Summary
Αvβ3 integrin är en typ av vidhäftning protein som uttrycks mycket på aktiverade endotelceller som genomgår angiogenes. Således, utvärdera integriteten av integrin är av stort intresse i onkologi. Här introducerar vi en metod för att förbereda 68Ga-märkt radiopeptides och en metod för att bedöma dess biologiska effektiviteten.
Abstract
Αvβ3 integrin är en heterodimeriskt vidhäftning molekyl involverad i tumör cellmigration och angiogenes. Integrin är i ökad utsträckning hos angiogena tumör endothelial celler, där det vanligtvis har en låg koncentration. Detta specifika uttryck för αvβ3 gör det en giltig biomarkör för antiangiogenetisk och imaging droger. Som en funktionell bildgivande modalitet ger positronemissionstomografi (PET) information om biokemiska och fysiologiska förändringar i vivo, på grund av dess unika hög känslighet i nanomolar skala. Radiometal-baserade PET radiofarmaka har därför fått stor uppmärksamhet för icke-invasiv kvantifiering av tumör angiogenes. Detta dokument ger en systemisk protokoll för att förbereda en ny radiometal-märkt peptid för utvärdering av angiogenes. Detta protokoll innehåller information om radiokemiska tillförlitlighet, fettlöslig, cell upptag, serum stabilitet och farmakokinetiska egenskaper. Den 68Ga-RGD-peptid är en av de representativa PET-liganderna mot αvβ3 integrin. Här introducerar vi ett protokoll för att förbereda en 68Ga-RGD-peptid och utvärdering av dess biologiska effekt.
Introduction
Angiogenes är en biologisk process som kännetecknas av utveckling av nya blodkärl. Bland många angiogenetic faktorer, αvβ3 integrin är associerade med invasivitet, eftersom integrin uttrycks mycket angiogena tumör fartyg men är frånvarande i normal vävnad1.
Radiomärkt receptor bindande peptider med arginin glycin aspartat (RGD) domänen, som har en hög affinitet motvα β3 integrin receptorer, betraktas som lovande angiogenes imaging agenter2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. flera radiofarmaka har skapats för husdjur och dess biologiska egenskaper har validerats i olika djurmodeller8,9,10,11. När det gäller en radionuklid har 68Ga flera fördelar jämfört med andra radioisotoper. För det första, det har en hög tillgänglighet för användare och är ekonomiskt fördelaktiga eftersom en cyclotron inte krävs. För det andra producera 68Ga-baserade radiofarmaka hög rumslig upplösning jämfört med single-photon utsläpp beräknas tomography (SPECT), möjliggör mer exakt kvantifiering. Slutligen kan 67.71 minuter halveringstiden för 68Ga vara tillräckligt för beredning av små peptider eller proteiner.
För att producera ett stabilt komplex med 68Ga, har många kelater utvecklats. Representativa kelater är 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic syra (TETA), 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic syra (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic syra (DTPA), och N, N'-di(2-hydroxybenzyl) etylendiamin-N, N'-diacetic syra (HBED). NOTA har rapporterats att bilda ett mycket stabila komplex med 68Ga (log stabilitet konstant 30,98)12,13,14.
Syftet med föreliggande studie är att ge en koncis protokoll för utvecklingen av en ny radiopeptide (figur 1). Som ett exempel förbereder vi 68Ga-märkt RGD-peptider och nuvarande metoder för biologisk utvärdering av dessa analoger i xenograft modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök genomfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur under protokoll godkänts av Korea Institute av radiologiska och medicinska vetenskaper djur studier kommittén. Alla reagenser och lösningsmedel köptes och användas utan ytterligare rening. NOTA-RGD-peptider utarbetades enligt litteraturen metoder15.
FÖRSIKTIGHET: 68Ga avger både positron och gammastrålar. Alla experiment, inklusive direkt eller indirekt kontakt med radioaktiva ämnen, måste genomföras av utbildad och tillåts endast personal. Vid hantering av radioaktivt material, bör korrekt skyddsutrustning, avskärmning, strålning dosimeter badge och ringar och en undersökning mätare användas.
