Biology

Hela cellen elektrofysiologi primära odlade murina Enterochromaffin celler

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112

Katilyn Knutson*¹, Peter R. Strege*¹, Joyce Li², Andrew B. Leiter², Gianrico Farrugia¹, Arthur Beyder¹

¹Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, ²Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

Summary

Enterochromaffin (EG) celler består av en liten delmängd av gastrointestinala epitelceller. EG celler är elektriskt retbara och släpp serotonin, men svårigheter i odling och identifiera EG celler har begränsad fysiologiska studier. Metoden presenteras här upprättar en primärkulturen modell kan bli föremål för undersökning av enstaka EG celler av elektrofysiologi.

Abstract

Enterochromaffin (EG) celler i det gastrointestinala (GI) epitelet utgör den största subpopulationen av enteroendokrina celler. Som specialiserade sensoriska celler, EG celler känna luminala stimuli och konvertera dem till serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release händelser. Dock är elektrofysiologi av dessa celler bristfällig eftersom de är svåra att kultur och identifiera. Metoden presenteras i detta papper konturer primära EG cellkulturer optimerad för enstaka cell elektrofysiologi. Detta protokoll använder tredjeparts transgena cyan fluorescerande protein (GFP) reporter för att identifiera musen EG celler i blandade primära kulturer, främja metoden till att erhålla högkvalitativa inspelningar av hela cellen elektrofysiologi i spänning - och ström-clamp lägen.

Introduction

Gastrointestinala (GI) epitel är ett mångfaldigt samhälle bestående av flera celltyper. Enteroendokrina celler omfattar omkring 1% av alla epitelceller och enterochromaffin (EG) celler är den största enteroendokrina celler befolkning¹. Nyligen genomförda studier visar att enteroendokrina² och EG³^,⁴ celler är elektriskt retbara. Vi är intresserade av att förstå primära EG cell elektrofysiologi. Således, syftet med denna studie var att upprätta primära EG cellkulturer optimerad för hela cellen elektrofysiologi.

Befintlig EG cell linjer som producerar och utsöndrar 5-HT (t.ex. QGP-1⁵, BON⁶, KRJ-1⁷) och har använts för att undersöka elektrofysiologi⁵^,⁸ genereras vanligtvis från förevigade neoplastiska vävnaderna. Medan de upplysningar som erhållits från dessa cellinjer är värdefulla⁵^,⁸, är studier av primär cell elektrofysiologi nödvändigt att ordentligt förstå EG cellfysiologi. Elektrofysiologi primära EG celler kräver isolering och kultur av enda epitelceller, som har begränsats av låg lönsamhet av epitelial kulturer.

Metoden kultur presenteras i denna studie bygger på transgena möss med fluorescently märkta EG celler, som Tph1-GFP⁹, används i denna studie. Metoden optimerar blandade primär epitelial kulturer utvecklat tidigare²^,¹⁰ för enstaka cell elektrofysiologi³. Tidigare metoder används kombinationer av Trypsin/EDTA plus kollagenas A eller EDTA och DTT för enzymatisk nedbrytning och täthetlutningar specifikt isolera och kultur marsvin¹¹ och råtta EG celler¹². Mer nyligen, var intestinal organoids genereras och mekaniskt störs elektrofysiologiska inspelningar⁴. Kulturer med dessa metoder är väl lämpade för serotonin släppa experiment, RT-qPCR-analys och, medan de kunde användas för elektrofysiologi, är beroende av framgången för tidskrävande organoid generation, täthetlutningar att identifiera EG celler, och cellulära störande effekter av Trypsin och EDTA. Däremot i protokollet som beskrivs här förbättrar enzymatisk och mekaniska behandlingar, optimerar odlingsskålar villkor och effektiviserar rutiner för att producera enkel och hälsosam EG celler passar de höga cellulära normer behövs för elektrofysiologi.

Denna metod kommer att vara användbar för forskare som vill arbeta på primära EG celler i blandade kulturer i stället för förevigade kulturer och vill undersöka elektrofysiologi av enstaka celler. Det kan dock bli mindre lämpliga för att studera cellpopulationer som behöver sortering eller långsiktiga kulturer som kräver överlevnad tidigare 72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Mayo Clinic. Primär cell kultur portion av detta protokoll baseras på tidigare publicerade metoder som kan användas som referens för ytterligare detaljer¹⁰. Alla experimentella rutiner måste godkännas av den (IACUC), och alla experiment måste utföras i enlighet med tillämpliga riktlinjer och förordningar.

