Summary
La αvβ3 integrina es un tipo de proteína de adhesión que se expresa altamente en las células endoteliales activadas en la angiogénesis. Por lo tanto, evaluar la integridad de la integrina es de gran interés en oncología. Aquí, presentamos un método para preparar 68Ga-con la etiqueta radiopeptides y un método para evaluar su eficacia biológica.
Abstract
La αvβ3 integrina es una molécula de adhesión heterodiméricos implicados en la angiogénesis y migración de células del tumor. La integrina se sobreexpresa en células endoteliales de tumor angiogenic, donde por lo general tiene una baja concentración. Esta expresión específica de αvβ3 , es un biomarcador válido para antiangiogénicos y de drogas. Como una modalidad de proyección de imagen funcional, tomografía por emisión de positrones (PET) proporciona información acerca de bioquímicos y fisiológicos los cambios en vivo, debido a su alta sensibilidad única a escala nanomolar. Por lo tanto, radiofármacos PET basados en radiometal han recibido gran atención para la cuantificación no invasiva de la angiogénesis del tumor. Este documento ofrece un protocolo sistémico para preparar un nuevo péptido radiometal etiquetados para la evaluación de la angiogénesis. Este protocolo contiene información sobre confiabilidad radioquímica, lipofilia, captación celular, estabilidad del suero y propiedades farmacocinéticas. 68Ga-RGD-péptido es uno de los ligandos de mascota representativos hacia αvβ3 integrina. Aquí, presentamos un protocolo para preparar una 68Ga-RGD-péptido y la evaluación de su eficacia biológica.
Introduction
La angiogénesis es un proceso biológico que se caracteriza por el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Entre muchos factores angiogenetic, αvβ3 integrina se asocia con la invasividad, la integrina se expresa altamente en los vasos del tumor angiogenic porque está ausente en el tejido normal1.
Radiactivos atascamiento del receptor de péptidos con dominio arginina glicina aspartato (RGD), que tiene una alta afinidad hacia los receptores de integrina αvβ3 , se consideran prometedores angiogénesis agentes2,3 la proyección de imagen , 4 , 5 , 6 , 7. se han creado varios radiofármacos para PET y sus propiedades biológicas han sido validados en diferentes modelos animales8,9,10,11. En términos de un radionúclido, 68Ga tiene varias ventajas sobre otros radioisótopos. En primer lugar, tiene una alta accesibilidad para los usuarios y es económicamente ventajosa porque no se requiere de un ciclotrón. En segundo lugar, radiofármacos basados en Ga 68producen alta resolución espacial en comparación con la tomografía computada de la emisión del solo-fotón (SPECT), permitiendo la cuantificación más exacta. Por último, el período de minutos 67,71 68Ga puede ser suficiente para la preparación de pequeños péptidos o proteínas.
Para producir un complejo estable con 68Ga, se han desarrollado muchos queladores. Quelantes del representante son 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic ácido (TETA), ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic (NOTA), dietilentriaminopentaacético ácido (DTPA) y N, N'-di(2-hydroxybenzyl) etilendiamina-N, N'-ácido diacético (HBED). NOTA se ha divulgado para formar un complejo altamente estable con 68Ga (registro estabilidad constante 30.98)12,13,14.
El propósito del presente estudio es proporcionar un protocolo conciso para el desarrollo de un nuevo radiopeptide (figura 1). Por ejemplo, preparamos 68Ga-labeled RGD-péptidos y métodos actuales para la evaluación biológica de estos análogos en un modelo de xenoinjerto.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con las directrices para el cuidado y uso de animales de investigación en protocolos de actuación aprobados por el Instituto de Corea de radiológica y Comisión de estudios de animales de ciencias médicas. Todos los reactivos y solventes fueron adquiridos y utilizados sin una posterior purificación. NOTA-RGD-péptidos fueron preparados según métodos de literatura15.
PRECAUCIÓN: 68Ga emite positrones y rayos gamma. Todos los experimentos, incluyendo contacto directo o indirecto con las sustancias radiactivas, deben realizarse por capacitado y permitido exclusivamente a personal. Al manipular materiales radioactivos, puede usarse equipo de protección adecuado, blindaje, insignia de Dosímetro de radiación y anillos y un medidor de la encuesta.
