Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hele cellen elektrofysiologi primære kulturperler Murine Enterochromaffin celler

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Enterochromaffin (EC) celler utgjør en undergruppe av gastrointestinale epitelceller. EC celler er elektrisk nervøs og slipp serotonin, men vanskeligheter i dyrking og identifisere EC celler har begrenset fysiologiske studier. Metoden som presenteres her oppretter en primær kultur modell mottakelig for undersøkelse av EC enkeltceller av elektrofysiologi.

Abstract

Enterochromaffin (EC) celler i gastrointestinal (GI) epitel utgjør den største subpopulasjon av enteroendocrine celler. Som spesialiserte sensoriske celler, EC celler forstand luminal stimuli og konvertere dem til serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) løslate hendelser. Imidlertid er elektrofysiologi av disse cellene dårlig forstått fordi de er vanskelige å kultur og identifisere. Metoden presentert i dette papiret beskriver primære EC cellekulturer optimalisert for enkeltcelle elektrofysiologi. Denne protokollen bruker transgene cyan fluorescerende protein (CFP) reporter identifisere musen EC celler i blandet primære kulturer, fremme tilnærming til å få høykvalitets opptak av hele cellen elektrofysiologi i spenning og strøm klemme moduser.

Introduction

Gastrointestinal (GI) epitel er et mangfoldig samfunn bestående av flere celletyper. Enteroendocrine celler utgjør omtrent 1% av alle epitelceller enterochromaffin (EC) celler er den største enteroendocrine celle befolkning1. Nyere studier viser at enteroendocrine2 og EF3,4 celler er elektrisk nervøs. Vi er interessert i å forstå primære EC celle elektrofysiologi. Dermed var formålet med denne studien å etablere primære EC cellekulturer optimalisert for hele cellen elektrofysiologi.

Eksisterende EC cellen linjer som produserer og skiller ut 5-HT (f.eks QGP-1-5, BON6, KRJ-1-7) og har blitt brukt til å undersøke elektrofysiologi5,8 genereres vanligvis fra udødeliggjort neoplastic vev. Mens informasjonen fra disse linjer er verdifulle5,8, er studier av primære celle elektrofysiologi nødvendig å riktig forstå EC celle fysiologi. Elektrofysiologi primære EC celler krever isolasjon og kultur av enkelt epitelceller, som har vært begrenset av lave levedyktigheten til epithelial kulturer.

Metoden kultur presentert i denne studien er avhengig av transgene mus med fluorescently merket EC celler, som Tph1-CFP9, brukt i denne studien. Metoden optimaliserer blandet primære epithelial kulturer utviklet tidligere2,10 for enkelt celle elektrofysiologi3. Tidligere metoder brukt kombinasjoner av Trypsin/EDTA pluss Collagenase A eller EDTA og DTT enzymatisk fordøyelsen og brukt tetthet forløpninger spesielt isolere og kultur marsvin11 og rotten EC celler12. Flere nylig, intestinal organoids ble generert og mekanisk forstyrret for elektrofysiologiske opptak4. Kulturer ved hjelp av disse metodene er godt egnet for serotonin løslate eksperimenter, RT-qPCR analyse og, mens de kan brukes for elektrofysiologi, er avhengig av suksessen til tidkrevende organoid generasjon, tetthet forløpninger å identifisere EC celler, og mobilnettet nedbrytende effekten av Trypsin og EDTA. Derimot protokollen beskrevet her forbedrer enzymatisk og mekanisk, optimaliserer dyrking forhold, og strømlinjeformer prosedyrer for å produsere én og sunn EC celler egnet høye mobilnettet standarder nødvendig for elektrofysiologi.

Denne metoden vil være nyttig for forskere som ønsker å jobbe på primære EC celler i blandet kulturer i stedet for udødeliggjort kulturer og vil undersøke elektrofysiologi i enkeltceller. Imidlertid kan det være færre passende for å studere celle populasjoner som trenger sortering eller langsiktig kulturer som krever overlevelse siste 72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Mayo Clinic. Den primære celle kultur delen av denne protokollen er basert på tidligere publiserte metoder som kan refereres for ytterligere detaljer10. Alle eksperimentelle prosedyrer må godkjennes av (IACUC), og alle eksperimentene må utføres i samsvar med relevante retningslinjer og regler.

