Summary
Интегрин3 βvα — это тип сцепления белка, что высоко выражается на активированных эндотелиальные клетки проходят ангиогенеза. Таким образом оценки целостности Интегрин представляет большой интерес в онкологии. Здесь мы представляем метод подготовить 68Ga меченых radiopeptides и метода для оценки его биологической эффективности.
Abstract
Интегрин3 β αvявляется гетеродимерная молекулы адгезии, участвующие в миграции опухолевых клеток и ангиогенеза. Интегрин оверэкспрессировали в эндотелиальных клетках ангиогенных опухоли, где она обычно имеет низкой концентрации. Это конкретное выражение αvβ3 делает его допустимым biomarker для антиангиогенных и изображений наркотиков. Как функционального механизма визуализации позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) предоставляет информацию о биохимических и физиологических изменений в естественных условиях, благодаря своей уникальной высокой чувствительности в наномолярных масштабе. Следовательно на основе radiometal PET радиофармпрепаратов получили большое внимание для неинвазивной квантификации по ангиогенез опухоли. Этот документ содержит системный протокол подготовить новый radiometal меченых пептид для оценки по ангиогенез. Этот протокол содержит информацию о радиохимической надежности, липофильностью, клеток поглощения, сыворотка стабильности и фармакокинетические свойства. 68Ga-РГД пептида является одним из представитель PET лигандов сторону α βv3 Интегрин. Здесь мы представляем протокол подготовить 68Ga-РГД пептида и оценки биологической эффективности.
Introduction
Ангиогенез-это биологический процесс, который характеризуется развитием новых кровеносных сосудов. Среди многих факторов angiogenetic, α βv3 Интегрин ассоциируется с инвазивность, потому что Интегрин высоко выражается в ангиогенных опухоль сосудов, но отсутствует в нормальной ткани1.
Radiolabeled рецептор привязки пептиды с аргинина глицин аспартат (РГД) домена, который имеет высокое сродство к α βv3 Интегрин рецепторов, считаются перспективных ангиогенеза изображений агентов2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. были созданы несколько препаратов для Питомца и его биологические свойства были проверены в различных животных моделей8,9,10,11. С точки зрения радионуклида, 68Ga имеет ряд преимуществ перед другими радиоизотопов. Во-первых он имеет высокую доступность для пользователей и экономически выгодно, потому что циклотрон не требуется. Во-вторых 68Ga основе радиофармпрепаратов производят высокое пространственное разрешение, по сравнению с Однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), позволяя более точную количественную оценку. И наконец период полураспада 67.71 минут 68га может быть достаточно для подготовки мелких пептидов и белков.
Для получения стабильного комплекса с 68Ga, были разработаны многие энтеросорбенты. Представитель энтеросорбенты являются 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic кислота (тета), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic кислота (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic кислота (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic кислота (DTPA) и N, N'-di(2-hydroxybenzyl) Этилендиамин N, N'-diacetic кислота (HBED). Сообщается, что нота высокостабильных комплекс с 68Ga (стабильность постоянной 30.98 журнала)12,,1314.
Целью настоящего исследования является предоставить краткий протокол для развития новой radiopeptide (рис. 1). В качестве примера мы готовим 68Ga меченых РГД пептиды и нынешние методы биологической оценки этих аналогов в гранулы ксенотрансплантата модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования исследований животных протоколы, утвержденных Кореи Института радиологической и медицинских наук животных исследования Комитета. Все реагенты и растворители были приобретены и использованы без дальнейшей очистки. НОТА-РГД пептиды были подготовлены согласно литературе методы15.
Предупреждение: 68Ga испускает Позитрон и гамма-лучей. Все экспериментов, в том числе прямых или косвенных контактов с радиоактивными веществами, должна проводиться на подготовку и разрешается только персоналом. При обработке радиоактивных материалов, следует использовать надлежащего защитного оборудования, защитных, знак дозиметр радиации и кольца и дозиметр.