1. kultur förberedelse

Media.
1. Förbereda EG cell komplett kulturmassmedia med hög glukos [4500mg/L] Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 5% fetalt bovint Serum (FBS), 1 L-glutamin och 1% Penicillin-Streptomycin (tabell 1).
  Obs: Media kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
2. Filtrera EG cell komplett kulturmassmedia och häll 25 mL av media i en 50 mL tub vid 37 ° C.
3. Förbereda matsmältningen media med hög glukos [4,500 mg/L] DMEM kompletteras med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (tabell 1).
4. Filtrera matsmältningen media och placera fyra 10 mL alikvoter av media i separata 50 mL rör och inkubera i 37 ° C vattenbad.
  Obs: Media kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
Enzym.
1. Väg 4 mg (jejunum) eller 24 mg (för kolon) av kollagenas XI [≥800 enheter/mg] i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  Obs: Kollagenas är stabil vid-20 ° C i upp till ett år.
2. Återsuspendera kollagenas alikvotens i 1 mL is kallt PBS med Ca^{2 +} och Mg^{2 +}. Vortex lösningen noggrant kombinera, och placera på is.
Beläggning kultur plattor.
1. Tina 150 µL av extracellulär matrix övernattning på 4 ° c på is.
2. Gör en 5% w/v extracellulärmatrix lösning genom att blanda 100 µL av tinade extracellulärmatrix med 2 mL iskallt serumfritt hög-glukos DMEM.
  Obs: Extracellulärmatrix stelnar i rumstemperatur och ska hanteras med pre kylda pipetter, rör och media tills den ska pälsen rätter.
3. Omedelbart coat glas inre cirkeln av glas-botten 35 mm rätter med 250 µL av 5% extracellulärmatrix lösningen. Detta recept kommer att omfatta upp till 8 rätter.
4. Placera de glasbotten rätterna i en inkubator i 37 ° C under de återstående cell kultur isolering stegen. Extracellulärmatrix tar minst 1 h att ställa men kan inkuberas i upp till 2,5 h när du utför andra isolering steg.
  Obs: Inkubationer längre än 3 h kan skapa en ansamling av extracellulär matrix som kunde hindra förseglar bildandet under hela cellen elektrofysiologi.

2. vävnad isolering

Enligt etiska riktlinjer, offra en 3till 6 veckor gamla manliga eller kvinnliga Tph1-GFP transgena möss (The Jackson Laboratory Stock: 028366)⁹ eller en annan reporter stam.
Obs: Vi använder en dödlig dos av stigande halter av koldioxid och en cervikal dislokation som en sekundär medel att säkerställa död. AVAM utskottet för dödshjälp anser också cervikal dislokation en tillåtna primära dödshjälp metod av personer utbildade i sin användning om djuren är först drogad.
Fästa euthanized musen ute på en polystyrenskum dissektion fas med 21 G nålar. Sanera mus buken med 70% etanol.
Dra musen huden spänd med mikro-dissektion pincett (#5), och sedan använda vass kirurgisk sax göra ett tvärgående snitt längst ned på musen buken att exponera intraperitoneal hålrummet. Göra ett annat snitt lodrätt upp buken tills bröstkorgen utsätts.
Använd mikro-dissektion tången för att flytta blindtarmen till vänster om musen för att uppnå en tydlig bild av tjocktarmen.
Använd mikro-dissektion saxen att skära den mest distala delen av kolon (men fortfarande proximala till rektum) och göra en andra skär distalt till magen. Plats extraherade tarmen till en 100 x 15 mm² petriskål fylld med 20 mL iskallt fosfat buffrad saltlösning (PBS).
Använd en liten linjal för att mäta och skära ut 10 cm av antingen mitten av kolon eller jejunum. Extrahera kolon genom att mäta ut segmentet 10 cm av tarmen ligger proximalt till den första snittet tagit ovanför ändtarmen. Identifiera jejunum genom vikning hela tunntarmen i hälften och göra en första snitt vid halvvägs och ett andra snitt 10 cm proximalt till först skär.
Obs: Fortsätt att utföra alla efterföljande isolering steg på is.
Fyll en 6 mL spruta med is kallt PBS och placera sprutans nål i lumen av extraherade intestinal segmentet. Använd mikro-dissektion tången att klämma och täta tarmen runt sprutans nål och försiktigt spola 10 mL PBS genom lumen att skölja bort avföring.
Invertera Tarmvävnaden genom försiktigt vävning mikro-dissektion tången genom lumen, nyper en tarmväggen och infällbara vävnaden proximala till spetsen av tången. Upprepa denna process tills segmentet är inifrån och ut med lumen utåt.
Använd mikro-dissektion sax för att klippa segmentet vävnad i 1 cm bitar.
Använd mikro-dissektion pincett för att överföra segmenten vävnad i en 50 mL bägare fylld med 5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Använd mikro-dissektion saxen skräda vävnad bitar till en flytande konsistens.
Placera malet vävnad och 15 mL is kallt PBS i en ren 50 mL tub av överföring pipett. Pulverisera 2 gånger med överföring pipetten, vänta på vävnaden att kvitta bort 15 mL PBS supernatanten och ersätta med färsk PBS. Upprepa denna process tre gånger tills PBS är klart.
Placera 50 mL röret med tvättade vävnad bitar på isen och sätta ishink i vävnadsodling huva.