1. kultur forberedelse

  1. Media.
    1. Forberede EC celle fullstendig kultur medier med høy glukose [4500mg/L] Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) som er supplert med 5% fosterets Bovine Serum (FBS), 1% L-glutamin og 1% Penicillin-Streptomycin (tabell 1).
      Merk: Media kan lagres på 4 ° C i opptil en måned.
    2. Filtrere EC celle fullstendig kultur media og plassere 25 mL av media i en 50 mL tube på 37 ° C.
    3. Forberede fordøyelsen media med høy glukose [4500 mg/L] DMEM med 0,1% Bovine Serum Albumin (BSA) (tabell 1).
    4. Filtrere fordøyelsen media og plassere fire 10 mL dele medier i separate 50 mL rør og ruge i et 37 ° C vannbad.
      Merk: Media kan lagres på 4 ° C i opptil en måned.
  2. Enzym.
    1. Veie 4 mg (for jejunum) eller 24 mg (for kolon) Collagenase XI [≥800 enheter/mg] i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Merk: Collagenase er stabilt på 20 ° C i opptil ett år.
    2. Resuspend collagenase aliquot i 1 mL av is kaldt PBS med Ca2 + og Mg2 +. Vortex løsningen til grundig kombinere, og plasser på is.
  3. Belegg kultur plater.
    1. Tine 150 µL av ekstracellulær matrix overnatting på 4 grader på is.
    2. Lage en 5% w/v ekstracellulær matrix løsning ved å blande 100 µL av tinte ekstracellulær matrix med 2 mL iskald serum-free high-glukose-DMEM.
      Merk: Ekstracellulær matrix stivner ved romtemperatur og bør håndteres med pre kjølt Pipetter, rør og media helt klar til å belegge retter.
    3. Umiddelbart coat glass indre sirkel av glass-bottom 35 mm retter med 250 µL av 5% ekstracellulær matrix løsningen. Denne oppskriften vil dekke opptil 8 retter.
    4. Plass glass bunn retter i en 37 ° C inkubator under celle kultur isolasjon trinnene. Den ekstracellulære matrisen tar minst 1 time å sette men kan være ruget for opptil 2,5 t mens du utfører andre isolasjon trinn.
      Merk: Incubations lenger enn 3 h kan opprette en opphopning av ekstracellulær matrix som kan hindre forsegle formasjon under hele cellen elektrofysiologi.

2. vev isolasjon

  1. Ifølge etiske retningslinjer, ofre en 3to 6 uke gamle mann eller kvinne Tph1-CFP transgene mus (The Jackson laboratorium lager: 028366)9 eller en annen reporter belastning.
    Merk: Vi bruker en dødelig dose av stigende nivåer av karbondioksid og en cervikal forvridning som en sekundær betyr å sikre død. AVAM komiteen for Euthanasia vurderer også cervical forvridning en tillatte primære euthanasia metode av enkeltpersoner opplært i bruk hvis dyrene er først bedøvet.
  2. Feste euthanized musen ut på en polystyrenskum disseksjon scene over 21 G pinner. Dekontaminere musen magen med 70% etanol.
  3. Dra musen huden stram ved hjelp av mikro-disseksjon pinsett (#5), og deretter bruke skarp kirurgisk saks for å gjøre en tverrgående snitt nederst på musen magen å avsløre intraperitoneal hulrom. Gjøre en annen snitt vertikalt opp magen til ribbe buret er utsatt.
  4. Bruk mikro-disseksjon tang for å flytte cecum til venstre for musen for å oppnå et klart syn av kolon.
  5. Bruk mikro-disseksjon saks til å kutte den mest distale del av kolon (men fortsatt proksimale til endetarmen) og gjøre andre kuttet distale til magen. Sted utdraget tarmen inn 100 x 15 mm2 Petriskål fylt med 20 mL iskald fosfat bufret saltvann (PBS).
  6. Bruk en liten linjal til å måle og kutte ut 10 cm av midten av kolon eller jejunum. Ekstra kolon av måle ut 10 cm segmentet av tarmen ligger proximally det første kuttet tatt over endetarmen. Identifisere jejunum ved folding hele tynntarmen i to og gjør en første snitt på halvveis og andre snitt 10 cm proksimale første kuttet.
    Merk: Fortsett å utføre alle etterfølgende isolasjon trinn på is.
  7. Fylle en 6 mL sprøyte med isen kalde PBS og plasser sprøytenålen i lumen på utdraget intestinal segmentet. Bruk mikro-disseksjon tang å klemme og forsegle tarmen rundt sprøytenålen, og forsiktig flush 10 mL PBS gjennom lumen skylle bort avføring.
  8. Invertere det tarmen tissue av forsiktig veving mikro-disseksjon Tang gjennom lumen, knipe en tarmveggen og trekke vevet proksimale til spissen av tang. Gjenta denne prosessen til segmentet er inne-ute med lumen vender utover.
  9. Bruk mikro-disseksjon saks til å klippe vev segmentet i 1 cm biter.
  10. Bruke micro-disseksjon tang for å overføre vev segmentene i et 50 mL beaker fylt med 5 mL steril PBS. Bruke micro-disseksjon saksen for å hakke vev bitene til en flytende konsistens.
  11. Plass hakket vev og 15 mL av is kaldt PBS i en ren 50 mL tube av overføring pipette. Triturate 2 ganger med overføring pipette, vente på vevet å avgjøre, fjerne 15 mL PBS nedbryting av, og erstatte med fersk PBS. Gjenta denne prosessen tre ganger til PBS er klart.
  12. Plasser den 50 mL tuben med vasket vev stykker på is og bringe is bøtte i vev kultur hette.

