Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموعات الأكسجين المعدنية المنفصلة، polyoxometalates (POMs)، عند حد جزيء واحد باستخدام منصة إلكترونية البيولوجية المستندة إلى nanopore. وتوفر هذه الطريقة نهجا ً تكميلياً لأدوات الكيمياء التحليلية التقليدية المستخدمة في دراسة هذه الجزيئات.
Abstract
يمكن الكشف عن الجزيئات الفردية وتتميز بقياس الدرجة التي تقلل من التيار الأيوني المتدفق من خلال مسام واحد على نطاق نانومتر. الإشارة هي سمة من خصائص الجزيء الفيزيائية الكيميائية وتفاعلاتها مع المسام. نحن نثبت أن النانوبور التي شكلتها البروتين البكتيري اكسوتوكسين المكورات العنقودية أوريوس ألفا الهيموليسين (αHL) يمكن الكشف عن polyoxometalates (POMs، مجموعات الأكسجين المعدني الأنيونية)، في حد جزيء واحد. وعلاوة على ذلك، يتم قياس منتجات التحلل متعددة من 12-phosphotungstic حمض POM (PTA، H3PW12O40)في الحل في وقت واحد. تسمح حساسية جزيء واحد من طريقة nanopore لPOMs أن تتميز بتركيزات أقل بكثير مما هو مطلوب للمطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR). هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة أداة جديدة للكيميائيين لدراسة الخصائص الجزيئية للبوليوكسوميتالاتس أو غيرها من المجموعات المعدنية، لفهم أفضل العمليات الاصطناعية POM، وربما تحسين غلتهم. من الناحية الافتراضية، يمكن التحقيق في موقع ذرة معينة، أو دوران جزء في الجزيء، وحالة أكسدة المعادن مع هذه الطريقة. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية الجديدة لديها ميزة السماح لرصد في الوقت الحقيقي من الجزيئات في الحل.
Introduction
ويمكن إجراء الكشف عن الأناليت الجزيئية الحيوية على مستوى جزيء واحد باستخدام المسام النانوية وقياس التعديلات الحالية الأيونية. عادة، يتم تقسيم المسام النانوية إلى فئتين على أساس تصنيعها: البيولوجية(تجميعها ذاتيا من البروتين أو الحمض النووي اوريغامي) 1،2،3،أو الحالة الصلبة (على سبيلالمثال،المصنعة مع أدوات معالجةأشباه الموصلات) 4،5. في حين اقترح المسام النانوية ذات الحالة الصلبة على أنها أكثر قوة من الناحية المادية ويمكن استخدامها على مدى مجموعة واسعة من شروط الحل، فإن المسام النانوية البروتينية توفر حتى الآن حساسية أكبر، وأكثر مقاومة للقاذورات، وعرض نطاق ترددي أكبر، ومادة كيميائية أفضل الانتقائية، وإشارة أكبر إلى نسبة الضوضاء.
مجموعة متنوعة من قنوات الأيونات البروتينية، مثل تلك التي شكلتها المكوراتالعنقودية العضوية الانحلالية (αHL)، يمكن استخدامها للكشف عن جزيئات واحدة، بما في ذلك الأيونات (على سبيلالمثال، H+ و D+ )2،3، polynucleotides (DNA وRNA)6،7،8، الحمض النووي التالف9، الببتيدات10، البروتينات (مطوية وتكشفت)11، البوليمرات (البولي ايثيلين غليكول وغيرها)12،13 , 14، الجسيمات النانوية الذهب15،16،17،18،19، وغيرها من الجزيئات الاصطناعية20.
لقد أثبتنا مؤخرًا أن nanopore αHL يمكن أيضاً بسهولة الكشف عن المجموعات المعدنية وتوصيفها، وpolyoxometalates (POMs)، على مستوى جزيء واحد. POMs هي منفصلة nanoscale مجموعات الأكسجين المعدنية التي تم اكتشافها في 182621، ومنذ ذلك الحين ، تم تصنيع أنواع أخرى كثيرة. الأحجام المختلفة، والهياكل، والتراكيب عنصري من polyoxometalates التي تتوفر الآن أدى إلى مجموعة واسعة من الخصائص والتطبيقات بما في ذلك الكيمياء22،23، الحفز24، علوم المواد25 ،26، والبحوث الطبية الحيوية27،28،29.