1. radiolabeling péptidos RGD con 68GaCl3
Nota: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89% y EC = 11%) se obtuvo de la 68Ga /68generador de Ge.
- Eluir el 68GaCl3 del generador con 4 mL de 0.05 M de HCl.
- Purga con nitrógeno gas a 80 ° C por 30 min secar 68GaCl3 (333 BQ, 1 mL) en un frasco de reacción de 5 mL.
- Añadir una solución del péptido RGD (100 μg) en acetato de sodio de 1 M (100 μl, pH 5-6) al frasco de reacción que contiene 68GaCl3 en el paso 1.2.
- Calentar la mezcla de reacción a 80 ° C durante 5 minutos. A continuación, enfriarlo a temperatura ambiente.
- Purifique el producto crudo con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Utilice el siguiente sistema: una columna C-18, un caudal de 0,5 mL/min, una pendiente gradiente de acetonitrilo de 1.17%/min (5% - 40% en 30 minutos) y componentes de elución: A = 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) en acetonitrilo, B = 0.1% TFA en el agua.
Nota: El HPLC está equipado con un detector del arsenal del fotodiodo y un detector de radiactividad. 68Ga-RGD-péptido fue recogida en un tiempo de retención de 12,5 min (figura 2). - Purificar la resultante 68Ga-RGD-péptido utilizando un sistema de extracción de fase sólida.
- Pasar la solución a través de un cartucho de fase reversa C18 y lavar con 2 mL de solución salina.
- Eluir el 68Ga-RGD-péptido con 0,7 mL de etanol al 95%. Quite el solvente a 80 ° C bajo nitrógeno durante 20 min y reconstituir con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de su uso.
- Filtrar el producto radiactivo a través de un filtro estéril de 0,22 μm y formular en 1 mL de solución salina estéril.
- Compruebe el rendimiento radioquímico por cromatografía en capa fina de radio (TLC).
- Punto 1 μL en una placa de cromatografía de capa fina instantánea (objetivo, 10 cm de longitud). Desarrollar la placa en una cámara que contiene el eluyente (acuosa cítrico de 0,1 M, pH 5,0) hasta 9 cm de distancia del lugar.
Nota: El factor de retención por 68Ga-RGD-péptido es 0 y el factor de retención por 68Ga3 + 1.
- Punto 1 μL en una placa de cromatografía de capa fina instantánea (objetivo, 10 cm de longitud). Desarrollar la placa en una cámara que contiene el eluyente (acuosa cítrico de 0,1 M, pH 5,0) hasta 9 cm de distancia del lugar.
- Calcular la actividad específica de final de la relación de la radiactividad correspondiente a la no-radiactividad como MBq/nmol.
Nota: Después de la inyección de 100 μl de la formulado 68Ga-RGD-péptido a HPLC, se calculó la cantidad de componente no radiactivo de la curva de calibración estándar con Ga-RGD-péptido no radiactivo.
2. in Vitro la absorción celular
Nota: Las células de glioblastoma humano de Glioma maligno (U87MG) Uppsala 87 fueron cultivadas en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina. Las células fueron cultivadas en platos de 150 mm a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO2. Las células fueron cosechadas o separadas por tripsinización: tripsina 0.25% (p/v) y 0,02% (p/v) etilendiaminotetraacético ácido (EDTA) en PBS a 37 ° C durante 3-5 minutos.
- Células de semilla U87MG en placas de 6 pozos a una densidad de 1 x 106 células/pocillo.
- Incubar las células con 68Ga-RGD-péptido (111 kBq) a 37 ° C para 30, 60, 90 y 120 minutos preparar muestras por triplicado.
- Lavar las células 2 x con 2 mL de PBS y cosecha por tripsinización. Uso de tripsina 0.25% (p/v) y 0,02% (w/v) ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en PBS a 37 ° C durante 3-5 minutos.
- Recoger la suspensión celular (500 μl) y medida en un contador de γ.
- Calcular la absorción por ciento del compuesto por las células % (cuenta en los recuentos de células total).