1. radiolabeling RGD-peptider med 68GaCl3
Obs: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89% och EG = 11%) erhölls från 68Ga /68Ge generator.
- Eluera 68GaCl3 från generatorn med 4 mL 0,05 M HCl.
- Rensa med kvävgas vid 80 ° C i 30 min torka 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) i en 5 mL injektionsflaska av reaktion.
- Lägga till en lösning av RGD-peptid (100 µg) i 1 M natriumacetat (100 µL, pH 5-6) till reaktion injektionsflaskan med 68GaCl3 från steg 1.2.
- Värme reaktionsblandningen vid 80 ° C i 5 min. Sedan kan du svalka det ner till rumstemperatur.
- Rena råa produkten med högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Använd följande system: en C-18 kolumn, ett flöde av 0,5 mL/min, en lutning lutning acetonitril 1.17%/min (5% - 40% i 30 min), och eluering komponenter: A = 0,1% trifluorättiksyra (TFA) i acetonitril, B = 0,1% transfettsyror i vatten.
Obs: HPLC är utrustad med en fotodiod array detektor och en radioaktivitet detektor. Den 68Ga-RGD-peptid samlades på en retentionstid på 12,5 min (figur 2). - Rena den resulterande 68Ga-RGD-peptid med hjälp av en fast fas utvinningssystem.
- Låt lösningen rinna genom en C18 omvänd-fas patron och tvätta med 2 mL koksaltlösning.
- Eluera 68Ga-RGD-peptid med 0,7 mL 95% etanol. Ta bort lösningsmedlet vid 80 ° C under kvävgas i 20 min och Beredes med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före användning.
- Filtrera radioaktivt märkt produkten genom ett 0,22 µm sterila filter och formulera i 1 mL steril koksaltlösning.
- Kontrollera radiokemiska avkastningen genom radio-tunnskiktskromatografi (TK).
- Spot 1 µL på en omedelbar tunt lager kromatografi tallrik (ITLC, 10 cm i längd). Utveckla plattan i en kammare som innehåller eluenten (vattenlösning 0.1 M citronsyra, pH 5,0) tills 9 cm bort från platsen.
Observera: Bibehållande faktorn för 68Ga-RGD-peptid är 0 och bibehållande faktorn för oreagerade 68Ga3 + 1.
- Spot 1 µL på en omedelbar tunt lager kromatografi tallrik (ITLC, 10 cm i längd). Utveckla plattan i en kammare som innehåller eluenten (vattenlösning 0.1 M citronsyra, pH 5,0) tills 9 cm bort från platsen.
- Beräkna den slutliga specifika aktiviteten från förhållandet mellan radioaktivitet som motsvarar den icke-radioaktiviteten som MBq/nmol.
Obs: Efter injektion av 100 µL av den formulerade 68Ga-RGD-peptid till HPLC beräknades beloppet för icke-radioaktiva komponenten standard kalibreringskurvan med nonradioactive Ga-RGD-peptid.
2. in Vitro cellernas upptag
Obs: Uppsala 87 malignt gliom (U87MG) mänskliga glioblastoma celler odlades i Dulbeccos modifierade örnens media (DMEM), kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin. Celler odlades i 150 mm rätter vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2. Cellerna var skördas eller dela av trypsinization: 0,25% (w/v) trypsin och 0,02% (w/v) etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i PBS vid 37 ° C i 3-5 min.
- Frö U87MG celler i 6-väl plattor på en densitet på 1 x 106 celler per brunn.
- Inkubera cellerna med 68Ga-RGD-peptid (111 kBq) vid 37 ° C i 30, 60, 90 och 120 min. Förbered prover i tre exemplar.
- Tvätta cellerna 2 x med 2 mL PBS och skörd av trypsinization. Använd 0,25% (w/v) trypsin och 0,02% (w/v) etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i PBS vid 37 ° C i 3-5 min.
- Samla cellsuspension (500 µL) och åtgärd i en γ-räknare.
- Beräkna procent upptaget av sammansatta av celler av % (antal celler/totala antalet).