توليف POM هو عملية التجميع الذاتي التي تنفذ عادة في الماء عن طريق خلط الكميات المطلوبة من الأملاح المعدنية الأحادية. وبمجرد تشكيلها، تظهر أجهزة الشراء تنوعًا كبيرًا في الأحجام والأشكال. على سبيل المثال، يتكون هيكل بوليانيون Keggin، XM12O40q- من واحد heteroatom (X) محاطة بأربعة أكسجين لتشكيل رباعي الأبعاد (س هو المسؤول). يقع الهيترواتوم مركزيا داخل قفص يتكون من 12 وحدات MO ثماني الأوثماني (حيث M = المعادن الانتقالية في حالة الأكسدة العالية)، والتي ترتبط ببعضها البعض من قبل ذرات الأكسجين المشتركة المجاورة. في حين التنغستن polyoxometalates هيكل مستقر في الظروف الحمضية، أيونات هيدروكسيد تؤدي إلى الانقسام المائي من المعادن والأكسجين (M-O) السندات30. وتسفر هذه العملية المعقدة عن فقدان وحدة فرعية واحدة أو أكثر من وحدات الأوكتانيد الثماني 6، مما يؤدي إلى تكوين أنواع أحادية الشاغرة وثلاثية الشاغرة، وفي نهاية المطاف إلى التحلل الكامل لوحدات إدارة الملوثات العضوية الثابتة. وسوف تقتصر مناقشتنا هنا على منتجات التحلل الجزئي من حمض فوسفيوالتنغستن 12 في درجة الحموضة 5.5 و 7.5.
والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مجموعات الأكسجين المعدنيالمنفصلة عند حد جزيء واحد باستخدام منصة إلكترونية بيولوجية تعتمد على النانوبور. يسمح هذا الأسلوب الكشف عن الكتل المعدنية في الحل. ويمكن التمييز بين الأنواع المتعددة في الحل بحساسية أكبر من الأساليب التحليلية التقليدية33. مع ذلك، يمكن توضيح الاختلافات الدقيقة في هيكل POM، وعند تركيزات أقل بشكل ملحوظ من تلك المطلوبة للمطياف NMR. والأهم من ذلك، يسمح هذا النهج حتى التمييز من أشكال الإيسومرية من Na8HPW9O341.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: البروتوكول أدناه خاص بنظام العلوم الحيوية الإلكترونية (EBS) Nanopatch DC. ومع ذلك، فإنه يمكن تكييفها بسهولة إلى أجهزة الفيزيولوجيا الكهربائية الأخرى المستخدمة لقياس التيار من خلال أغشية ثنائية الطبقات الدهون اللوح (معيار الدهون ثنائية الطبقة غرفة الغشاء، U-أنبوب الهندسة، سحبت microcapillaries، الخ). ويُعطى تحديد المواد التجارية ومصادرها لوصف النتائج التجريبية. ولا ينطوي هذا التحديد بأي حال من الأحوال على توصية من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا، كما أنه لا يعني ضمناً أن المواد هي أفضل المواد المتاحة.
1. الحل وإعداد Analyte
- إعداد جميع الحلول بالكهرباء مع 18 MΩ سم المياه من نظام تنقية المياه من النوع 1 لإزالة الأنواع العضوية النزرة ومن ثم تصفية جميع الحلول بالكهرباء من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر مباشرة قبل تسجيلات قناة أيون.
ملاحظة: نوعية المياه هو عامل حاسم لاستقرار وطول العمر من نظام nanopore الغشاء. - النوع البري αHL.
- اتبع احتياطات MSDS عند التعامل مع البروتين التوكسين αHL.
- مزيج من نوع الليوفيل البرية أحادية النيوريس Α-الهيموليسين (α HL) مسحوق مع 18 MΩ-cm الماء في 1 ملغ / مل. توزيع 10 إلى 30 ميكرولتر aliquots من العينة في أنابيب الطرد المركزي المبردة آمنة، تجميد فلاش بسرعة في النيتروجين السائل ومن ثم تخزينها في -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، استخدم تنقية preptameric preptameric αHL31.