3. enzymatisk och mekanisk matsmältningen

Första matsmältningen
1. Hämta en av de 50 mL rör innehållande 10 mL före värmde matsmältningen media från vattenbadet. Till 50 mL röret, tillsätt 250 µL av PBS kollagenas lösningen och malet Tarmvävnaden bitar.
  Obs: var noga med för att undvika inklusive alla PBS från föregående tvätt steg.
2. Placera 50 mL röret i vattenbad i 5 minuter (kolon eller jejunum) vid 37 ° C. Skaka tuben 2 x per minut.
  Obs: Den optimala tidpunkten och intensiteten av mekanisk matsmältningen kan variera och behöver fastställas av användaren. För att bestämma optimal matsmältning villkor, kan en 10 µL alikvot av celler ses efter varje matsmältningen. Under matsmältningen 1, bör supernatanten bestå av klumpar av celler.
3. Långsamt hackad vävnaden en gång med en 10 mL serologiska pipett. Kort låt vävnaden bitar kvitta, sedan använda överföring pipett att ta bort de hela 10 mL av supernatanten.
Understödja matsmältningen: Upprepa steg 3.1.1 till 3.1.3. Öka inkubationstiden till 10 min om smälta kolon och håll inkubationstiden på 5 min för jejunum.
Obs: Observation, supernatanten bör fortfarande utgöras av stora klumpar av celler.
Tredje matsmältningen
1. Upprepa steg 3.1.1
2. Placera 50 mL röret i 37 ° c vattenbad i ca 10 min (kolon eller små jejunum). Skaka tuben 2-3 x per minut med en högre intensitet än tumörheterogenitet 1 och 2.
3. Långsamt Pipettera vävnaden upp och ner med en 10 mL serologiska pipett. Tillåta vävnad bitar att nöja sig med en kort tid.
  Obs: Supernatanten bör bestå av en kombination av enstaka celler och små klumpar.
4. Använda en överföring pipett för att placera 10 mL av supernatanten till en ny 15 mL tub, tillsätt 2 mL av värmde EG cell komplett kultur media och Invertera en gång för att blanda.
5. Snurra på 100 x g under 5 minuter i rumstemperatur, sedan använda överföring pipett för att avlägsna supernatanten. Använd en överföring pipetten för att resuspendera återstående pelleten i 2,5 mL värmde EG cell komplett kultur media.
Fjärde matsmältningen: Upprepa steg 3.3.1 till 3.3.5. Öka inkubationstiden till 15 min för kolon och förbli 10 min för jejunum.
Obs: Supernatanten bör nu bestå av enstaka celler.

4. cellkultur

Använd en överföring pipett för att kombinera de cellsuspensioner samlas från tumörheterogenitet 3 och 4 i en ny 15 mL tub (5 mL total volym).
Ta bort en 10 µL alikvot av celler att räkna med en hemocytometer och snurra den återstående cellsuspensionen vid 100 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
Obs: Den slutliga cellsuspensionen kommer att bestå av små klumpar och enstaka celler.
Ta bort supernatanten med överföring pipett och återsuspendera pelleten i EG cell komplett kultur media på en densitet av 1 000 000 celler per mL.
Obs: Den slutliga volymen av cellsuspensionen beror på det slutliga celltalet. Typiska blodkroppar varierar från 2.000.000 till 4.000.000.
Ta bort belagd glasbotten kultur rätter från inkubatorn. Använda P1000 pipett för att ersätta extracellulär matrix från varje kultur maträtt med 250 µL av den slutliga cellsuspensionen.
Obs: Extracellulärmatrix beläggning tenderar att hålla sig till kanterna på glasbotten skålen. Särskild försiktighet måste vidtas för att ta bort beläggningen från längs kanten att förhindra gel uppbyggd.
Göra en stamlösning av ROCK-hämmare Y-27632 på 1 mM. Tillsätt 2,5 µL av stamlösning till varje glas botten maträtt att uppnå en fungerande koncentration av 10 µM ROCK hämmare i varje maträtt.
Obs: Detta steg är avgörande för överlevnaden av jejunum kulturer men är valfritt för kolon.
Placera varje kultur maträtt i en 37 ° C och 5% CO₂ inkubator för 24 till 72 h (figur 1).

