Summary
Αvβ3 integrin er en type af adhæsion protein, der er stærkt udtrykt på aktiverede endotelceller gennemgår angiogenese. Således er evaluere integriteten af integrin af stor interesse i onkologi. Her, indfører vi en metode til at forberede 68Ga-mærket radiopeptides og en metode til at vurdere dens biologiske effektivitet.
Abstract
Αvβ3 integrin er en heterodimerisk vedhæftning molekyle involveret i tumor celle migration og angiogenese. Integrin er overexpressed i angiogene tumor endotelceller, hvor det typisk har en lav koncentration. Denne særlige udtryk for αvβ3 gør det en gyldig biomarkør for antiangiogenic og billeddiagnostiske narkotika. Som en funktionel imaging modalitet giver positron emissions tomografi (PET) information om biokemiske og fysiologiske ændringer i vivo, på grund af sin enestående høj følsomhed på nanomolar skala. Derfor har radiometal-baseret PET radioaktive lægemidler fået stor opmærksomhed for non-invasiv kvantificering af tumor angiogenese. Dette papir giver en systemisk protokol for at forberede en ny radiometal-mærket peptid for evaluering af angiogenese. Denne protokol indeholder oplysninger om radiokemiske pålidelighed, lipofile, celle optagelse, serum stabilitet og farmakokinetiske egenskaber. 68Ga-M.H.T.-peptid er en af de repræsentative PET ligander mod αvβ3 integrin. Her introducerer vi en protokol for at forberede en 68Ga-M.H.T.-peptid og evalueringen af dens biologiske effekt.
Introduction
Angiogenese er en biologisk proces, der er karakteriseret ved udvikling af nye blodkar. Blandt mange faktorer, angiogenetic, αvβ3 integrin er forbundet med invasiv, fordi integrin er stærkt udtrykt i angiogene tumor fartøjer, men er fraværende i normale væv1.
Radiolabeled receptor-bindende peptider med arginin glycin aspartat (M.H.T.) domæne, som har en høj affinitet mod αvβ3 integrin receptorer, der betragtes som lovende angiogenese imaging agenter2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. flere radioaktive lægemidler er blevet oprettet til PET og dets biologiske egenskaber er blevet valideret i forskellige dyremodeller8,9,10,11. Med hensyn til en radionuklid har 68Ga flere fordele sammenlignet med andre radioaktive isotoper. For det første, det har en høj tilgængelighed for brugerne og er økonomisk fordelagtig, fordi en cyclotron ikke er påkrævet. For det andet, 68Ga-baserede radiofarmaka producere høj rumlige opløsning sammenlignet med single photon emission beregnet tomografi (SPECT), giver mulighed for mere præcis kvantificering. Endelig kan 67.71 minutter halveringstiden af 68Ga være tilstrækkeligt til fremstilling af små peptider eller proteiner.
For at producere en stabil kompleks med 68Ga, er mange chelatorer blevet udviklet. Repræsentative chelatorer er 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic syre (Langeskov), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic syre (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic syre (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic syre (DTPA), og N, N'-di(2-hydroxybenzyl) ethylendiamin-N, N'-diacetic syre (HBED). NOTA er blevet rapporteret til at danne en meget stabil kompleks med 68Ga (log stabilitet konstant 30.98)12,13,14.
Formålet med den foreliggende undersøgelse er at give en kortfattet protokol for udviklingen af en ny radiopeptide (figur 1). Som et eksempel forbereder vi 68Ga-mærket M.H.T.-peptider og nuværende metoder til biologisk evaluering af disse analoger i en xenograft model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og udnyttelse af forskning dyr under protokoller godkendt af Korea Institute af radiologiske og medicinske videnskaber dyr undersøgelser udvalget. Alle reagenser og opløsningsmidler var købt og anvendes uden yderligere rensning. NOTA-M.H.T.-peptider var tilberedt efter litteratur metoder15.
Forsigtig: 68Ga udsender både positron og gamma stråler. Alle forsøgene, herunder direkte eller indirekte kontakt med radioaktive stoffer, skal varetages af uddannet og tilladt serviceteknikere. Når du håndterer radioaktive materialer, bør korrekt værnemidler, afskærmning, stråling dosimeter badge og ringe, og en undersøgelse meter anvendes.