- حل الدهون 1,2-ديفيتانويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليوكولين (DPhyPC) إلى 0.2 ملغ / مل في ن-ديكان في قارورة الزجاج 4 مل تل مع غطاء بولي تترافلوروإيثيلين تفلون المغلفة. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية للاستخدام المتكرر لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد حلول حمض فوسفيوالتنغستن.
- اتبع الاحتياطات MSDS عند التعامل مع مسحوق حمض فوسفيوالتنغستن وإعداد 2 مللي متر محلول مخزون حمض فوسفوتنجستيك عن طريق حل 57.6 ملغ من H3PW12O40 في 10 مل من 1 M NaCl و 10 MM NaH2PO4 الحل، الذي يشكل حل الأسهم.
- خذ 5 مل من هذا الحل واضبط الـ pH إلى 5.5 مع 3 M NaOH. ضبط الحموضة من 5 مل أخرى من حل الأسهم إلى 7.5 مع 3 M هيدروكسيد الصوديوم.
ملاحظة: في درجة الحموضة 5.5، 12-حمض فوسفيوالتنغستن (PTA، H3PW12O40)تتحلل في المقام الأول إلى أنيون أحادية الشاغرة [PW11O39]7-.
2. اختبار خلية الجمعية
- تجميع خلية الاختبار حسب إرشادات الشركة المصنعة.
- نقع واحد Ag / AgCl الأسلاك في التبييض (هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 10 دقائق بعد abrading مع 600 ورقة الرمال حصى. وضع القطب الكهربائي داخل غشاء نانوبور الكوارتز (QNM).
- ضع قطب اسطواني من نوع AgCl بيليه مدمج في سلك فضي خارج QNM.
- بمجرد إعداد خلية الاختبار، قم بتشغيل برنامج الإمداد بالطاقة والحصول على البيانات. تأكد من أن القراءة الحالية DC 0 pA في غياب الحل في خلية الاختبار.
- استخدم حقنة متصلة بخلية الاختبار عبر خط سائل لإضافة محلول بالكهرباء المخزنة مؤقتًا فوق وجه QNM ولضمان أن التيار الأيوني يشبع مكبر الصوت. إذا لم يكن كذلك، قد يتم انسداد QNM. تطبيق الجهد البوب (± 1 V) و / أو ضغط أكبر من 300 ملم زئبق لمسحها. إذا كان ذلك يعمل، والحد من الجهد والضغط.
3. تشكيل ثنائي الطبقات الدهون
- ملء الحل في خلية الاختبار بحيث يكون مستوى الحل أعلى بكثير من وجه QNM. ثم خفض مستوى الحل عن طريق الحقنة إلى أسفل الوجه، بحيث ينخفض الحالي إلى الصفر.
- تراجع 10 ميكروغرام تلميح ماصة في قارورة الدهون. ادفع على الطرف الخلفي من طرف الماصة واضغط عليه على جانب القارورة لإزالة جميع الدهون المرئية.
- المس طرف الماصات على واجهة الهواء والماء للحل في خلية الاختبار عندما يكون مستوى الحل أعلى من وجه QNM وانتظر دقيقتين إلى خمس دقائق حتى تنتشر الدهون بشكل موحد.
- خفض مستوى الحل ببطء تحت وجه QNM حتى تشبع الحالي، ومن ثم رفع مستوى الحل ببطء الماضي وجه QNM لتشكيل غشاء ثنائي الطبقات الدهون.
- مرة واحدة يظهر ثنائي الطبقة لتشكيل(أي، عندما يذهب التيار إلى الصفر)، حاول ظهرت عدة مرات عن طريق زيادة الضغط وضمان عدم انسداد QNM. لإصلاح غشاء ثنائي الطبقة الدهون، خفض مستوى الحل تحت وجه QNM ورفعه ببطء.