3. estabilidad de suero in Vitro
- Añadir 500 μl de suero de ratón recién preparada, 500 μl de suero humano y 500 μl de PBS. Incubar la mezcla a 37 ° C por 2 h.
- OBJETIVO evaluar los intervalos de tiempo especificado (30, 60, 90 y 120 min). Alícuota de 1-2 μl de la mezcla en la placa del objetivo del punto (fase móvil: ácido cítrico de 0.1 M). Desarrollar la placa como en el paso 1.7.
Nota: 68Ga3 + se espera que se mueven con el frente del solvente, mientras que el compuesto marcado permanecerá en el origen.
4. determinación de la lipofilia
- Añadir 68Ga-RGD-péptido (3.7 MBq, 3.7 μL) en el sistema octanol-PBS (1:1, v/v, 1 mL total).
- Se mezclan los frascos vigorosamente durante 5 min a temperatura ambiente y centrifugar a 10.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Tomar 100 μl muestras de cada capa y medir la radioactividad con un contador de γ. El valor reportado log P se basa en el promedio de tres muestras.
5. tumor modelo
Nota: Ratones desnudos de BALB/c (6-8 semanas de edad, mujer, n = 23) se utilizaron para este estudio. Los ratones fueron posteriormente utilizados para estudios PET (n = 3) y biodistribución (n = 20) cuando los volúmenes de tumor llegaron a 200-300 mm3 (1-2 semanas después de la implantación).
- Carga de células tumorales en 28 G, jeringas de insulina 1/2 pulgada.
- Inyectar células U87MG (5 x 106) en 100 μl de PBS en la región del brazo izquierdo.
- Anestesiar el ratón con 2% de isoflurano en gas de oxígeno durante la inyección de la célula.
- Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado por la pérdida de la retirada del pedal reflex siguiente pellizcos con pinzas entre los dedos de la pata trasera derecha. No descuide un animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
6. cuantificación in Vivo de αvβ3 integrina usando PET
- Anestesiar los ratones con 2% de isoflurano en oxígeno.
- Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado por la pérdida de la retirada del pedal reflex siguiente pellizcos con pinzas entre los dedos de la pata trasera derecha. No descuide un animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
- Coloque la cabeza en el centro del pórtico del animal doméstico.
- Administrar por vía intravenosa 68solución Ga-RGD-péptido (7.4 MBq, 200 μL) al xenoinjerto ratón modelo a través de la vena de la cola durante 1 minuto.
- Al mismo tiempo, realizar una exploración del animal doméstico en el modo de lista (análisis dinámico) de 150 min.
Nota: Los datos brutos de la PET fueron reconstruidos por un definido por el usuario marco de tiempo (es decir, cada 30 minutos). Después de la exploración del animal doméstico, una exploración de la tomografía micro computada (CT) (50 kVp de rayos x, 0.16 mA) se llevó a cabo para la corrección de atenuación.
7. Ex Vivo biodistribución
- 68Ga-RGD-péptido (0,37 MBq, 200 μL) se inyecte en la vena de la cola del modelo de xenoinjerto murino. Anestesiar el ratón con 2% de isoflurano en gas de oxígeno durante las inyecciones.
Nota: Ratones BALB/c nude, como se describe en la sección 5, fueron divididos en cuatro grupos y sacrificados en diferentes puntos temporales (n = 5 por grupo). - Despertar los ratones inmediatamente después de la administración de 68Ga-RGD-péptido y sacrificar a los 30, 60, 90 y 120 min postinjection con la eutanasia de dióxido de carbono.
Nota: Se extrajeron los tejidos de interés. Las metas eran la sangre, músculo, corazón, pulmón, hígado, bazo, estómago, intestino, riñones, hueso y tumor. - Peso del tejido y medir la radioactividad con un contador de γ.
Nota: Los resultados se expresaron como el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g).
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Representative Results
La quelación de 68GaCl3 con el péptido-RGD-NOTA era sencilla, y el rendimiento radiolabeling fue de 99%. Impurezas de reacción fueron quitadas con éxito tal como se muestra en la figura 2. La pureza radioquímica de 68Ga-RGD-péptido fue mayor al 99% y actividad específica al final de la síntesis fue 90-130 MBq/nmol (figura 3).