1. radiolabeling M.H.T.-peptider med 68GaCl3
Bemærk: 68Ga (t1/2 = 68 min., β+ = 89%, og EF = 11%) blev fremstillet fra 68Ga /68Ge generator.
- Elueres 68GaCl3 fra generator med 4 mL 0,05 M HCL.
- Rense med nitrogen gas ved 80 ° C i 30 min tørre 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) i et 5 mL prøveglas.
- Tilføje en opløsning af M.H.T.-peptid (100 µg) i 1 M natriumacetat (100 µL, pH 5-6) til reaktion hætteglasset indeholdende 68GaCl3 fra trin 1.2.
- Varme reaktionsblanding ved 80 ° C i 5 min. Derefter kan du køle det ned til stuetemperatur.
- Rense den rå vare med high-performance væskekromatografi (HPLC). Brug de følgende system: en C-18 kolonne, en flow-hastighed på 0,5 mL/min., en gradient skråning af acetonitril af 1.17%/min (5-40% i 30 min), og eluering komponenter: A = 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i acetonitril, B = 0,1% TFA i vand.
Bemærk: HPLC er udstyret med en fotodiode array detektor og en radioaktivitet detektor. 68Ga-M.H.T.-peptid blev indsamlet på en retentionstid for 12,5 min (figur 2). - Rense den resulterende 68Ga-M.H.T.-peptid ved hjælp af en fast fase udvindingssystem.
- Passere gennem en C18 omvendt-fase patron og vask med 2 mL saltvand.
- Elueres 68Ga-M.H.T.-peptid med 0,7 mL 95% ethanol. Fjerne opløsningsmiddel ved 80 ° C under nitrogen gas i 20 min. og rekonstruere med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) før brug.
- Filtrer radiolabeled produktet gennem et 0,22 µm sterile filter og formulere i 1 mL sterilt saltvand løsning.
- Tjek den radiokemiske udbytte af radio-tyndtlagskromatografi (TLC).
- Spot 1 µL på en instant tyndt lag kromatografi plade (ITLC, 10 cm i længden). Udvikle pladen i et kammer med udviklingsvæske (vandig 0,1 M citronsyre, pH 5,0) indtil 9 cm væk fra stedet.
Bemærk: Opbevaring faktoren for 68Ga-M.H.T.-peptid er 0 og fastholdelse faktor for ureageret 68Ga3 + er 1.
- Spot 1 µL på en instant tyndt lag kromatografi plade (ITLC, 10 cm i længden). Udvikle pladen i et kammer med udviklingsvæske (vandig 0,1 M citronsyre, pH 5,0) indtil 9 cm væk fra stedet.
- Beregne den endelige specifikke aktivitet fra forholdet mellem radioaktivitet svarende til den ikke-radioaktivitet som MBq/nmol.
Bemærk: Efter injektion af 100 µL af de formulerede 68Ga-M.H.T.-peptid til HPLC, mængden af ikke-radioaktive komponent var beregnet fra den standard kalibreringskurve ved hjælp af ikke-radioaktive Ga-M.H.T.-peptid.
2. in Vitro cellulære optagelse
Bemærk: Uppsala 87 maligne gliom (U87MG) menneskers glioblastom celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medier (DMEM), suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin. Celler blev dyrket i 150 mm retter ved 37 ° C i en fugtig atmosfære i 5% CO2. Celler blev høstet eller delt af trypsinization: 0,25% (w/v) trypsin og 0,02% (w/v) ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS ved 37 ° C i 3-5 min.
- Seed U87MG celler i 6-godt plader med en tæthed på 1 x 106 celler/brønd.
- Inkuber celler med 68Ga-M.H.T.-peptid (111 kBq) ved 37 ° C i 30, 60, 90 og 120 min. Forbered prøver i tre eksemplarer.
- Vaske celler 2 x med 2 mL PBS og høst af trypsinization. Bruge 0,25% (w/v) trypsin og 0,02% (w/v) ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS ved 37 ° C i 3-5 min.
- Indsamle cellesuspension (500 µL) og foranstaltning i en γ-counter.
- Beregn procent optagelsen af sammensat af celler ved % (tæller i celler/total tæller).