- إذا كان غشاء ثنائي الطبقة الدهون لم تشكل المرة الأولى، وانخفاض الحل تحت الوجه ورفعه مرة أخرى. إذا كان لا يشكل بعد 3 تجارب, إضافة المزيد من الدهون كما هو موضح في 3.2 و 3.3.
- بعد تشكيل غشاء، تعيين الإزاحة الحالية إلى الصفر عندما تكون الإمكانات المطبقة صفر.
4. α HLتشكيل المسام
- إضافة 2.5 نانوغرام من عينة البروتين السباعي ة المنقّبة αHL (أو 250 نانوميكرو من αHL الأحادي) إلى خلية الاختبار (حجم - 200 ميكرولتر) لتمكين تكوين القناة.
- زيادة الضغط على ثنائيالطبقة مع حقنة الغاز ضيق (الشكل1)بعد تشكيل طبقة ثنائية، لتوسيع الغشاء من QNM، وتسهيل الإدراج nanopore. رفع الضغط الخلفي المطبق عادة بين 40 إلى 200 مم زئبق، اعتمادا على كل QNM.
ملاحظة: برنامج EBS لديه ميزة الإدراج الآلي الذي ينطبق على التحيز أعلى (عادة 200 إلى 400 ملفي) للحث على تشكيل المسام ومن ثم يقلل تلقائيا الجهد المطلوب إلى التحيز القياس مرة واحدة تشكل قناة واحدة. - بعد أشكال nanopore، تقليل الضغط الخلفي إلى حوالي 1/2 من ضغط الإدراج. إذا لوحظت قنوات متعددة، إزالتها عن طريق الحد بشكل كبير من الضغط.
5. تقسيم الكتلة المعدنية في نانوبور
- لحساب الاختلالات الكهربائي، تعيين الجهد إزاحة العاصمة بحيث عندما يتم تعيين الإمكانات المطبقة إلى الصفر لا يوجد تيار قياس.
- قبل إضافة عينة POM، قم بإجراء تجربة تحكم لضمان عدم وجود ملوثات (علىسبيلالمثال، تتبع POMs من تجربة سابقة) في الخزان. وعلى وجه التحديد، الحصول على أثر حالي أيوني تحت إمكانات تطبيقية قدرها +120 ملي في و-120 ملي في غياب أي تدابير عمل للتحقق من عدم وجود حواجز تلقائية حالية.
ملاحظة: بسبب البنية غير المتماثلة لقناةαHL (الشكل 1)، فإن ماغنيوت من التيار الأيوني سوف تختلف عن الإمكانات الإيجابية والسلبية المطبقة. نسبة التيار المقاس فوق هذا الجهد التطبيقي يدل على اتجاه نانوبور ΑHL في الغشاء. - أضف عينة POM عن طريق مسح الخزان بمحلول الكتلة المعدنية بتركيز 1 إلى 5 مليمتر. بدلاً من ذلك، قم بتحميل العينة في الشعرية قبل تجميع الخلية لدراسة تقسيم POMs إلى الطرف الآخر من قناة αHL.
- تسجيل التيار الأيوني باستخدام برنامج الشركة المصنعة للكشف عن الحصار الحالي العابر الناجم عن تقسيم POMs الفردية في nanopore. تقدير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للجزيء من عمق الحصار الحالي الأيوني، وتواتر الحدث، وتوزيع وقت الإقامة للحصار.
6. تسجيلات القنوات الأيونية وتحليل البيانات
- الحصول على قياسات السلاسل الزمنية الحالية الأيونية باستخدام مقاومة عالية، مكبر للصوت منخفضة الضوضاء ونظام الحصول على البيانات. إجراء القياسات في الجهد التطبيقي من -120 mV (نسبة إلى جانب رابطة الدول المستقلة قناة) لكل درجة الحموضة.