3. enzymatisk og mekanisk fordøyelse

  1. Første fordøyelse
    1. Hente en av 50 mL rør som inneholder 10 mL forvarmes fordøyelsen medier fra vannbad. Legge til 250 µL av PBS collagenase løsning og hakket tarmen tissue stykker 50 mL røret.
      Merk: Pass på å unngå å inkludere noen PBS fra vask trinnene.
    2. Plass den 50 mL tuben i et vannbad i 5 minutter (kolon eller jejunum) på 37 ° C. Riste røret 2 x per min.
      Merk: Det optimale tidspunktet og intensitet av mekaniske fordøyelsen kan variere og må bestemmes av brukeren. For å bestemme optimal fordøyelse betingelsene, kan en 10 µL aliquot celler vises etter hver fordøyelsen. I fordøyelsen 1, bør nedbryting bestå av klumper av celler.
    3. Sakte triturate vevet én gang med en 10 mL serologisk pipette. Kort la vevet stykker bosette, deretter bruke en overføring pipette fjerne hele 10 mL av nedbryting.
  2. Andre fordøyelsen: Gjenta 3.1.1 til 3.1.3. Øke inkubasjon til 10 min hvis fordøye kolon og holde inkubasjon tiden 5 minutter for jejunum.
    Merk: Ved observasjon, nedbryting bør fortsatt består av store klumper av celler.
  3. Tredje fordøyelse
    1. Gjenta trinn 3.1.1
    2. Plass den 50-mL tuben i et vannbad 37 grader i 10 min (kolon eller liten jejunum). Riste røret 2-3 x per min med høyere intensitet enn Digestions 1 og 2.
    3. Sakte Pipetter vevet opp og ned med en 10-mL serologisk pipette. Kan vev stykker til å bosette for en kort tid.
      Merk: Nedbryting bør bestå av en kombinasjon av enkeltceller og små klumper.
    4. Bruk en overføring pipette plassere 10 mL nedbryting av i en ny 15 mL tube, legge til 2 mL varmet EC celle fullstendig kultur medier og invertere en gang for å blande.
    5. Spinn på 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur, deretter bruke en overføring pipette fjerne nedbryting. Bruk en overføring pipette for å resuspend den gjenværende pellet i 2,5 mL av varmet EC celle fullstendig kultur medier.
  4. Fjerde fordøyelsen: Gjenta 3.3.1 til 3.3.5. Øke inkubasjon til 15 min for kolon og forblir på 10 min for jejunum.
    Merk: Nedbryting bør nå bestå av enkeltceller.

4. celle kultur

  1. Bruke en overføring pipette for å kombinere celle suspensjoner samlet fra Digestions 3 og 4 til en ny 15 mL tube (5 mL totalt volum).
  2. Fjerne en 10 µL aliquot celler å telle med en hemocytometer og spinne gjenværende celle suspensjon 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    Merk: Den siste celle suspensjonen vil bestå av små klumper og enkeltceller.
  3. Fjern nedbryting med en overføring pipette og resuspend pellet i EC celle fullstendig kultur medier på en tetthet av 1.000.000 celler per mL.
    Merk: Det siste bindet av cellen suspensjon vil avhenge av den endelige celletall. Typisk celle teller varierer fra 2,000,000 til 4.000.000.
  4. Fjern belagt glass bunn kultur retter fra inkubator. Bruk en P1000 pipette erstatte ekstracellulær matrix fra hver kultur parabol med 250 µL av siste celle suspensjon.
    Merk: Ekstracellulær matrix belegg tendens til å holde seg til kantene av glass-bottom rett. Særskilt omsorg må tas å fjerne belegget fra langs kanten å hindre gel buildup.
  5. Gjøre en lagerløsning av ROCK hemmer Y-27632 på 1 mM. Legge til 2,5 µL av lagerløsning hver glass bunnen rett å oppnå en arbeider konsentrasjon av 10 µM ROCK hemmer i hver rett.
    Merk: Dette trinnet er avgjørende for overlevelsen av jejunum kulturer, men er valgfritt for kolon.
  6. Plass hver kultur parabol i en 37 ° C og 5% CO2 inkubator 24 til 72 h (figur 1).