5. beredning av EG celler för hela cellen elektrofysiologi

Linjen den inre diametern av Mikroskop scenen med två 5 x 0,5 cm remsor av vax filmen skapa en O-ring. Montera skålen 35 mm cell kultur inom o-ringen (figur 2A-B).
Skölj båda flytande skräp, såsom okopplade extracellulär matrix eller döda celler och kultur media serum helt borta från EG täta celler att förhindra antingen från hindrar bildandet mellan EG cell och elektrod. Användning av tre följande alternativ för att uppnå noggrann cell tvätt räcker för elektrofysiologi:
1. Alternativ 1: Lösning exchange är effektivare i en lång kammare mer så än en rund kammare. Eftersom EG cellerna odlades i runda 35 mm rätter, skapa en elliptisk plastinsats för skålen.
  1. Skapa skäret genom 3D-utskrifter eller genom traditionella fräsning metoder. Skäret vi använde var slipat från akrylplast med följande mått (i mm): ytterdiameter, 34,5; inre ellips, 20 x 9. yttre höjd, 10; inre höjd, 1,5; Bridge span, 3 x 3; brohöjder, 1,5; inlopp och utlopp, 4 x 4 varje.
  2. Sänka insatsen i kultur skålen (figur 2A-B) och säkra den till toppen av Mikroskop scenen med två 0,15-0,2 g bitar av modellera pressats till 1,2 x 0,3 x 0.1 cm rektanglar (figur 2A-C).
  3. Med pipett plast överföring sakta lägga extracellulära lösning på ena sidan av skålen (inlopp) samtidigt aspirera från andra sidan (utlopp).
2. Alternativ 2: Utan en bakåtkompilerade plast Infoga, lägga till extracellulära lösning genom överföring pipett från ena sidan av skålen (inlopp) samtidigt aspirera från motsatta sidan (utlopp). Rotera långsamt platsen för överföring pipetten (t.ex., N e s) medan spegling placeringen av aspiration nålen på motsatta sidan (t.ex. S till W-n).
3. Alternativ 3: Coat extracellulär matrix på rektangulära coverslips i steg 1.3.3., och kultur cellsuspension på dessa coverslips i steg 4,4. Överför denna täckglas till en rektangulär kammare fylld med extracellulära lösning, utelämna steg 5.1 och hoppa över steg 5.3. Skölj kammaren med extracellulära lösning från plast överföring pipett, som beskrivs i alternativ 1 (5.2.1.3).
Sätt tillbaka på scenen med cellkulturen ovan inverterade mikroskopet (figur 2D). Inkubera EG cellkulturen i serumfritt extracellulära lösning vid rumstemperatur.
Efter 4 timmar, skölj kulturen igen med extracellulära lösning som beskrivits ovan. Fortsätt med helcellsvaccin elektrofysiologi.