- تطبيق منخفضة تمرير 100 كيلوهرتز 8 القطب بيسيل مرشح للإشارة، والتي يتم رقمنت في وقت لاحق في 500 كيلو هرتز (أي2 مللي ثانية / نقطة). استخراج الأحداث من السلاسل الزمنية وتحليل الأحداث باستخدام خوارزمية ADEPT في حزمة برامج موزاييك 32،33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على مدى العقدين الماضيين، تم إثبات المسام نانومتر البروتين المرتبطة بالغشاء كأجهزة استشعار متعددة الاستخدامات أحادية الجزيء. القياسات المستندة إلى Nanopore هي مباشرة نسبيا لتنفيذ. يتم فصل غرفتين مليئة محلول الكهارل بواسطة nanopore جزءا لا يتجزأ من غشاء الدهون العازلة كهربائيا. أما مكبر للصوت التصحيح المشبك أو إمدادات الطاقة الخارجية يوفر إمكانات كهرباء عبر nanopore عبر أقطاب Ag /AgCl مغمورة في خزانات الكهارل. يدفع الحقل الكهربائي الجسيمات المشحونة الفردية إلى المسام، والتي تنتج تخفيضات عابرة في التيار الأيوني التي تعتمد على حجم وشكل وشحن الجسيمات. برنامج كمبيوتر يتحكم في الجهد التطبيقي ويراقب، في الوقت الحقيقي، الحصار الحالي الأيونية الناجمة عن الجزيئات تقسيم عكسها في المسام. يتم تضخيم التيار وتحويلها إلى الجهد مع منخفضة الضوضاء، ومقاومة عالية تأثير الحقل الترانزستور ورقمية باستخدام بطاقة الحصول على البيانات.
هنا، ونحن نقدم إجراء عام للكشف عن polyoxometalates مع nanopore البيولوجية. كما هو الحال في الشكل 2، قبل إضافة أجهزة الشراء القناة دون عائق لديها متوسط قناة مفتوحة الحالية من ~ 100 pA في إمكانات تطبيقية من -120 mV. وينتج عن إضافة تدابير الشراء حواجز عابرة ويخفض التيار الأيوني بنحو 80 في المائة. وكما هو متوقع، ونظراً لأن هذه الجسيمات مشحونة سلباً، لا تُلاحظ الحصارات عندما يتم عكس قطبية الإمكانات المطبقة. لاحظ أنه إذا لم تتفاعل POMs مع جدار المسام، فإنها تنتشر من خلال المسام في حوالي 100 ns، وهو بعيد جدا ً قصيرة جداً ليتم الكشف عنها مع مكبر للصوت التصحيح المشبك التقليدية. وهكذا، فإن معظم الوقت الذي يقضيه جسيم معين في المسام هو نتيجة مباشرة للتفاعل بين الجسيمات والمسام. يتم تعريف مدة حدث الحصار الحالي الأيوني ة على أنه وقت الإقامة، تاو (ث).
لتوضيح فائدة هذه الطريقة، نناقش استخدام nanopore αHL لرصد تحلل حمض فوسفيوالتنغستن (PTA، H3PW12O40)في درجة الحموضة 5.5 ودرجة الحموضة 7.5. ويمكن ملاحظة هذا التحلل مع قياسات NMR P 31،ولكن التركيز المطلوب هو 2 mM في حين أن قياسات nanopore تحتاج إلى أقل من 30 ميكرومتر، وذلك بسبب حساسية قياس nanopore. في درجة الحموضة 5.5، [PW11O39]7- هو الأنواع السائدة30.
يتم إجراء تحليل البيانات عن طريق حساب الرسم البياني لنسبة عمق الحصار النسبي(أي،<i>/lt;io>، حيث <i> هو متوسط التيار مع POM في المسام و <io > هو متوسط قناة مفتوحة الحالية). يعرض الرسم البياني لمتوسط نسب عمق الحصار الحالية عند -120 مل فولت والرقم الهيدروجيني 5.5 ذروة طفيفة في <i><i> 0.06 والذروة الرئيسية في /<i > 0.16 (الشكل 3 ،الأخضر). ونفترض أن هذه القمم تتوافق مع [P2W5O23]6- و [PW11O39]7-على التوالي، استناداً إلى 31P NMR. 31 وتشير دراسات P NMR إلى أن زيادة درجة الحموضة تغير التركيز النسبي لهذين النوعين، وهذا ما يؤكده التغير في منطقة القمتين المبينة في الشكل3.