5. utarbeidelse av EC celler for hele cellen elektrofysiologi

  1. Linje den indre diameteren på mikroskopet scenen med to 5 x 0,5 cm strimler av voksen film å opprette en O-ring. Mount 35 mm celle kultur parabol i O-ring (figur 2A-B).
  2. Skyll både flytende rusk, som ledige ekstracellulær matrix eller døde celler og kultur medier serum helt fra EF celler hindre fra hindrer forsegle formasjon mellom EC cellen og elektroden. Bruk av tre følgende alternativer for å oppnå grundig celle vaske tilstrekkelig for elektrofysiologi:
    1. Alternativ 1: Løsning exchange er mer effektiv i en lang chamber mere enn en sirkulær kammer. Siden EC cellene ble kultivert på rundt 35 mm retter, opprette en plast elliptiske sett for retten.
      1. Opprett sett inn 3D-utskrift eller tradisjonelle fresing metoder. Sett inn vi brukte var frest i akryl plast med følgende dimensjoner (i mm): ytre diameter, 34,5; indre ellipse, 20 x 9; ytre høyde, 10; indre høyde, 1,5; bro span, 3 x 3; bro fortolling, 1,5; innløp og utløp, 4 x 4 hver.
      2. Lavere innsatsen til kultur parabolen (figur 2A-B) og fest den til toppen av mikroskopet scenen med to 0,15 til 0.2 g biter modell-leire presset inn 1.2 x 0.3 x 0,1 cm rektangler (figur 2Vekselstrøm).
      3. Med en plast overføring pipette, sakte legge ekstracellulære løsning til en side av retten (innløp) mens aspirating fra den andre siden (uttak).
    2. Alternativ 2: Uten utviklet plast insert, legge til ekstracellulære løsning ved overføring pipette fra en side av retten (innløp) mens aspirating fra motsatt side (uttak). Sakte rotere plasseringen av overføring Pipetter (f.eks N e s) mens speiling plasseringen av aspirasjon nålen på motsatt side (f.eks S til W til N).
    3. Alternativ 3: Pels ekstracellulær matrix på rektangulære coverslips i trinn 1.3.3., og kultur celle suspensjon på disse coverslips i trinn 4.4. Overføre denne dekkglassvæske til et rektangulært kammer fylt med ekstracellulære løsning, utelater trinn 5.1 og hoppe over trinn 5.3. Skyll til kammeret ekstracellulære løsning fra en plast overføring pipette, som beskrevet i alternativ 1 (5.2.1.3).
  3. Re-fest scenen med cellekultur over invertert mikroskopet (figur 2D). Inkuber EC cellekultur i serum-free ekstracellulære løsning ved romtemperatur.
  4. Etter 4 timer, skyll kulturen igjen med ekstracellulære løsning som beskrevet ovenfor. Fortsett med hele cellen elektrofysiologi.