6. hela cellen elektrofysiologi EG celler från primära kultur

Att uppnå en hel Cell Giga-tätning
1. Dra ett dussin elektroder till ett motstånd på 1 – 5 MΩ.
  ANTECKNINGAR: Pipetter på 1 – 2 MΩ motstånd som ger 10-100 GΩ tätningar presterar bäst. Brand polering elektrod tips är inte nödvändigt för att uppnå GΩ tätningar.
2. Coat jämnt näskotten av alla pipetter med polymer. Håll pipetten vågrätt på marken och vinkelrätt mot framsidan av en värmepistol. Rotera långsamt pipetten tills polymeren hårdnar.
3. Häll en alikvot av intracellulära lösning i en 15 mL koniska rör. Överföra 1,2 mL av denna lösning i en 1,5 mL mikrocentrifug rör via 1 mL spruta. Återkalla ytterligare 0,7 mL intracellulära lösning i sprutan. Skingra luft från slutet av sprutan. Bifoga en flexibel 34 G, 67 mm nålen på sprutan, och spola ut eventuella kvarvarande luft från denna nål.
4. Identifiera en Tph1-GFP + cell som inte är i kontakt med någon annan cell eller skräp.
5. Fyll elektrod spetsen med intracellulära lösning. Återfyllning pipetten i sprutan. Noggrant flick pipetten med nageln att skingra luft bubbla gränssnittet.
6. Med kolven dras med 0,3 mL luft, bifoga en 6 mL spruta till uttaget av innehavaren slangar. Montera elektroden i hållaren.
  Obs: Anslut sprutan till slangen innan elektroden in Bad lösningen för att bibehålla neutral eller positiv trycket i intracellulära lösningen före tätning.
7. Ladda ett två-stegs spänning-clamp protokoll som registrerar steady state aktiverande strömmar genom en spänning stege på det första steget och registrerar tillgängliga strömmarna av en enda spänning på det andra steget. Öppna testet sigill (5 mV vid 50 kHz).
8. Lägre elektroden i Bad lösning. Med micromanipulators, manövrera elektrod tip i-planet med och direkt horisontellt från cellen. Utvisa den 0.3 mL luft ur sprutan.
9. Flytta försiktigt elektroden vågrätt längs x-axeln röra cellen. Se för en dimple visas på cellen EG och/eller en ökning i membran motstånd på tätning test. Om nödvändigt, justera elektroden ner längs z-axeln och/eller horisontellt längs x-axeln, inte flytta förbi mittlinjen av cellen.
10. Tillämpa 0,1 – 0,2 mL sug på 6 mL sprutan. Håll i kolvstången stadig tills 100 MΩ uppnås och sedan släpper greppet från kolven. Vänta tills cellen till giga-seal. Koppla försiktigt bort sprutan med en unscrewing rörelse.
  Obs: Om en EG-cellen inte försegla inledningsvis, kan det vara möjligt att åter försegla det med en efterföljande försök. Gör detta genom att försiktigt dra elektroden från en EG-cell med < 20 MΩ sigill motstånd. Styrning förbrukade elektroden med micromanipulators, segla riktade EG cellen att manuellt rensa bort matris eller skräp. Då försök att försegla EG cellen med en färsk elektrod.
Spela in hela cellen spänningskänsliga Na⁺ nuvarande.
1. Bifoga en 3 mL spruta med 0,5 – 1,0 mL luft. Tillämpa en snabb knackning på sug (0,1 – 0,5 mL) på en 3 mL spruta. Upprepa tills hela cellen tillgång uppnås och sedan koppla försiktigt ur sprutan.
  Obs: eftersom utförandet av en spruta kan variera från början och ändra gradvis med tiden och användning, öva i förväg med 3 mL sprutan (försegla änden med ett pekfinger) för att säkerställa att kolven kommer rekyl inom 0,1 – 0,2 mL av dess start position. Om så inte är fallet, sedan byta sprutan för en ny.
2. Slå på hela cellen kapacitans ersättning. Justera kapacitans och serie motstånd. Slå på serie motstånd ersättning. Fördröjning vid 60 ms, justera förutspått sedan korrigerade serie motstånd. Stäng på tätning prov.
3. Spela in ett genomsnitt på 5 körningar av hela-cell spänningskänsliga Na⁺ ström (figur 3A).
4. Snabbt ta del av två parametrar av spänningskänsliga Na⁺ nuvarande: spänningen vid fönstret nuvarande (figur 3B, röda symboler, korsningen av steady state aktivering och inaktivering kurvor) och toppström Na⁺ täthet.
  Obs: EG celler med toppströmmar Na⁺ mer än-50 pA i spänningen klämman läge vanligen går vidare till brand framkallade potentialer i nuvarande klämma läge. Dessutom strömmar större än-200 pA i spänningen klämman (figur 3A) därefter vanligt eld handlingspänningar spontant i nuvarande klämman från membranet potential (röda linjen, figur 3D) nära spänning den fönster nuvarande (röda symboler, figur 3B).
Posten framkallade handlingspänningar.
1. Stäng av den serie motstånd ersättningen. Stänga av kommandot externa. Växla läge från V-klämma till jag-klämma. Justera känsligheten. Ladda en episodisk nuvarande clamp-protokollet. Justera mängden innehav nuvarande 0 pA. Aktivera kommandot externa.
  FÖRSIKTIGHET: Slå inte från V-klämma till jag-klämman (eller tvärtom) utan att först stänga av kommandot externa.
2. Observera vilande membranpotentialen. Justera anläggningen aktuella indata så att membranet potential lyder under fönstret nuvarande (t.ex. -80 till -100 mV). Justera det episodiska nuvarande clamp-protokollet så att steg intervallet av aktuella indata är mindre än värdet av den nuvarande (figur 3C infälld, + 2 pA steg för-3 pA holding nuvarande).
3. Posten framkallade handlingspänningar. Observera den minsta mängden ström som injiceras för att avfyra en aktionspotential (figur 3C, sopa 3 av 5, ett + 4 pA steg från-3 pA holding = + 1 pA).
Spela in spontana handlingspänningar.
1. Stänga av kommandot externa. Ladda ett gap-fri (icke-episodisk) nuvarande klämma protokoll.
  Obs: Stäng inte kommandot externa igen tills mängden håller ström i gap-fri nuvarande klämma protokollet har verifierats för att lämpa sig för cellen.
2. Ändra anläggningen som är aktuella att vara hur mycket ström som injiceras i senaste svepet i det framkallade protokoll som inte eld en aktionspotential (figur 3D, den aktuella ingången under andra svepet, ett + 2 pA steg från-3 pA holding =-1 pA).
3. Aktivera kommandot externa. Dubbelkolla att den förutspådda anläggningen nuvarande ger membranet potential under tröskeln till brand en aktionspotential. Justera den nuvarande anläggningen vid behov. Spela in spontana aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kulturer:
Primära murina epitelceller från transgena Tph1-GFP modell tillmäter rätter efter 4 timmar och är redo för fysiologiska experiment mellan 24 till 72 h. När odlingsbetingelser inte hade optimerats, bestod epitelial cellkulturen av stora klumpar, flytande cellulära skräp, skadade membran och svag GFP signal i EG cellerna (figur 1A). Kulturer som har optimerats för elektrofysiologi bestod av enstaka celler och små klumpar. Friska EG celler identifierades lätt av ljusa gemensamma fiskeripolitiken fluorescens och hade fortfarande följas skålen efter kraftig tvätt (figur 1B).