عندما يتم تصنيف محلول POM إلى الرقم الهيدروجيني 7.5 خارجالموقع، ينخفض تركيز POM الكلي بسبب التدهور الجزئي للنوعين الرئيسيين إلى الأملاح غير العضوية (أي الفوسفات الحر، HxPO4-3+x وtungstate، WO42- الأيونات). كما يظهر الرسم البياني لنسبة عمق الحصار النسبي قمتين رئيسيتين (الشكل3، البرتقالي) ، ولكن مع أحداث أقل من 20 ضعفًا (مما يشير إلى أن إجمالي تركيز POM عند الرقم الهيدروجيني 7.5 أقل بحوالي 20 ضعفًا من التركيز عند الرقم الهيدروجيني 5.5، إذا كان كفاءة التقاط nanopore لPOMs هي نفسها في قيمتين للحصول على حموضة). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه عند درجة الحموضة 7.5 وما يزيد، لم يتم الكشف عن الأنواع POM التي لوحظت هنا في طيف NMR 31P بسبب تركيزها المنخفض الناجم عن انفصالها في أيونات الفوسفات والتونغستات.
يتم تحديد وقت إقامة كل حدث في المسام من خلال مدة الحصار الحالي الأيوني الفردي. توزيع أوقات الإقامة يوفر نظرة ثاقبة في الأنواع المختلفة الموجودة. وقد تبين في وقت سابق أنه بالنسبة للحصار الناجم عن البوليمرات مختلفة الحجم من بولي (الإيثيلين غليكول)، يتم وصف توزيع وقت الإقامة لكل حجم من هذا البوليمر بشكل جيد من قبل أسية واحدة. هذه النتيجة تشير إلى أن التفاعل من هذا البوليمر هو رد فعل كيميائي بسيط عكسها12،13،20.
ويبين الشكل 4 أن توزيعات وقت الإقامة للقمتين كانت متباينة بشكل جيد عند الرقمين الهيدروجينيين 5.5 و7.5. هناك سمتان واضحتان. أولاً، في جميع الظروف، يلزم وجود العديد من الأسيات لتناسب كل توزيع، مما يشير إلى وجود اختلافات في نقاط الشراء داخل كل نوع. ثانياً، أوقات الإقامة في مسام الكمية هي أقصر بكثير في درجة الحموضة 7.5 مقارنة مع تلك التي في درجة الحموضة 5.5، مما يشير إلى ضعف التفاعل بين المسام وPOMs. وقد تبين سابقا أن تغيير في الرقم الهيدروجيني يغير العدد النسبي للرسوم الثابتة في أو بالقرب من التجويف قناة ΑHL. هذه التغييرات سوف تغير مباشرة التفاعلات مع تقسيم POMs داخل المسام وبالتالي تعديل أوقات إقامتهم34،35.
الشكل 1: الرسم التخطيطي للإعداد التجريبي. طريقة للتوصيف القائم على nanopore من جزيئات polyoxometalate الفردية. نانوبور البروتين الذي يجمع نفسه في 4 نانومتر سميكة غشاء ثنائي الطبقات الدهون هو استحم من قبل حلول بالكهرباء المائية في خزان الشعرية الزجاجية وأكبر. يتم تطبيق الضغط على الشعرية الزجاجية مع حقنة الغاز ضيق للمساعدة في دمج nanopore. يتم تطبيق V المحتملة عبر الغشاء مع زوج المتطابقة من أقطاب Ag / AgCl ويقود تيار الأيونية (علىسبيلالمثال، Na+ وCl-)من خلال المسام. يتم تحويل التيار إلى الجهد مع مكبر للصوت مقاومة عالية، رقمنة مع التناظرية لتحويل الرقمية (ADC) وتخزينها على جهاز كمبيوتر. برامج الكمبيوتر يتحكم في الإمكانات المطبقة من خلال محول رقمي إلى التناظرية (DAC) ويراقب، في الوقت الحقيقي، الحصار الحالي العابر الناجم ة عن جزيئات واحدة أن تقسيم في