3. in Vitro Serum stabilitet
- Tilsæt 500 µL af frisklavede mus serum, 500 µL humant serum og 500 µL af PBS. Inkuber blanding ved 37 ° C i 2 timer.
- Evaluering af ITLC på de angivne tidsintervaller (30, 60, 90 og 120 min). Spot 1-2 µL alikvot af blandingen til ITLC pladen (mobil fase: 0.1 M citronsyre). Udvikle pladen som i trin 1.7.
Bemærk: 68Ga3 + er forventes at flytte med væskefronten, mens den mærkede sammensatte vil forblive på oprindelse.
4. bestemmelse af lipofile
- Tilføje 68Ga-M.H.T.-peptid (3,7 MBq, 3,7 µL) oktanol-PBS-systemet (1:1, v/v, samlede 1 mL).
- Bland hætteglas kraftigt i 5 min. ved stuetemperatur, og der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Tage 100 µL prøver fra hvert lag og måle radioaktivitet med en γ-counter. Rapporterede log P-værdi er baseret på gennemsnittet af tre prøver.
5. tumor Model
Bemærk: BALB/c nøgen mus (6-8 uger gamle, kvinde, n = 23) blev brugt til denne undersøgelse. Musene blev efterfølgende anvendes til PET undersøgelser (n = 3) og biodistributionen (n = 20) når tumor diskenheder nået 200-300 mm3 (1-2 uger efter implantation).
- Indlæse tumorceller i 28 G, 1/2 tommer insulin sprøjter.
- Injicere U87MG celler (5 x 106) i 100 µL af PBS i regionen venstre arm.
- Bedøver mus med 2% isofluran i ilt gas under celle indsprøjtning.
- Sikre, at musen har været bedøvede af tabet af den pedal tilbagetrækning refleks følgende klemme med pincet mellem tæer på højre bagben foden. Efterlad ikke et dyr uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
6. in Vivo kvantificering af αvβ3 Integrin ved hjælp af PET
- Bedøver mus med 2% isofluran i ilt.
- Sikre, at musen har været bedøvede af tabet af den pedal tilbagetrækning refleks følgende klemme med pincet mellem tæer på højre bagben foden. Efterlad ikke et dyr uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
- Placere hovedet i midten af PET paafyldningsanordningen.
- Intravenøst administrere 68Ga-M.H.T.-peptid løsning (7,4 MBq, 200 µL) til xenograft musen model via hale vene i 1 minut.
- På samme tid, skal du udføre en PET-scanning i listetilstand (dynamisk scanning) i 150 min.
Bemærk: PET rådata blev rekonstrueret af en bruger-defineret tidsramme (dvs.hvert 30 min). Efter PET-scanning, en mikro-beregnet tomografi (CT) scan (50 kVp af X-ray, 0,16 mA) blev gennemført for forvrængning korrektion.
7. Ex Vivo Biodistribution
- Injicere 68Ga-M.H.T.-peptid (0,37 MBq, 200 µL) i halen vene af xenograft musemodel. Bedøver mus med 2% isofluran i ilt gas under injektioner.
Bemærk: BALB/c nøgen mus, som beskrevet i afsnit 5, blev opdelt i fire grupper og ofret på forskellige tidspunkter (n = 5 pr. gruppe). - Vågne mus umiddelbart efter indgift af 68Ga-M.H.T.-peptid og ofrer dem på 30, 60, 90 og 120 min postinjection med kuldioxid eutanasi.
Bemærk: Væv af interesse blev pakket ud. Udvalgte mål var den blod, muskel hjerte, lunge, lever, milt, mave, tarmen, nyrer, ben og tumor. - Vejer væv og måle radioaktivitet med en γ-counter.
Bemærk: Resultater blev udtrykt som den procentdel injicerede dosis pr. gram væv (% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chelat for 68GaCl3 med NOTA-M.H.T.-peptid var ligetil, og den radiolabeling udbytte var 99%. Reaktion urenheder blev fjernet som vist i figur 2. 68Ga-M.H.T.-peptid radiokemiske renhed var større end 99%, og specifikke aktivitet i slutningen af syntesen var 90-130 MBq/nmol (figur 3).