1. radiolabeling РГД пептиды с 68GaCl3
Примечание: 68Ga (t1/2 = 68 мин, β+ = 89% и EC = 11%) был получен из 68Ga /68Ge генератор.
- Элюировать 68GaCl3 от генератора с 4 мл 0,05 М HCl.
- Продувки азотом при 80 ° C за 30 мин до сухого 68GaCl3 (333 КБК, 1 мл) в 5 мл флаконе реакции.
- Добавить решение РГД-пептида (100 мкг) в ацетат натрия 1 М (100 мкл, pH 5-6) в реакции флакон, содержащий 68GaCl3 с шагом 1,2.
- Нагрейте смесь реакции при 80 ° C за 5 мин. Затем остудить до комнатной температуры.
- Очистки сырой продукт с высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Используйте следующие системы: столбец C-18, скорость потока 0,5 мл/мин, градиента склоне Ацетонитрил 1.17%/min (5% - 40% в 30 мин.), и элюции компонентов: A = 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в ацетонитриле, B = 0,1% TFA в воде.
Примечание: ВЭЖХ оснащен массив фотодиод детектор и Детектор радиоактивности. На 68Ga-РГД пептид была собрана во время удержания 12,5 минут (рис. 2). - Очищайте результирующий 68Ga-РГД пептид с помощью системы извлечения твердой фазы.
- Передайте решение через картридж реверс фаза C18 и мыть с 2 мл физраствора.
- Элюировать 68Ga-РГД пептид с 0,7 мл этанола 95%. Удаление растворителя при 80 ° C под газ азот для 20 мин и воссоздания с фосфат амортизированное saline (PBS) перед использованием.
- Фильтр radiolabeled продукт через фильтр 0,22 мкм стерильным и сформулировать в 1 мл стерильного физиологического раствора.
- Проверьте радиохимической доходность по радио тонкослойной хроматографии (ТСХ).
- Пятно 1 мкл на пластину хроматографии мгновенно тонким слоем (налогам, 10 см в длину). Разработка пластины в камере, содержащей элюента (водного раствора лимонной кислоты 0,1 М, pH 5,0) до 9 см от пятно.
Примечание: Коэффициент удержания для 68Ga-РГД пептид 0 и коэффициента удержания для непрореагировавшего 68Ga3 + 1.
- Пятно 1 мкл на пластину хроматографии мгновенно тонким слоем (налогам, 10 см в длину). Разработка пластины в камере, содержащей элюента (водного раствора лимонной кислоты 0,1 М, pH 5,0) до 9 см от пятно.
- Вычислите окончательного удельной активности от соотношения радиоактивности, соответствующий не радиоактивности как MBq/нмоль.
Примечание: После инъекции 100 мкл сформулировал 68Ga-РГД пептид для ВЭЖХ, количество нерадиоактивные компонента была рассчитана из стандартного калибровочной кривой с помощью нерадиоактивных Ga-РГД пептида.
2. в Vitro клеточного поглощения
Примечание: Уппсала 87 Злокачественная Глиома (U87MG) человеческий глиобластома клетки были выращены в Дульбекко изменение орел СМИ (DMEM), дополнены 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллин стрептомицина. Клетки были выращены в 150 мм блюд при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO2. Клетки были собраны или разделить trypsinization: 0,25% (w/v) трипсина и 0,02% (w/v) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS при 37 ° C для 3-5 мин.
- Семя U87MG клетки в 6-ну пластины на плотности 1 х 106 клеток/хорошо.
- Инкубировать клетки с 68Ga-РГД пептида (111 КБК) при 37 ° C на 30, 60, 90 и 120 мин подготовка образцов в трех экземплярах.
- Вымыть клетки 2 x с 2 мл PBS и урожай на trypsinization. Использование трипсин 0.25% (w/v) и 0,02% (w/v) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS при 37 ° C для 3-5 мин.
- Собирайте суспензию клеток (500 мкл) и меру в γ-счетчик.
- Рассчитайте процент поглощение соединения клеток, % (засчитывается в клетки/общее число).