المسام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكشف القائم على النانوبور للجسيمات النانوية المعدنية الفردية. صورة توضيحية لآثار سلسلة الوقت الحالي الأيونية التي تحدث قبل وبعد إضافة حل POM إلى جهاز nanopore. يؤدي تقسيم الملوثات العضوية الثابتة الفردية الأنيونية في المسام إلى تخفيضات عابرة في التيار المسامي المفتوح، <io>. (يمين) حدث نموذجي، يوضح متوسط تيار الحصار (<i>) ووقت الإقامة (t) للجسيمات في المسام. وكانت الإمكانات المطبقة -120 ملفولت، والحلول تحتوي على 1 مليون دولار من كل ة، و10 مليون متر نسمة NaH2PO4 عند درجة الحموضة 5.5. كما تحتوي مقصورة رابطة الدول المستقلة على 30 درجة مئوية من حمض فوسفيوالتنغستن. توفر نسبة عمق الحصار الحالية (<i>/lt;i>) وأوقات الإقامة (t) معلومات حول أنواع POM الموجودة في الحل. في ظل الظروف التي استخدمناها هنا، لا تقوم قناة αHL ببوابة (إغلاق تلقائي) عندما لا تكون POMs موجودة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الرسوم البيانية لنسبة عمق الحصار الحالية عند الرقم الهيدروجيني 5.5 و7.5. الرسوم البيانية لنسبة عمق الحصار الحالي الأيونية الناجمة عن POMعند درجة الحموضة 5.5 (الأخضر) و 7.5 (برتقالي)مع V المحتملة المطبقة = -120 ملفولت. القمتين الموجودتين في كل قيمة من قيمة الحموضة تتوافقان مع الأنواع المعروفة السائدة POM في الحل في ظل هذه الظروف. نسب عمق الحصار الحالية من 0 و 1 تتوافق مع المسام المسدودة تماما ومفتوحة، على التوالي. تم إنشاء الرسوم البيانية بعرض سلة 0.001 وتطبيعها إلى عدد/ق عن طريق القسمة على وقت الحصول على البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توزيع وقت الإقامة وملاءمة العديد من الأسيات. توزيع أوقات الإقامة للحصار الحالي الناجم عن POM الناجمعن النوعين الرئيسيين (القمتين 1 و2 في الشكل4) التي لوحظت عند الرقم ين4.5 و7.5 في قطعة أرض شبه خشبية. بالنسبة لكلا النوعين، تكون أوقات الإقامة أقصر بشكل ملحوظ في قيمة الحموضة الأعلى، مما يشير إلى تغير التفاعل بين المسام وPOMs. الخطوط الصلبة تناسب نموذج خليط الأسي إلى البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرًا لشحنتها الأنيونية، من المرجح أن ترتبط POMs بالكاتيونات المضادة العضوية من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ولذلك، من المهم تحديد ظروف الحل المناسبة وبيئات الكهارل المناسبة (وخاصة الموجبة في الحل) لتجنب تشكيل معقدة مع POMs. مطلوب عناية خاصة في اختيار المخزن المؤقت. على سبيل المثال، معدل التقاط POMs مع تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان وحامض الستريك الحلول المخزنة بها هو أقل بكثير من ذلك في محلول الفوسفات المخزنة، على الأرجح لأن أي من المخازن المؤقتة الأولى اثنين تشكل مجمع مع POM التي لا تتفاعل بقوة مع nanopore. وعلاوة على ذلك، تم استخدام الكهارل NaCl عمدا بدلا من KCl (وكذلك المعادن القلوية الأخرى) لتجنب هطول الأمطار من [PW11O39]7- بواسطة K+ .