3. in Vitro Serum stabilitet
- Tillsätt 500 µL av nylagade mus serum, 500 µL humant serum och 500 µL av PBS. Inkubera blandningen vid 37 ° C i 2 h.
- Utvärdera genom ITLC vid angivna tidsintervall (30, 60, 90 och 120 min). Plats 1-2 µL alikvot av blandningen till ITLC plattan (mobil fas: 0,1 M citronsyra). Utveckla plattan som i steg 1,7.
Obs: 68Ga3 + förväntas flytta med lösningsmedel framsidan, märkta föreningen kommer att förbli på beskärningen.
4. bestämning av fettlöslig
- Lägga till 68(3,7 MBq, 3,7 µL) Ga-RGD-peptid i oktanol-PBS-systemet (1:1, v/v, totalt 1 mL).
- Blanda flaskorna kraftigt i 5 min i rumstemperatur och centrifugera vid 10 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Ta 100 µL prov från varje lager och mäta radioaktiviteten med γ-räkneverk. Rapporterade log P värdet baseras på genomsnittliga tre prover.
5. tumör modell
Obs: BALB/c naken möss (6-8 veckor gammal, Kvinna, n = 23) användes för denna studie. Möss användes därefter för PET-studier (n = 3) och biodistribution (n = 20) när tumören volymerna nådde 200-300 mm3 (1-2 veckor efter implantationen).
- Läsa in tumörceller i 28 G, 1/2 tums insulinsprutor.
- Injicera U87MG celler (5 x 106) i 100 µL av PBS i regionen vänster arm.
- Söva musen med 2% isofluran i syrgas under cell injektionen.
- Se till att musen har varit sövd av förlusten av den pedal tillbakadragande reflexen följande klämmande med pincett mellan tårna på höger bakben foten. Lämna inte ett djur utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
6. in Vivo kvantifiering av αvβ3 Integrin använder PET
- Söva möss med 2% isofluran i syre.
- Se till att musen har varit sövd av förlusten av den pedal tillbakadragande reflexen följande klämmande med pincett mellan tårna på höger bakben foten. Lämna inte ett djur utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
- Placera huvudet i mitten av PET utlastningsanordningen.
- Intravenöst administrera 68Ga-RGD-peptid lösning (7,4 MBq, 200 µL) till xenograft mus modell via svans venen för 1 min.
- Samtidigt, utföra en PET-undersökning i listläge (dynamisk scan) för 150 min.
Obs: PET rådata rekonstruerades av en användardefinierad tidsperiod (dvs.varje 30 min). Efter i PET-bilden, en mikro-datortomografi (CT) scan (50 kVp av röntgen, 0,16 mA) genomfördes för dämpning korrigering.
7. Ex Vivo Biodistribution
- Injicera svans venen i xenograft musmodell 68Ga-RGD-peptid (0,37 MBq, 200 µL). Söva musen med 2% isofluran i syrgas under injektionerna.
Obs: BALB/c naken möss, som beskrivs i avsnitt 5, var indelade i fyra grupper och offras vid olika tidpunkter (n = 5 per grupp). - Vakna mössen omedelbart efter administrering av 68Ga-RGD-peptid och offra dem på 30, 60, 90 och 120 min postinjection med koldioxid dödshjälp.
Obs: Utvanns vävnader av intresse. Valda mål var blod, muskler, hjärta, lunga, lever, mjälte, magen, tarmen, njurar, ben, och tumör. - Väga vävnaden och mäta radioaktiviteten med γ-räkneverk.
Obs: Resultaten var uttryckt som den procentandel injicerade dosen per gram vävnad (% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kelering av 68GaCl3 med NOTA-RGD-peptiden var enkel, och radiolabeling avkastningen var 99%. Reaktion föroreningar bort som visas i figur 2. 68Ga-RGD-peptid strålningskemisk renhet var större än 99%, och specifik aktivitet i slutet av syntesen var 90-130 MBq/nmol (figur 3).