3. стабильность в Vitro сыворотки
- Добавьте 500 мкл свежеприготовленные мыши сыворотки, 500 мкл человеческой сыворотки и 500 мкл PBS. Инкубируйте смесь при 37 ° C на 2 ч.
- Оценивать по налогам в определенные промежутки времени (30, 60, 90 и 120 мин). Месте 1-2 мкл Алиготе смеси к налогам пластине (мобильный фаза: лимонная кислота 0,1 М). Разработка пластину как в шаге 1.7.
Примечание: 68Ga3 + ожидается двигаться с растворителя Фронт, тогда как Приклеенные этикетку соединение будет оставаться в начале координат.
4. Определение липофильностью
- Добавить к системе октанол PBS 68Ga-РГД пептида (3,7 MBq, 3.7 мкл) (1:1, v/v, всего 1 мл).
- Смешайте флаконы энергично за 5 мин при комнатной температуре и центрифуги на 10000 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Взять 100 µL пробы с каждого слоя и измерения радиоактивности с γ-счетчик. Значения log P значение основано на среднем трех образцов.
5. опухоль модель
Примечание: Обнаженная мышей BALB/c (6-8 недель старый, девушки, n = 23) были использованы для этого исследования. Мышей были впоследствии использованы для PET исследований (n = 3) и накопление (n = 20) когда томов опухоль достигла 200-300 мм3 (1-2 недель после имплантации).
- Загрузите опухолевых клеток в 28 G, 1/2 дюйма инсулиновые шприцы.
- Inject U87MG клетки (5 x 10-6) в 100 мкл PBS в регионе левую руку.
- Анестезировать мыши с 2% изофлюрановая в газообразного кислорода во время инъекции клеток.
- Убедитесь, что мышь был под наркозом потерей педали вывода рефлекс следующем щипать пинцетом между пальцами правой задних ног. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
6. в естественных условиях количественная оценка αvβ3 Интегрин с помощью ПЭТ
- Анестезировать мышей с изофлюрановая 2% кислорода.
- Убедитесь, что мышь был под наркозом потерей педали вывода рефлекс следующем щипать пинцетом между пальцами правой задних ног. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
- Установите головку в центре PET козловой.
- Внутривенно применять 68Ga-РГД пептид решение (7.4 MBq, 200 мкл) гранулы ксенотрансплантата мыши модель через Вену хвост за 1 мин.
- В то же время выполняют ПЭТ-сканирование в режиме списка (динамическое сканирование) для 150 мин.
Примечание: Необработанные данные Питомца были реконструированы, определяемые пользователем сроки (то есть, каждые 30 мин). После ПЭТ-сканирование, сканирование Микро Компьютерная томография (КТ) (50 kVp рентгеновского, 0,16 мА) был проведен для ослабления коррекции.
7. накопление Ex Vivo
- Inject 68Ga-РГД пептида (0.37 MBq, 200 мкл) в Вену хвост ксенотрансплантата мышиной модели. Анестезировать мыши с 2% изофлюрановая в газообразного кислорода во время инъекции.
Примечание: Обнаженная мышей BALB/c, как описано в разделе 5, были разделены на четыре группы и жертву в разное время точках (n = 5 для каждой группы). - Просыпайтесь мышей сразу после отправления 68Ga-РГД пептида и пожертвовать их на 30, 60, 90 и 120 мин postinjection с двуокиси углерода эвтаназии.
Примечание: В тканях интерес были извлечены. Выбранные задачи были кровь, мышц, сердца, легких, печени, селезенки, желудка, кишечника, почек, костей и опухоли. - Вес ткани и измерения радиоактивности с γ-счетчик.
Примечание: Результаты были выражены в процентах вводят дозу в грамм ткани (% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хелаты 68GaCl3 с NOTA-РГД пептид была простой, и radiolabeling урожайность составила 99%. Реакция примесей были успешно удалены, как показано на рисунке 2. Радиохимический чистоту 68Ga-РГД пептид был больше чем 99%, и удельной активности в конце синтеза был 90-130 MBq/нмоль (рис. 3).