I celle optrækket værdier for 68Ga-M.H.T.-peptid blev 1,49%, 0,85%, 0,36% og 0,39% på 30, 60, 90 og 120 min, henholdsvis. Serum stabilitet viste, at 68Ga-M.H.T.-peptid forblev næsten intakt efter 2 h inkubation med menneskelige eller mus serum samt PBS (> 92% stabilitet på 2 h). Fordelingskoefficient (log P) var 2,96, som angiver høje lipofile. PET viste en indledende høj optagelse i de vigtige organer, herunder lever, nyre, hjerte, muskel og tumor. Men i den sene periode (90-150 min) tumor regionen var klart visualiseret. Tumor til muskel forholdet 90 min. var 17.57 og forblev uændret, der angiver kinetic stabilitet. Ex vivo biodistribution viste, at den akkumulerede radioaktivitet i svulsten var 6.19, 4.96, 4.44 og 4.39 (% ID/g) på 30, 60, 90 og 120 min, henholdsvis. Resultater af ex vivo -eksperimentet var i overensstemmelse med i vivo PET Fund (figur 4).
Figur 1 : Flow diagram af de eksperimentelle procedurer. Denne figur viser en skematisk oversigt over udviklingen af radioaktivt lægemiddel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Oprensning af 68Ga-M.H.T.-peptid ved HPLC. Blå er radioaktiviteten signal og sort er ultraviolet (UV) signal. UV bølgelængde er 314 nm. X-aksen er tid og y-aksen er absorbans enhed (AU). 68Ga-M.H.T.-peptid har 12,4 min for retentionstid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Struktur af 68Ga-M.H.T.-peptid og dens radiokemiske renhed. ITLC af 68Ga-M.H.T.-peptid viste høj radiokemiske renhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : PET imaging (øverste) og ex vivo Biodistribution data for 68 Ga-M.H.T.-peptid (lavere). PET data blev udtrykt på SUV skala fra 0 til 5. Biodistribution data vist er den gennemsnit ± standardafvigelse fra fem mus på hvert tidspunkt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nuværende undersøgelse, vi indført en protokol for at forberede en radiopeptide rettet mod αvβ3 integrin og biologisk evaluering. Udvikling af traditionelle lægemidler indebærer en kompliceret procedure. Det kræver en stor mængde af referencemateriale og en forholdsvis lang evaluering tid. Selvom den foreslåede metodologi ikke kan erstatte den sarte evalueringsprocessen, kan dette system anvendes til screening. Denne foreslåede system ville betydeligt reducerer tid og omkostninger.
I det seneste årti, har mange radiolabeled M.H.T.-peptider blevet grundigt undersøgt som radiotracers for imaging tumorer16. For at få lovende radioaktive lægemidler til kliniske forsøg, kan der ydes systemisk tilgange til udvikling af lægemidler. Radiokemiske gennemførlighed, høj selektivitet-affinitet til target, metaboliske stabilitet og ordentlig farmakokinetik er fire store bekymringer. Til en rutinemæssig undersøgelse, PET sikrer en rimelig radiokemiske udbytte pålideligheden af de radioaktive lægemiddel. Spørgsmål af høj affinitet (> nM) og selektivitet (> 100 x) til målet protein er også tilfreds. Farmakokinetik, kandidat PET tracer udskilles hurtigt fra ikke-målvæv og har en lang opholdstid i tumor, giver mulighed for et højt mål at reference forhold. Kandidat radioaktive lægemidler må ikke generende metabolitter i vivo der kunne øge ikke-specifik binding og give lav kontrast billeddannelse. Det er vigtigt at vurdere de omfattende karakteristika, fordi hver sigt påvirker de andre egenskaber, som ikke er uafhængige.
Radiopeptide blev indført i denne forskning har passende narkotika-lignende egenskaber. 68Ga-M.H.T.-peptid har en høj radiokemiske udbytte af 99%, metaboliske stabilitet og ordentlig lipofile. I eksperimentet i vivo radiopeptide udstillet høj selektivitet (tumor til reference ratio = 17.57), og ex vivo biodistribution data viste også signifikant tumor optagelse (op til 6.19% ID/g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en nuklear forskning og udviklingsprogram af National Research Foundation af Korea (NRF) støtten finansieres af den koreanske regering (nr. 2017M2A2A6A02019904).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
References
- Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
- Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
- Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
- Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
- Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
- Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
- Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
- Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
- Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
- Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
- Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
- Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
- Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
- Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
- Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).