Cell upptaget värden för 68Ga-RGD-peptid var 1,49%, 0,85%, 0,36% och 0,39 procent på 30, 60, 90 och 120 min, respektive. Serum stabilitet visade att 68Ga-RGD-peptid återstod nästan intakt efter 2 h inkubation med mänskliga eller mus serum samt PBS (> 92% stabilitet på 2 h). Fördelningskoefficienten (log P) var 2,96, som anger hög fettlöslig. PET visade en inledande högt upptag i stora organ, inklusive lever, njure, hjärta, muskler och tumör. Dock i den sena perioden (90-150 min), var regionen tumören tydligt visualiserat. Tumör-till-muskel förhållandet på 90 min var 17,57 och oförändrade, som visar kinetiska stabilitet. I ex vivo -biodistribution visade att den ackumulerade radioaktiviteten i tumören var 6.19, 4,96, 4.44 och 4.39 (% ID/g) på 30, 60, 90 och 120 min, respektive. Resultaten av det ex vivo -försöket var i enlighet med den i vivo PET fynd (figur 4).
Figur 1 : Flödesdiagram av experimentella procedurer. Denna figur visar en schematisk översikt över utvecklingen av radioaktiva läkemedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Rening av 68Ga-RGD-peptid genom HPLC. Blå är radioaktivitet signal och svart är ultraviolett (UV) signal. UV våglängden är 314 nm. X-axeln är dags och y-axeln är absorbans unit (AU). Den 68Ga-RGD-peptid har 12,4 min av retentionstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Struktur 68Ga-RGD-peptid och dess strålningskemisk renhet. ITLC 68Ga-RGD-peptid visade hög strålningskemisk renhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : PET imaging (övre) och ex vivo biodistribution data för 68 Ga-RGD-peptid (nedre). SÄLLSKAPSDJUR data uttrycktes på SUV skalan från 0 till 5. Biodistribution data som visas är den medelvärde ± standardavvikelsen från fem möss vid varje tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie, introducerade vi ett protokoll för att förbereda en radiopeptide inriktning αvβ3 integrin och dess biologisk utvärdering. Utveckling av traditionella läkemedel innebär en komplicerad procedur. Det kräver en stor mängd referensmaterial och en relativt lång utvärdering tid. Även om den föreslagna metoden inte kan ersätta delikat utvärderingsprocessen, kan detta system användas vid screening. Det föreslagna systemet skulle avsevärt minska tiden och kostnaderna.
Under det senaste årtiondet, har många radiomärkt RGD-peptider studerats som radiotracers för imaging tumörer16. För att få lovande radiofarmaka för kliniska prövningar, bör systemiska metoder för utveckling av läkemedel tillhandahållas. Radiokemiska genomförbarhet, hög selektivitet-affinitet till målet, metabola stabilitet och ordentlig farmakokinetik är fyra stora bekymmer. För en rutinmässig PET-undersökning säkerställer en rimlig radiokemiska avkastning tillförlitligheten i radiofarmaka. Problemen med hög affinitet (> nM) och selektivitet (> 100 x) till målet för protein är också nöjd. När det gäller farmakokinetik, kandidat PET spårämne utsöndras snabbt från den målarter vävnaden och har en lång retentionstid i tumören, vilket ger ett högt mål-till-reference förhållande. Kandidaten radiofarmaka bör inte ha besvärande metaboliter i vivo som kunde öka icke-specifik bindning och ger låg kontrast imaging. Det är viktigt att bedöma de övergripande egenskaperna eftersom varje termin påverkar andra egenskaperna, som inte är oberoende.
Den radiopeptide som infördes i denna forskning har lämpliga läkemedel-liknande egenskaper. Den 68Ga-RGD-peptid har en hög radiokemiska avkastning av 99%, metabol stabilitet och ordentlig fettlöslig. I i vivo experimentet, radiopeptide uppvisade hög selektivitet (tumör-till-referensandelen = 17,57), och ex vivo biodistribution data visade också betydande tumör upptag (upp till 6.19% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en kärnteknisk forskning och utveckling av programmet av National Research Foundation i Korea (NRF) bidraget finansieras av den koreanska regeringen (nr 2017M2A2A6A02019904).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
References
- Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
- Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
- Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
- Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
- Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
- Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
- Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
- Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
- Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
- Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
- Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
- Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
- Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
- Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).
