,13, cultivos primarios de células CE de conejillo de Indias11y ratón3,4, nuestro método utiliza métodos de preservación de calidad de células para crear una cultura que ha sido mínimamente procesada y refleja las células nativas de CE. Utilizamos un modelo de ratón transgénico, Tph1-CFP, que muestra una fluorescencia cian en el citoplasma cuando Tph1 es actualmente9. Este método puede también usarse para otros reportero o tipos de células enteroendocrinas linaje remontado. Nuestro método también logra el aislamiento de células EC en un tiempo mínimo y el tratamiento enzimático, como las células están expuestas sólo a una apacible XI de colagenasa en una mínima pero eficaz concentración de 0,1 mg/mL (yeyuno) y 0,6 mg/mL (dos puntos) para menos de una hora. El resultado de estas modificaciones es una cultura que ha sido optimizada para los estudios electrofisiológicos de las células de la CE.

Hemos utilizado con éxito este método para estudiar la electrofisiología y la serotonina liberación murino de células CE3. Identificar la capacidad de aislar con éxito, y las células EC cultura facilita direcciones futuras importantes en estudios sobre la fisiología de la célula de CE. Este método puede utilizarse para determinar otros caminos críticos y canales implicados en la exocitosis de células CE de la serotonina y otros CE transmisores específicos de la célula. El método también podría ser modificado para aislar y caracterizar la fisiología de la célula humana de la CE junto con el uso de naranja de acridina para CE célula identificación13.

Como con desarrollo más científico del Protocolo, comunicación y observaciones imparciales eran críticos en la solución de problemas del presente Protocolo. Cuando probamos nuevos métodos de cultivo para la supervivencia de nuestras culturas, fue útil para contar el número de células fluorescentes como una medida de la viabilidad, el estimado de densidad celular en cada plato y recoge representativas fotos y videos de las culturas a través del tiempo muchos puntos. Después de que las células eran capaces de sobrevivir más allá de 24 h en la cultura, se trabajó en modificar nuestras culturas para los experimentos de electrofisiología. Junto con la recolección de imágenes y observaciones detalladas, es importante mantener una comunicación clara entre el personal de laboratorio con respecto a los ajustes para la digestión mecánica y suplemento o concentraciones de sustrato, para que las células sanas de la CE estaban listas para la caracterización electrofisiológica.

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Disclosures

Ninguno

Acknowledgments

Los autores agradecen la Sra. Lyndsay Busby para asistencia administrativa y el Sr. Robert Highet de Mayo clínica División de ingeniería para el diseño y la impresión 3D de la inserción de plato de cultura. Este trabajo fue financiado por NIH K08 AB (DK106456), piloto y viabilidad beca AB de centro de Mayo Clinic para la señalización celular en gastroenterología (NIH P30DK084567) y 2015 American Gastroenterología Asociación investigación Scholar Award (RSA de AGA) AB y NIH R01 a GF (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

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References

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  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
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  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
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Biología número 139 gastrointestinales epitelio células enterocromafines cultivo primario electrofisiología celular todo abrazadera del voltaje pinza de corriente
Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario
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Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

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