Elektrofysiologi:
EG hela celler erhölls på bara 15 ±4% av försöken från kolon kulturer utan ROCK inhibitor (29 hela celler ur 182 försök från 22 kulturer) men 30 ±7% av försöken från kolon kulturer med ROCK-hämmare (27 hela celler ur 102 försök från 50 kulturer) (< C1 > figur 4A; p < 0,05 med icke-parametriska tvåsidiga t-test, kolon kulturer utan vs. med ROCK-hämmare). Likaså, jejunum EG celler utan ROCK hämmare inte överlevde länge nog för elektrofysiologi, medan EG hela celler erhölls på 41 ±3% av försöken från jejunum kultur med ROCK-hämmare (186 hela celler ur 447 försök från 50 kulturer) (figur 4A; p > 0,05 med icke-parametriska tvåsidiga t-test, jejunum vs. kolon med ROCK-hämmare).

Av hela cellen elektrofysiologi registrerades Na⁺ strömmar i spänning-clamp-läge och handlingspänningar (AP) i ström-clamp-läge. Na⁺ strömmar registrerades från 81,3 ±4.0% av TPH1-GFP +-celler från jejunum eller 64,1 ±9.2% från kolon³. Av 59 EG celler från jejunum kulturer bekräftas av spänning-clamp ha Na⁺ toppströmmar större än-25 pA, 19 EG celler i ström-clamp-läge sköt spontana AP (”spontana”), 29 EG celler sparken AP endast när framkallas av ett steg-protokoll i ström-klämma läge (”framkallas endast”) och 11 EG celler inte brand AP spontant eller genom steg protokoll (”icke-bränning”) (figur 4B). Spontan celler hade en genomsnittlig peak Na⁺ strömtäthet (I_PEAK) av -108,0 ±19.3 pA/pF, endast framkallas celler hade ett I_toppen av-60.2 ±9.2 pA/pF, medan icke-bränning celler hade ett I_toppen av-43.3 ±14 pA/pF (figur 4 B; p < 0,05, spontana vs. endast framkallas eller icke-bränning grupper; p > 0,05 endast framkallas vs. icke-bränning grupper). Skillnaden i strömtätheter inte var speglar hela cellen kapacitans, som spontana (3,3 ±0.2 pF), endast framkallas (2,9 ±0.2 pF) och icke-bränning (3,1 ±0.3 pF) celler hade liknande hela cellen kapacitanser (P > 0,05). EG cell Na⁺ strömmar och framkallade AP var känsliga för [Na⁺]_o koncentration och Na_V1.3 hämning³.