6. hele cellen elektrofysiologi EC celler fra primære kultur

  1. Oppnå en hele cellen Giga-sel
    1. Trekk et dusin elektroder en motstand av 1-5 MΩ.
      Merknader: Pipetter 1-2 MΩ motstand som gir 10-100 GΩ sel utføre best. Brann polering elektrode tips er ikke nødvendig for å oppnå GΩ segl.
    2. Coat jevnt nesen kjegle av alle Pipetter med polymer. Hold pipette horisontale til bakken og vinkelrett på forsiden av en varmepistol. Sakte Roter Pipetter til polymer beskytter.
    3. Hell en aliquot intracellulær løsning i et 15-mL konisk rør. Overføre 1,2 mL av denne løsningen i en 1,5 mL microcentrifuge tube via 1-mL sprøyte. Trekke en annen 0,7 mL intracellulær løsning i sprøyten. Fjerne luft fra slutten av sprøyten. Knytt en fleksibel 34 G, 67 p til sprøyten, og skylle ut alle gjenværende luft fra denne p.
    4. Identifisere en Tph1-CFP + celle som ikke er i kontakt med en annen celle eller rusk.
    5. Fyll elektrode spissen med intracellulære løsning. Etterfylle pipette av sprøyte. Forsiktig sveip pipette med en fingernegl å fjerne luft boble grensesnittet.
    6. Knytte en 6 mL sprøyte til utløpet av abonnenten rør av ventilen utarbeidet med 0,3 mL av luft. Montere elektroden inn i holderen.
      Merk: Koble sprøyten til slangen før elektroden inn bad løsningen for å opprettholde nøytrale eller positive trykk i intracellulær løsningen før tetting.
    7. Laste inn en to-trinns spenning-klemme protokoll som registrerer stabil aktivering strøm ved en spenningen stige på første skritt og registrerer tilgjengelig strøm av en enkelt spenning på andre trinn. Åpne segl testen (5 mV på 50 kHz).
    8. Lavere elektroden i Bad løsningen. Med micromanipulators, manøvrere elektrode tips i-flyet med og direkte vannrett fra cellen. Utvise den 0,3 mL av luft fra sprøyten.
    9. Forsiktig flytte elektroden horisontalt langs x-aksen til å berøre cellen. Se etter et smilehull vises på EC cellen og/eller en økning i membranen motstand på sel test. Eventuelt justere elektroden ned langs z-aksen og/eller horisontalt langs x-aksen, ikke flytte forbi midtlinjen av cellen.
    10. Bruke 0.1-0,2 mL suge på 6-mL sprøyte. Holde stempelet jevn til 100 MΩ er oppnådd, så slipper grep fra stempelet. Vent til cellen til giga-forsegling. Forsiktig koble sprøyten med en skruen ved å skru bevegelse.
      Merk: Hvis en EU-celle ikke lenger først, kan det være mulig å re forsegle den med et senere forsøk. Dette gjør trekk forsiktig elektroden fra en EU-celle med < 20 MΩ segl motstand. Styring brukt elektroden med micromanipulators, circumnavigate målrettet EC cellen manuelt fjerne matrise eller rusk. Deretter forsøk å forsegle EC cellen med en frisk elektrode.
  2. Posten hele cellen spenning gated Na+ gjeldende.
    1. Knytte en 3 mL sprøyte utarbeidet med 0,5 til 1,0 mL luft. Bruke en rask trykk av sug (0,1-0,5 mL) på en 3 mL sprøyte. Gjenta til hele mobil tilgang oppnås, så forsiktig koble sprøyten.
      Merk: ytelsen til en sprøyte kan variere først og endre gradvis med tid og bruk, øve på forhånd med 3 mL sprøyte (tetting slutten med pekefingeren) for å sikre at stempelet vil rekyl i 0,1-0,2 mL Start posisjon. Hvis ikke, deretter bytte sprøyten for en ny.
    2. Slå på hele cellen kapasitans kompensasjon. Justere kapasitans og serien. Slå på serien motstand kompensasjon. Lag satt til 60 ms, justere spådde da korrigert serien motstand kompensasjon. Lukk segl testen.
    3. Registrere et gjennomsnitt på 5 kjører hele celler spenning-gated Na+ gjeldende (Figur 3A).
    4. Raskt ta note av to parametere av spenning-gated Na+ gjeldende: spenningsnivået vinduet gjeldende (Figur 3B, røde symboler, krysset av stabil aktivisering og inaktivering kurver) og topp Na+ gjeldende tetthet.
      Merk: EC celler med topp Na+ strømmer mer enn-50 pA i spenning klemme modus vanligvis vil gå på brann fremkalte potensialene i gjeldende klemme modus. I tillegg strøm større enn-200 pA i spenning klemme (Figur 3A) så vanligvis brann handling potensialene spontant i gjeldende clamp fra membran potensial (rød linje, Figur 3D) nær spenningen på den vinduet gjeldende (røde symboler, Figur 3B).
  3. Post vakte handling potensialer.
    1. Slå av serien motstand kompensasjon. Deaktivere den eksterne kommandoen. Bytte modus fra V-klemme til-klemme. Justere forsterkningen. Laste inn en episodisk gjeldende klemme protokoll. Justere holder gjeldende 0 pA. Slå på den eksterne kommandoen.
      FORSIKTIG: Ikke gå fra V-klemme til-klemme (eller omvendt) uten første slår av den eksterne kommandoen.
    2. Merk hvile membran potensialet. Justere beholdning gjeldende inndata membran potensialet leser under vinduet gjeldende (f.eks -80 å-100 mV). Juster episodisk gjeldende klemme protokollen slik at trinn tidsintervallet gjeldende inndata er mindre enn verdien av holder gjeldende (Figur 3C senket, 2 pA trinnene for-3 pA holder gjeldende).
    3. Post vakte handling potensialer. Merk minst gjeldende injiseres for å fyre av en handling potensial (Figur 3C, feie 3 av 5, et 4 pA skritt fra-3 pA holder = 1 pA).
  4. Registrere spontan handling potensialer.
    1. Deaktivere den eksterne kommandoen. Laste inn en gap-fri (ikke-episodisk) gjeldende klemme protokoll.
      Merk: Ikke slå den eksterne kommandoen igjen til mengden holder gjeldende i gapet uten gjeldende klemme protokollen er bekreftet for å være egnet for cellen.
    2. Endre holder gjeldende skal mengden av gjeldende injisert i siste sving i fremkalte protokollen som ikke skyte en handling potensial (Figur 3D, gjeldende inndata under den andre feie, et 2 pA skritt fra-3 pA holder =-1 pA).
    3. Slå på den eksterne kommandoen. Dobbeltsjekk at spådde holder gjeldende bringer membran potensial under terskelen til brann en handling potensial. Justere beholdning nåværende om nødvendig. Spontan aktiviteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kulturer:
Primære murine epitelceller laget av transgene Tph1-CFP modell fest retter etter 4 timer og er klar for fysiologiske eksperimenter mellom 24 til 72 h. Når oppdrettsforholdene ikke hadde er optimalisert, besto tarmepitelet kulturen av store klumper, flytende mobilnettet rusk, skadet membraner og svakt CFP signal i EC cellene (figur 1A). Kulturer som er optimalisert for elektrofysiologi besto av enkeltceller og små klumper. Friske EC celler var lett identifiseres av lyse CFP fluorescens og hadde fortsatt overholdt rett etter energisk vask (figur 1B).