Поглощение ячейку значения для 68Ga-РГД пептида были 0,39%, 0,36%, 1,49% и 0,85% на 30, 60, 90 и 120 мин, соответственно. Сыворотки стабильности показал, что 68Ga-РГД пептид остались почти нетронутыми после 2 ч инкубации с человека или мыши сыворотки, а также PBS (> 92% стабильность на 2 ч). Коэффициент распределения (log P) была 2,96, указывающее обладает высокой липофильностью. PET показали первоначальные высокое поглощение в основных органов, в том числе печени, почек, сердца, мышц и опухоли. Однако в конце периода (90-150 мин), опухоли региона четко визуализируется. Опухоль к мышцы соотношение в 90 мин был 17.57 и остались неизменными, указанием кинетическая стабильности. Накопление ex vivo показали, что накопленной радиоактивности в опухоли 6.19, 4.96, 4.44 и 4,39 (% ID/g) на 30, 60, 90 и 120 мин, соответственно. Результаты эксперимента ex vivo согласуются в vivo PET выводы (рис. 4).
Рисунок 1 : Схема экспериментальных процедур. Эта цифра показывает Схематический обзор развития фармакологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Очищение 68Ga РГД пептид, ВЭЖХ. Синий сигнал радиоактивности и черный ультрафиолетового (УФ) сигнал. Волны УФ-314 Нм. Оси времени и ось y является поглощение блок (АС). На 68Ga-РГД пептида имеет 12.4 мин время удержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Структура его радиохимической чистоты и 68Ga-РГД пептид. НАЛОГАМ 68Ga-РГД пептид показал радиохимической высокой чистоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : PET изображений (верхний) и ex vivo накопление данных для 68 Ga-РГД пептида (нижний). ПЭТ данные были высказаны на внедорожник шкале от 0 до 5. Накопление данных показано являются среднее ± стандартное отклонение от пяти мышей в каждый момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании, мы ввели протокол подготовить radiopeptide, α βv3 Интегрин и его биологической оценки. Разработка традиционных лекарств включает в себя сложную процедуру. Это требует большое количество справочных материалов и оценки относительно длительного времени. Хотя предлагаемая методика не может заменить процесс деликатный оценки, эта система может использоваться для целей проверки. Эта предлагаемая система будет значительно сократить время и стоимость.
За последнее десятилетие как radiotracers для визуализации опухоли16широко изучены многие radiolabeled РГД пептиды. Для получения перспективных радиофармацевтических препаратов для клинических испытаний, должна предоставляться системных подходов для разработки лекарственных препаратов. Радиохимический осуществимость, высокая избирательность близость к целевой, метаболической стабильности и надлежащего фармакокинетики являются четыре основных проблем. Для обычной исследование ПЭТ разумные радиохимической урожайности обеспечивает надежность радиофармацевтических препаратов. Вопросы высокое сродство (> Нм) и избирательности (> 100 x) для целевого белка также удовлетворены. С точки зрения фармакокинетики кандидат PET tracer быстро выводится из нецелевых ткани и имеет время длительного хранения в опухоли, позволяя высокое соотношение целевых по ссылке. Кандидат радиофармацевтические препараты не должны хлопотно метаболитов в естественных условиях , может увеличить неспецифической привязки и обеспечивают низкий контраст изображения. Это важно для оценки всеобъемлющего характеристик, потому что каждый термин влияет на другие свойства, которые не являются независимыми.
Radiopeptide, в этом исследовании имеет подходящие наркотиков как свойства. На 68Ga-РГД пептида имеет радиохимической высокодоходных 99%, метаболической стабильности и надлежащего липофильностью. В эксперименте в естественных условиях , radiopeptide выставлены высокой селективностью (опухоль ссылка коэффициент = 17.57), и накопление ex vivo данные также свидетельствуют о значительных опухоли поглощения (до 6,19% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ядерных исследований и развития программы национального фонда исследований Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (№ 2017M2A2A6A02019904).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
References
- Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
- Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
- Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
- Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
- Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
- Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
- Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
- Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
- Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
- Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
- Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
- Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
- Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
- Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).