Figur 1 : Representativt utbud av kultur resultat. DIC med epifluorescence bilder av en primär epitelial jejunum kultur från en Tph1-GFP mus pläterade på en maträtt med glas i botten och odlade för 24 h. Dessa två bilder visar en rad kultur resultat från detta protokoll. Gemensamma fiskeripolitiken fluorescerande celler (vit) är enterochromaffin (EG) celler. (A) representativ bild från en kultur som är dålig kvalitet för elektrofysiologi. Kulturen består av stora klumpar, skadade cellmembran, låg fluorescens signal och flytande grupper av döda celler. (B) representativ bild från en kultur som har optimerats för elektrofysiologi. Kulturen består huvudsakligen av enda, friska celler och små klumpar som har anslutit sig till plattan. EG celler i denna kultur upprätthålla en stark fluorescens-signal. Skalstapeln = 100 µm; paneler är skalad 1:1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Beredning av cell kulturer för elektrofysiologi. En strategi för effektiv och grundlig sköljning av EG cellkulturer med serumfritt extracellulära lösning är avgörande för att minska extracellulära matrix och serum som skulle hindra förseglar bildandet. (A) material. Medurs uppifrån vänster: scenen, två 5 mm breda remsor av vax film, två 200 mg bitar av modellering lera, plast överföring pipett, #5 pincett, elliptiska inspelning kammare, 35 mm kultur skålen med glas botten. (B) följa vax film till den inre diametern av scenen, lägre elliptiska kammaren i kultur skålen och plattar leran i rektangulära strimlor. (C) försiktigt tryck kultur skålen i vax film-fodrade scenen och immobilisera inspelning kammaren av stretching modellering lera över kanten på skålen, från kammaren till scenen. Skölj EG celler med flera volymer av extracellulära lösning. (D) åter scenen monteringsfästena ovan inverterade mikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Representativa elektrofysiologi resultat. (A) hela cellen Na⁺ strömmar, inspelad av ett två-stegs spänning-clamp protokoll (infälld). 50 ms depolarizations från -120 mV aktivera kanaler under steg 1 (●), medan en ytterligare depolarisation 0 mV under steg 2 (○) aktiverar kanaler som ännu inte hade inaktiverat (dvs, är fortfarande tillgänglig att öppna). Rött spår, nuvarande framkallas av spänningen steg från -120 till -40 0 mV. (B) ström-spänning förhållandet mellan Na⁺ toppströmmar från panel A, steg 1 (●, steady state aktivering) eller steg 2 (○, steady state inaktivering). Skärningspunkten mellan steady state aktivering och inaktivering kurvorna visar ett litet fönster som är aktuella vid -40 mV (röda symboler). (C) handlingspänningar framkallas av depolariserande nuvarande stimuli. En aktionspotential kan avfyra förbi 0 mV (grå linje) när membranpotentialen når spänningen i Na⁺ fönster nuvarande (röd linje, -40 mV). Infälld, ström-clamp-protokollet, som injicerades 0 till + 8 pA för 50-ms depolarizations från en baslinje av -3 pA. (D) handlingspänningar eld från ovanpå spontana händelser som har Aricebo till -40 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Genomströmning av hela cellen elektrofysiologi. (A) Genomsnittlig procentandel av hela celler per försök för n dagar av arbete i frånvaro (-) eller närvaro (+) av ROCK-hämmare (10 µM). EG celler från jejunum överlevde inte 24 h i kultur utan ROCK inhibitor. (B) Na⁺ strömtätheter mätt i spänning-klämman från n EG celler, där handlingspänningar inte eld (icke-bränning), sparken endast när framkallas av en episodisk ström-clamp-protokollet (endast Elicited), eller sparken spontant i gap-fri ström-clamp-läge (spontan) (felstaplar är SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fullt ut förstå EG cellens funktion kräver en högkvalitativ primärkulturen metod att generera celler för hela cellen elektrofysiologi. Primära kulturer av GI epitel hade traditionellt varit svårt på grund av låg överlevnad. Denna metod att lindra denna confounding faktor, och ger kulturer av singular EG celler från antingen små eller stora tarm som kan överleva i flera dagar.

Vi hittade att följande var kritiska för att förbättra kvaliteten på kulturer vara lämplig för elektrofysiologi: (1) Invertera slemhinnan snarare än peeling den, (2) lägga en liten mängd BSA att matsmältningen media och FBS till kultur media, (3) sänka den Kollagenas XI koncentration, (4) justera varaktigheten och intensiteten av mekaniska agitation att öka antalet och hälsa av enstaka celler, (5) plätering extracellulärmatrix på en låg koncentration och (6) odling med ROCK-hämmare.