Elektrofysiologi:
EC hele celler ble oppnådd på bare 15 ±4% av forsøk fra kolon kulturer uten ROCK hemmer (29 hele celler av 182 forsøk fra 22 kulturer) men 30 ±7% av forsøk fra kolon kulturer med ROCK hemmer (27 hele celler av 102 forsøk fra 50 kulturer) (< C1 > figur 4A; p < 0,05 av en ikke-parametriske tosidige t-test, kolon kulturer uten vs med ROCK hemmer). Tilsvarende jejunum EC celler uten ROCK hemmer ikke overleve lenge nok til elektrofysiologi, mens EC hele celler anskaffet på 41 ±3% av forsøk fra jejunum kultur med ROCK hemmer (186 hele celler av 447 forsøk fra 50 kulturer) (figur 4A; p > 0,05 av en ikke-parametriske tosidige t-test, jejunum vs kolon med ROCK hemmer).

Av hele cellen elektrofysiologi, ble Na+ strømmer innspilt i spenning-klemme modus og handling potensialer (AP) i gjeldende-klemme modus. Na+ strømmer ble satt i 81.3 ±4.0% av TPH1-CFP + celler fra jejunum eller 64.1 ±9.2% kolon3. 59 EC celler fra jejunum kulturer bekreftet av spenning-klemme har Na+ peak strøm større enn-25 pA, 19 EC cellene i gjeldende-klemme modus sparken spontan AP ("spontan"), 29 EC celler sparken AP bare når brakt frem av et trinn-protokollen i gjeldende-klemme modus ("skapte bare") og 11 EC celler ikke brann AP spontant eller av trinn protokoll ("ikke-skyting") (Figur 4B). Spontan cellene hadde en gjennomsnittlig peak Na+ nåværende tetthet (IPEAK) av-108.0 ±19.3 pA/pF, bare skapte cellene hadde en Itoppen av-60.2 ±9.2 pA/pF, mens ikke-skyting cellene hadde en Itoppen av-43.3 ±14 pA/pF (Figur 4 B; p < 0,05, spontane vs bare skapte eller ikke-skyting grupper. p > 0,05 bare skapte vs ikke-skyting grupper). Forskjellen i gjeldende tettheter ikke var en refleksjon av hele cellen kapasitans, som spontan (3.3 ±0.2 pF), bare skapte (2.9 ±0.2 pF) og ikke-skyting (3.1 ±0.3 pF) celler hadde lignende hele celle capacitances (P > 0,05). EC celle Na+ strømmer og fremkalte AP var følsom [Na+]o konsentrasjon og NaV1.3 hemming3.