ومن الأهمية الحاسمة للقياس الدقيق لتوزيعات وقت الإقامة القدرة على قياس التيار في عرض نطاق ترددي مرتفع بما فيه الكفاية. على سبيل المثال، مع أوقات الإقامة الموزعة بشكل كبير هناك المزيد من الحصار مع فترات إقامة قصيرة من فترات الإقامة الطويلة، ويتم تحقيق تقدير دقيق لتوزيعات وقت الإقامة بشكل أفضل من خلال جمع قدر كبير من البيانات(أي، الحصول عليه في ارتفاع كبير مثل عرض النطاق الترددي يسمح السعة الكهربائية للنظام). لتحقيق هذا الشرط في التحليل الطيفي nanopore، ينبغي تقليل سعة النظام (الغشاء والسعة الضالة). يتم تقليل السعة الضالة عن طريق تقليل طول جميع الكابلات المتصلة واستخدام الاتصالات الكهربائية عالية الجودة. يتم تقليل سعة الغشاء عن طريق تقليل المساحة السطحية للطبقة المزدوجة، وزيادة سمك المواد الداعمة (أي الكوارتز، والبولي تترافلوروإيثيلين، وما إلىذلك)، وتقليل مساحة المواد الداعمة المكشوفة إلى الكهارل. في الممارسة العملية، فإن السعة الضالة لأداة نموذجية (2 pF) سوف تحد من الضوضاء للأغشية - 1 ميكرون إلى 5 ميكرون في القطر. وهذا يشكل قيد الأسلوب. على سبيل المثال، يمكن أن يكون الكشف عن جزيئات واحدة صغيرة ومشحونة للغاية تحديا بسبب أوقات إقامتهم القصيرة نسبيا.
الآلية التي يمكن الضغط السيطرة على إدخال القناة غير مفهومة تماما. microcapillaries الكوارتز لديها قطر صغير جدا الذي يتكون الغشاء. تطبيق الضغط سوف يسبب الغشاء لانتفاخ (وبالتالي زيادة مساحة سطح الغشاء) وربما رقيقة الغشاء. كلا الآثار من شأنها أن تزيد من معدل القنوات التي سوف تشكل في الغشاء. عندما تتشكل قناة واحدة تلقائيًا، قم بتقليل الضغط لمنع إدخال قنوات إضافية. ولا يلزم إزالة αHL غير المدرجة من المرحلة المائية السائبة إذا كان تركيز αHL منخفضاً بما فيه الكفاية.
وتدرس حاليا هياكل وشحنات العضلة المتعددة الأكسدة باستخدام تقنيات الكيمياء التحليلية التقليدية، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي، والأشعة فوق البنفسجية المرئية، والأشعة تحت الحمراء، والتحليل الطيفي للأشعة السينية، والقياس الطيفي الكتلي، وانعراج الأشعة السينية. ونتوقع أن تكمل قياسات النانوبور توصيف هذه الخصائص الفيزيائية وغيرها من الخصائص الفيزيائية للملوثات العضوية الثابتة، فضلا عن دراسة المواصفات عند تركيز منخفض، مما سيساعد على فهم المسار التركيبي للبوليوكسوميتاليس بشكل أفضل تشكيل. كما تبين في وقت سابق أن المسام αHL يمكن أن تميز حتى بين 2 أيزومرات من شكل Keggin ثلاثي الشاغرة Na8HPW9O3430.
وباختصار، لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام nanopore البروتين المرتبط بالغشاء للكشف عن وتوصيف مجموعات أكسيد التنغستن المعدنية (heteropolytungstates) في الحل باستخدام قياس كهربائي بسيط عالي الدقة. تسمح الحساسية التي يوفرها هذا النهج الجديد بتتبع الاختلافات الدقيقة في بنية POM التي تنشأ في قيم درجة الحموضة المختلفة بتركيزات أقل بكثير (> 70 ضعفًا) من المطلوب للأساليب التقليدية مثل NMR الطيفي. ونظراً لقدرة الكشف عن الجسيمات الواحدة للجراثيم النانوية، يمكن جعل الحد الفعلي للكشف في الطريقة أقل بكثير عن طريق قياس التيار لفترات أطول (مقاييس معدل الالتقاط بالتناسب مع تركيز POM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدعم المالي من المنظمة الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية للحصول على زمالة ما بعد الدكتوراه (إلى J.E.) ومنحة من المعهد الوطني للصحة البشرية (إلى J.J.K.). نحن نقدر مساعدة الأستاذين جينغيو جو وسيرجي كالاتشيكوف (جامعة كولومبيا) لتوفير heptameric αHL، وللمناقشات الملهمة مع البروفيسور جوزيف راينر (جامعة فرجينيا كومنولث).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
- Dekker, C.
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F.
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