På samma sätt följande anpassningar var kritiska för att få hela celler medan patch fastspänning: (1) noggrant skölja kulturerna med serumfritt extracellulära lösning, (2) att låta EG celler står i den extracellulära lösningen för minst 4 h, (3). Re purposing någon tillbringade elektroder-liknande dem från misslyckade sälar-att rensa bort skräp på väg till nästa EG cell, (4) att lägga till 10 µM Gd^{3 +} till extracellulära lösningen att blockera läckage strömmar (i förekommande fall) och att underlätta följsamhet av däggdjursceller suspensioner till glas. Vi varning, dock att Gd^{3 +} kunde blockera spänningskänsliga Ca^{2 +} eller mechanosensitive kanaler uttryckt i EG celler.

Trots att ha noga optimerad culturing villkor, Vi hittade några begränsningar: EG celler behöver 24 h att helt koppla ännu förfalla efter ~ 72 h i kultur; Därför, de har ett 48-timmars fönster när de skulle vara lämplig för elektrofysiologiska experiment. Eftersom klumpgranulat celler ofta införa kapacitans transienter som inte kan ersättas från inspelningar, generation av enstaka EG celler är kritiska. Dock genom att separera EG celler från epitelet, cellerna sedan leva i en främmande miljö (dvshög glukos media med fetalt bovint serum och ROCK hämmare ovanpå den extracellular matrisen som en konstgjord basalmembranet) och kunde svara på stimuli inte helt representativa för EG cellen fungera i vivo. Trots dessa begränsningar ger primära odling av EG celler fortfarande inblick i deras fysiologi.

EG celler spelar en avgörande roll i att upprätthålla en väl fungerande mag-tarmkanalen och kropp, och som sådan har förekommit många metoder som utvecklats för att få en förståelse om EG cell elektrofysiologi. Enteroendokrina och EG cell elektrofysiologi undersöktes i förevigade cell modeller⁵^,⁸^,¹³, primära EG cellkulturer från marsvin¹¹och mus³^,⁴, vår metoden utnyttjar cell kvalitet-bevara metoder för att skapa en kultur som har varit minimalt bearbetade och återspeglar de infödda EG-cellerna. Vi använder en transgen musmodell, Tph1-GFP, som visar en cyan fluorescens i cytoplasman när Tph1 är närvarande⁹. Denna metod kan också användas för andra reporter eller härstamning-spåras enteroendokrina celltyper. Vår metod åstadkommer också isoleringen av enstaka EG celler i minimal tid och enzymatisk behandling, som cellerna utsätts endast för en skonsam kollagenas XI vid en minimal men effektiv koncentration på 0,1 mg/mL (jejunum) och 0,6 mg/mL (kolon) för mindre än en timme. Resultatet av dessa ändringar är en kultur som har optimerats för elektrofysiologiska studier av EG cellerna.

Vi har framgångsrikt använt denna metod för att studera elektrofysiologi och serotonin release i murina EG celler³. Förmågan att framgångsrikt isolera, identifiera och kultur enkelceller EG underlättar viktiga framtida inriktningar i studier på EG cellfysiologi. Denna metod kan användas för att ytterligare fastställa kritiska vägar och kanaler involverade i det EG cell exocytos av serotonin och andra EG-specifika sändare. Metoden kan också modifieras för att isolera och karakterisera physiologyen av mänskliga EG cellen tillsammans med användning av akridin orange för EG cell identifiering¹³.

Som med de flesta vetenskapliga protokoll utveckling, var kommunikation och opartiska iakttagelser kritiska vid felsökning av detta protokoll. När vi testade nya kultur metoder för överlevnaden av våra kulturer, var det bra att räkna antalet fluorescerande celler som ett mått på lönsamheten, uppskatta cell tätheter i varje maträtt och samla representativa bilder och videor av kulturer över många tid punkter. När cellerna skulle kunna överleva förbi 24 h i kultur, arbetade vi på ändra våra kulturer för elektrofysiologi experiment. Tillsammans med samlande bilder och detaljerade observationer, var det viktigt att ha tydlig kommunikation mellan lab personal angående justeringar till mekanisk matsmältningen och tillägg eller substrat koncentrationer, så att friska EG celler var redo för elektrofysiologiska karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Författarna vill tacka fru Lyndsay Busby för administrativt stöd och Mr Robert Highet från Mayo Clinic Division of Engineering för design och 3D-utskrifter av kultur maträtt skäret. Detta arbete stöds av NIH K08 AB (DK106456), Pilot och genomförbarhet Grant till AB från Mayo Clinic Center för cellsignalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) och 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) till AB och NIH R01 till GF (DK52766).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm x 15 mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip	Monoject
3 mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Biology

Hela cellen elektrofysiologi primära odlade murina Enterochromaffin celler

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.