Figure 1
Figur 1 : Representativt utvalg av kultur resultater. DIC med epifluorescence bilder av en primære epithelial jejunum kultur fra Tph1-CFP mus belagt på et glass bunnen rett og kultivert for 24 timer. Disse to bildene viser en rekke kultur resultater fra denne protokollen. CFP fluorescerende celler (hvit) er enterochromaffin (EC) celler. (A) representativt bilde fra en kultur som er dårlig kvalitet for elektrofysiologi. Kultur består av store klumper, skadede, lav fluorescens signal og flytende grupper av døde celler. (B) representativt bilde fra en kultur som er optimalisert for elektrofysiologi. Kultur består hovedsakelig av enkelt, friske celler og små klumper som har levd opp til platen. EC celler i denne kulturen opprettholde en sterk fluorescens signal. Skala bar = 100 µm; paneler er skalert 1:1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Utarbeidelse av cellen kulturer elektrofysiologi. En strategi for effektiv og grundig skylling av EC cellekulturer serum-free ekstracellulære løsning er avgjørende for å redusere ekstracellulær matrix og serum som ville hindre segl formasjon. (A) materiale. Med klokken, fra øverst til venstre: scenen, to 5 mm bredt strimler av voksen film, to 200 mg stykker av modellering leire, plast overføring pipette, #5 tang, elliptiske opptak kammer, 35 mm kultur parabol med glass bunn. (B) overholde voksen film til den indre diameteren på scenen, lavere elliptiske kammeret i kultur parabol og flat leire i rektangulære strimler. (C) forsiktig trykk kultur parabol i voksen film-lined scenen og nakkens opptak kammeret ved å strekke modellering leire over kanten av parabolen, fra kammer til scenen. Skyll EC celler med flere mengder ekstracellulære løsning. (D) tilbake scenen til monteringsbrakettene over invertert mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant elektrofysiologi resultater. (A) hele cellen Na+ strøm, registrert av en to-trinns spenning-klemme protokoll (innfelt). 50 ms depolarizations fra-120 mV aktivere kanaler under trinn 1 (●), mens en ytterligere depolarization til 0 mV under trinn 2 (○) aktiverer kanaler som ikke hadde ennå inaktivert (dvs. er fortsatt tilgjengelig for åpning). Rød spor, gjeldende brakt frem av spenning trinn fra-120 til 40-0 mV. (B) nåværende-spenning forholdet mellom topp Na+ strøm fra panelet A, trinn 1 (●, stabil aktivisering) eller trinn 2 (○, stabil inaktivering). Skjæringspunktet mellom stabil aktivisering og inaktivering kurvene avslører et lite vindu gjeldende på-40 mV (røde symboler). (C) action potensialer brakt frem av depolarizing gjeldende stimuli. En handling potensial kan skyte forbi 0 mV (grå linjen) når membranen potensielle når spenningen Na+ vinduet gjeldende (rød linje,-40 mV). Senket, gjeldende-klemme protokollen, der 0 til 8 pA ble injisert for 50-ms depolarizations fra en grunnlinjen av -3 pA. (D) action potensialer brann fra toppen av spontane hendelser som har depolarized til-40 mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Produksjon av hele cellen elektrofysiologi. (A) mener prosent av hele celler per forsøk n dager arbeid i fravær (-) eller tilstedeværelse (+) av ROCK hemmer (10 µM). EC celler fra jejunum overlevde ikke 24 h i kultur uten ROCK inhibitor. (B) Na+ gjeldende tettheter målt i spenning-klemme fra n EC celler, der handlingen potensialer ikke brann (Non-skyting), starter bare når brakt frem av en episodisk gjeldende-klemme protokoll (Elicited bare), eller sparken spontant i gapet uten strøm-klemme modus (spontan) (feilfelt er SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fullt forstå EC celle-funksjonen krever en høy kvalitet primære kultur metode for å generere celler for hele cellen elektrofysiologi. Primære kulturer av GI epitel hadde tradisjonelt vært vanskelig på grunn av lav overlevelse. Lindre dette forvirrende faktor, gir metoden finnes kulturer entall EC celler fra store eller små tarm som kan overleve i flere dager.

Vi fant at følgende var kritiske for å forbedre kvaliteten på kulturer å være egnet for elektrofysiologi: (1) invertere mucosa stedet peeling det, (2) legge en liten mengde BSA til fordøyelsen media og FBS til kultur media, (3) senke den Collagenase XI konsentrasjon, (4) justere varighet og intensitet av mekaniske agitasjon å øke og helse for enkeltceller, (5) plating den ekstracellulære matrisen på en lav konsentrasjon, og (6) dyrking med ROCK inhibitor.