La captación celular valores 68Ga-RGD-péptido fueron 1.49%, 0,85%, % 0,36 y 0,39% a 30, 60, 90 y 120 min, respectivamente. Estabilidad del suero mostró que 68Ga-RGD-péptido permanecía casi intacto después de 2 h de incubación con humanos o suero de ratón así como PBS (> 92% estabilidad a 2 h). El coeficiente de partición (log P) fue de 2.96, indicando alta lipofilia. Animal doméstico demostró una absorción alta inicial en los principales órganos, incluyendo el hígado, riñón, corazón, músculo y tumor. Sin embargo, en el último período (90-150 min.), la región del tumor fue claramente visualizada. La relación del tumor al músculo en 90 min fue 17.57 y permaneció sin cambios, indicando estabilidad cinética. La biodistribución ex vivo demostró que la radiactividad acumulada en el tumor era 6.19, 4.96, 4.44 y 4.39 (% ID/g) en 30, 60, 90 y 120 min, respectivamente. Los resultados del experimento ex vivo eran según la en vivo resultados de PET (figura 4).
Figura 1 : Diagrama de flujo de los procedimientos experimentales. Esta figura muestra un Resumen esquemático del desarrollo del radiofármaco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Purificación de 68Ga-RGD-péptido por HPLC. Azul es señal de radiactividad y el negro es ULTRAVIOLETA (UV). La longitud de onda de UV es 314 nm. El eje x es el tiempo y el eje y es unidad de absorbancia (UA). 68Ga-RGD-péptido tiene 12,4 minutos de tiempo de retención. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Estructura de 68Ga-RGD-péptido y su pureza radioquímica. El objetivo de 68Ga-RGD-péptido demostró alta pureza radioquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : La proyección de imagen del animal doméstico (superior) y ex vivo datos de biodistribución 68 Ga-RGD-péptido (más bajo). Datos del animal doméstico se expresaron en la escala de la SUV de 0 a 5. Datos de biodistribución que se muestran son la media ± la desviación estándar de cinco ratones en cada momento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el presente estudio, presentamos un protocolo para preparar un radiopeptide a αvβ3 integrina y su evaluación biológica. Desarrollo de fármacos tradicionales consiste en un procedimiento complicado. Requiere una gran cantidad de material de referencia y un tiempo relativamente largo. Aunque la metodología sugerida no puede sustituir el proceso de evaluación delicado, este sistema puede utilizarse para fines de detección. Propuesta sistema reduciría considerablemente el tiempo y costo.
En la última década, se han estudiado ampliamente muchos radiactivos RGD-péptidos como radiotrazadores para la proyección de imagen de tumores16. Para obtener radiofármacos prometedores ensayos clínicos, se deben proporcionar enfoques sistémicos para el desarrollo de fármacos. Viabilidad radioquímica, alta selectividad-afinidad al target, estabilidad metabólica y farmacocinética adecuada son cuatro preocupaciones principales. Para un estudio del animal doméstico rutinario, un razonable rendimiento radioquímico asegura la fiabilidad de los radiofármacos. Las cuestiones de alta afinidad (> nM) y selectividad (> 100 x) el destino proteína también están satisfechos. En cuanto a la farmacocinética, el rastreador de mascota de candidato es excretado rápidamente de los tejidos no Diana y tiene un tiempo de retención largo en el tumor, lo que permite una alta proporción de blanco de referencia. Radiofármacos de candidato no deben tener metabolitos problemáticos en vivo que podrían aumentar el atascamiento no específico y la proyección de imagen de bajo contraste. Es importante evaluar las características completa porque cada término influye en las propiedades que no son independientes.
La radiopeptide en esta investigación tiene propiedades de droga como convenientes. 68Ga-RGD-péptido tiene un alto rendimiento radioquímico de 99%, estabilidad metabólica y lipofilia adecuada. En el experimento en vivo , la radiopeptide exhibe alta selectividad (relación tumor de referencia = 17.57), y los datos de biodistribución ex vivo también demostraron absorción significativa del tumor (hasta un 6.19% ID/g).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una investigación y programa de desarrollo de la beca nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (núm. 2017M2A2A6A02019904).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
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