Tilsvarende de følgende tilpasninger var avgjørende for å få hele celler mens oppdateringen clamping: (1) grundig skylling kulturer serum-free ekstracellulære løsning, (2) la EF celler stå i den ekstracellulære løsningen for minst 4 h, (3). nytt purposing noen brukte elektroder som de fra mislykkede sel-fjerne rusk vei til neste EU-cellen, (4) legge 10 µM Gd3 + ekstracellulære løsningen å blokkere lekkasje strøm (hvis tilgjengelig) og å lette av pattedyr celle suspensjoner til glass. Vi forsiktig imidlertid at Gd3 + kan blokkere spenning-gated Ca2 + og/eller mechanosensitive kanaler uttrykt i EC celler.

Til tross for å ha nøye optimalisert culturing forholdene, vi fant noen begrensninger: EC cellene trenger 24 h å fullt fest ennå utløper etter ~ 72 h i kultur; Derfor, de har en 48-timers vinduet når de ville være egnet for elektrofysiologiske eksperimenter. Fordi klumpet seg celler innføre ofte kapasitans transienter som ikke kan kompenseres opptak, generasjon av EC enkeltceller er avgjørende. Skille EC celler fra epitel, cellene deretter bor i et ikke-native miljø (dvshøy glukose media med fosterets bovin serum og ROCK hemmer oppå den ekstracellulære matrisen som en kunstig kjelleren membran) og svare på stimuli fungerer ikke helt representant for EU-celle i vivo. Til tross for disse begrensningene gir primære dyrking av EC celler fortsatt innsikt i fysiologi.

EC cellene spille en avgjørende rolle i å opprettholde en velfungerende mage-tarmkanalen og kropp, og som sådan, det har vært mange metoder utviklet for å få en forståelse om EC celle elektrofysiologi. Enteroendocrine og EC celle elektrofysiologi ble undersøkt i udødeliggjort celle modeller5,8,13, primære EC cellekulturer fra marsvin11og mus3,4, våre metoden benytter celle kvalitet-bevare metoder for å skape en kultur som er minimalt behandlet og reflekterer de opprinnelige EF-cellene. Vi bruker en transgene musemodell, Tph1-CFP, som viser en cyan fluorescens i cytoplasma når Tph1 er tilstede9. Denne metoden kan også brukes for andre reporter eller slektslinje spores enteroendocrine celletyper. Vår metode oppnår også isolering av EC enkeltceller i minimal tid og enzymatiske behandling, som cellene er bare utsatt for en mild Collagenase XI i en minimal ennå effektiv konsentrasjon av 0,1 mg/mL (jejunum) og 0.6 mg/mL (kolon) for mindre enn en time. Resultatet av disse endringene er en kultur som er optimalisert for elektrofysiologiske studier av EU-celler.

Vi har brukt denne metoden for å studere electrophysiology og serotonin utgivelse i murine EC celler3. Muligheten til å med hell isolere, identifisere og EC kultur-enkeltceller forenkler viktig fremtid retninger i studier på EC celle fysiologi. Denne metoden kan brukes til å fastslå kritiske stier og kanaler involvert i EC celle exocytosis serotonin og andre EC celle-spesifikke sendere. Metoden kan også endres for å isolere og karakterisere fysiologi av menneskelige EC cellen sammen med bruk av Akridin oransje for EF celle identifikasjon13.

Som med de fleste vitenskapelige protokollutvikling, var kommunikasjon og objektive observasjoner avgjørende for feilsøking av denne protokollen. Når vi testet nye kultur metoder for overlevelse av våre kulturer, var det nyttig å telle antall fluorescerende celler som et mål på levedyktighet, beregne celle tettheter i hver rett, og samle representant bilder og videoer av kulturer over mange tid poeng. Når cellene kunne overleve forbi 24 h i kultur, arbeidet vi med å endre våre kulturer til elektrofysiologi eksperimenter. Sammen med samle bilder og detaljert observasjoner, var det viktig å opprettholde klar kommunikasjon mellom lab personell om justeringer mekanisk fordøyelsen og supplement og/eller substrat konsentrasjoner, slik at friske EC celler var klar for elektrofysiologiske karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Forfatterne takker fru Lyndsay Busby for administrativ hjelp og Mr. Robert Highet fra Mayo Clinic Division of Engineering design og 3D-utskrift av kultur parabol sette. Dette arbeidet ble støttet av NIH K08 AB (DK106456), Pilot og gjennomførbarhet stipend til AB fra Mayo Clinic Center for cellen signalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) og 2015 American gastroenterologisk avdeling Association forskning Scholar Award (AGA RSA) AB og NIH R01 til GF (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Tags

Biologi problemet 139 fordøyelsessystemet epitel enterochromaffin celle primære kultur hele cellen elektrofysiologi spenning klemme gjeldende klemme
Hele cellen elektrofysiologi primære kulturperler Murine Enterochromaffin celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J.,… More

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter