Summary
Her præsenterer vi en protokol til at detektere diskrete metal oxygen klynger, polyoxometalater (POMs), ved det enkelte molekyle grænse ved hjælp af en biologisk nanopore-baseret elektronisk platform. Metoden giver en komplementær tilgang til traditionelle analytiske kemi-værktøjer, der anvendes i studiet af disse molekyler.
Abstract
Individuelle molekyler kan påvises og karakteriseres ved at måle graden, hvormed de reducerer ionstrømmen flyder gennem en enkelt nanometer-skala pore. Signalet er karakteristisk for molekylets fysisk-kemiske egenskaber og dets interaktioner med pore. Vi viser, at opiekunka dannet af bakteriel protein exotoxin Staphylococcus aureus Alpha hemolysin (αhl) kan detektere polyoxometalater (Poms, anioniske metal ilt klynger), ved den enkelte molekyle grænse. Desuden måles flere nedbrydningsprodukter af 12-phosphotungstisk syre POM (PTA, H3PW12O40) i opløsning samtidig. Det enkelte molekyle følsomhed af opiekunka metode gør det muligt for Poms at være karakteriseret ved betydeligt lavere koncentrationer end krævet for nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Denne teknik kan tjene som et nyt værktøj for kemikere til at studere de molekylære egenskaber af polyoxometalater eller andre metalliske klynger, for bedre at forstå POM syntetiske processer, og eventuelt forbedre deres udbytte. Hypotetisk, placeringen af et givet Atom, eller rotation af et fragment i molekylet, og metal oxidation tilstand kunne undersøges med denne metode. Hertil kommer, at denne nye teknik har den fordel, at tillade real-time overvågning af molekyler i opløsning.
Introduction
Påvisning af Biomolekylær analytter ved det enkelte molekyle niveau kan udføres ved hjælp af nanopores og måling af Ioniske aktuelle modulationer. Typisk er nanopores inddelt i to kategorier baseret på deres fabrikation: biologisk (selv samlet fra protein eller DNA-origami)1,2,3eller Solid-State (f. eks.fremstillet med halvleder forarbejdnings værktøj)4,5. Mens solid-state nanopores blev foreslået som potentielt mere fysisk robuste og kan anvendes over en bred vifte af opløsning betingelser, protein nanopores hidtil tilbyde større følsomhed, mere modstandsdygtighed over for fouling, større båndbredde, bedre kemiske og et større signal til støjforhold.
En række protein Ionkanaler, såsom den, der dannes af Staphylococcus aureus α-hemolysin (αhl), kan bruges til at detektere enkelte molekyler, herunder ioner (f. eks.H+ og D+)2,3, polynucleotides (DNA og RNA)6,7,8, beskadigede DNA9, polypeptider10, proteiner (foldet og udfoldet)11, polymerer (polyethylenglycol og andre)12,13 , 14, guld nanopartikler15,16,17,18,19og andre syntetiske molekyler20.
Vi har for nylig demonstreret, at αhl opiekunka også let kan detektere og karakterisere metalliske klynger, polyoxometalater (Poms), på det enkelte molekyle niveau. Poms er diskrete nanoskala anioniske metal ilt klynger, der blev opdaget i 182621, og siden da, mange flere typer er blevet syntetiseret. De forskellige størrelser, strukturer og elementær sammensætninger af polyoxometalater, der nu er tilgængelige, førte til en bred vifte af egenskaber og applikationer, herunder kemi22,23, katalyse24, materialevidenskab25 ,26og biomedicinsk forskning27,28,29.
POM syntese er en selv montageproces, der typisk udføres i vand ved at blande de støkiometrisk krævede mængder af monomeriske metalsalte. Når POMs er dannet, udviser de en stor mangfoldighed af størrelser og former. For eksempel er Keggin polyanion struktur, XM12O40q- sammensat af et Heteroatom (X) omgivet af fire oxygens til dannelse af et tetraeder (q er afgiften). Heteroatomet er centralt beliggende i et bur dannet af 12 oktaedriske mo6 enheder (hvor M = overgangsmetaller i deres høje oxidations tilstand), som er forbundet med hinanden ved tilstødende fælles oxygen atomer. Mens wolfram polyoxometalates struktur er stabil i sure forhold, hydroxiumioner føre til den hydrolytiske spaltning af metal-ilt (M-O) obligationer30. Denne komplekse proces resulterer i tab af en eller flere mo6 oktaedriske under enheder, hvilket fører til dannelsen af monovacant og triledige arter og i sidste ende til fuldstændig nedbrydning af Poms. Vores diskussion her vil være begrænset til de delvise nedbrydningsprodukter af 12-phosphotungstic syre ved pH 5,5 og 7,5.
Målet med denne protokol er at detektere diskrete metal oxygen klynger ved det enkelte molekyle grænse ved hjælp af en biologisk nanopore-baseret elektronisk platform. Denne metode giver mulighed for påvisning af metalliske klynger i opløsning. Flere arter i opløsning kan diskrimineres med større følsomhed end konventionelle analysemetoder33. Med det, subtile forskelle i POM struktur kan belyses, og ved koncentrationer markant lavere end dem, der kræves for NMR spektroskopi. Det er vigtigt, at denne fremgangsmåde endda tillader diskrimination af isomere former af na8HPW9O341.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Nedenstående protokol er specifik for det elektroniske BioSciences (EBS) Nanopatch DC-system. Men, det kan let tilpasses andre Elektrofysiologi apparater, der anvendes til at måle den nuværende gennem planar lipid tolags membraner (standard lipid tolags membran kammer, U-tube geometri, trukket mikrokapillærer, etc.). Identifikationen af kommercielle materialer og deres kilder er givet til at beskrive de eksperimentelle resultater. Denne identifikation indebærer under ingen omstændigheder en anbefaling fra det nationale Institut for standarder og teknologi, og det betyder heller ikke, at materialerne er de bedste tilgængelige.
1. klargøring af opløsning og analysand
- Forbered alle elektrolytopløsninger med 18 MΩ-cm vand fra et type-1 vandrensningssystem for at fjerne spor økologiske arter, og Filtrer derefter alle elektrolytopløsninger gennem et 0,22 μm vakuum filter umiddelbart før ion Channel-optagelser.
Bemærk: Vandkvaliteten er en afgørende faktor for stabiliteten og levetiden af membranen opiekunka system. - Vild type αHL.
- Følg MSDS forholdsregler ved håndtering af αHL toksin proteinet.
- Bland lyofiliseret vildtype monomere S. aureus α-hemolysin (αhl) pulver med 18 MΩ-cm vand ved 1 mg/ml. 10 til 30 μL aliquoter af prøven fordeles i kryo-sikre centrifugerør, hurtigt opfryses i flydende nitrogen og opbevares derefter ved-80 °C. Alternativt kan du bruge renset præformeret heptameric αhl31.
- Lipid 1,2-Diphytanoyl-SN-glycero-3-Phosphocholin (DPhyPC) opløses til 0,2 mg/mL i n-decan i et 4 ml glas scintillationshætte glas med polytetrafluorethyleneeflon-belagt hætte. Opløsningen opbevares ved 4 °C ved gentagen brug i op til en måned.
- Forbered wolframphosphorsyre syreopløsninger.
- Følg MSDS forholdsregler ved håndtering af wolframphosphorsyre Acid pulver og Forbered en 2 mm fosfotungstisk syre stamopløsning ved at opløse 57,6 mg H3PW12O40 i 10 ml af en 1 M NaCl og 10 mm Nah2po4 løsning, som udgør stamopløsningen.
- Tag 5 mL af denne opløsning og Juster pH til 5,5 med 3 M NaOH. PH-værdien af de øvrige 5 mL af stamopløsningen justeres til 7,5 med 3 M NaOH.
Bemærk: Ved pH 5,5 nedbrydes 12-phosphotungstisk syre (PTA, H3PW12O40) primært til MONOVACANT anion [PW11O39]7-.
2. test celle samling
- Saml test cellen pr. producentens anvisninger.
- Sug en Ag/AgCl wire i blegemiddel (natriumhypochlorit) i 10 minutter efter at have fået den med 600 Grit sandpapir. Placer elektroden inde i kvarts opiekunka membranen (qnm).
- Placer en cylindrisk AgCl pellet elektrode indlejret i en sølv wire uden for QNM.
- Når test cellen er konfigureret, skal du tænde for strømforsyningen og programmet til dataindsamling. Sørg for, at DC Current-læsningen er 0 pA, hvis der ikke findes en opløsning i test cellen.
- Brug en sprøjte, der er sluttet til test cellen, via en væske linje for at tilføje bufferet elektrolyt opløsning over ansigtet af qnm og for at sikre, at den ioniske strøm mættede forstærkeren. Hvis det ikke er det, kan QNM være tilstoppet. Påfør en pop-spænding (± 1 V) og/eller et tryk, der er større end 300 mm Hg, for at rydde den. Hvis det virker, reducere spænding og tryk.
3. dannelse af lipid-Bilayer
- Fyld opløsningen i test cellen, så løsnings niveauet er langt over forsiden af QNM. Derefter sænke opløsningen niveau via sprøjten til under ansigtet, således at den nuværende falder til nul.
- Dyp en 10 μL pipettespids i lipid-hætteglasset. Tryk på bagsiden af pipettespidsen, og Tap på den på siden af hætteglasset for at fjerne al synlig lipid.
- Berør pipettespidsen på opløsningen i test cellen, når opløsningen ligger over QNM-ansigtet, og vent to til fem minutter på, at lipid spredes ensartet.
- Langsomt sænke opløsningen niveau under ansigtet af qnm indtil den aktuelle mættede, og derefter langsomt hæve opløsningen niveau forbi ansigtet af qnm til dannelse af en lipid tolags membran.
- Når en tolags synes at danne (dvs., når strømmen går til nul), prøv popping det flere gange ved at øge trykket og sikre, at qnm ikke er tilstoppet. For at reformere lipid-tolags membranen, sænke opløsningen niveau under ansigtet af qnm og langsomt hæve det.
- Hvis lipid-tolags membranen ikke dannes første gang, Sænk opløsningen under ansigtet og løft den igen. Hvis det ikke dannes efter 3 forsøg, tilsættes flere lipider som beskrevet i 3,2 og 3,3.
- Når du har dannet en membran, skal du indstille den aktuelle forskydning til nul, når det anvendte potentiale er nul.
4. αhl pore dannelse
- Tilsæt 2,5 ng af renset, præformeret αhl heptameric-protein prøve (eller 250 ng af monomerisk αhl) til test cellen (volumen ≈ 200 μl) for at muliggøre kanal dannelse.
- Øg trykket på billaget med en gastæt sprøjte (figur 1), efter at der er dannet en lænde, for at udvide membranen fra qnm og lette opiekunka indsættelse. Løft det påførte modtryk typisk mellem 40 og 200 mmHg afhængigt af hver QNM.
Bemærk: EBS-softwaren har en automatiseret indsætnings funktion, der anvender en højere bias (typisk 200 til 400 mV) til at fremkalde pore dannelse og derefter automatisk reducerer den ønskede spænding til måle bias, når en enkelt kanal dannes. - Efter en opiekunka-form, reduceres rygtrykket til ca. 1 ⁄ 2 af indsættelses trykket. Hvis der observeres flere kanaler, fjernes de ved at reducere trykket markant.
5. metallisk klynge opdeling i Nanopore
- For at gøre sig gældende for elektrode ubalancer indstilles JÆVNSTRØMS forskydningen således, at når det anvendte potentiale er indstillet til nul, er der ingen målt strøm.
- Før du tilføjer POM-prøven, skal du udføre et kontrol eksperiment for at sikre, at der ikke er nogen forurenende stoffer (f. eks.spor Poms fra et tidligere eksperiment) i reservoiret. Konkret erhverve en ionisk strøm spor under et anvendt potentiale på + 120 mV til-120 mV i mangel af nogen POMs at kontrollere, at der ikke spontane aktuelle blokader er til stede.
Bemærk: På grund af den asymmetriske struktur i αHL-kanalen (figur 1) vil det Ioniske strøm væsens styrke variere for positive og negative anvendte potentialer. Forholdet mellem den målte strøm over denne anvendte spænding er en indikation af retningen af αhl opiekunka i membranen. - Tilsæt POM-prøven ved at skylle reservoiret med en metallisk klynge opløsning på 1 til 5 mM koncentration. Alternativt kan du indlæse prøven i kapillar før celle samling for at studere opdelingen af POMs i den anden ende af αHL-kanalen.
- Optag den ioniske strøm ved hjælp af producentens software til at detektere forbigående aktuelle blokader forårsaget af opdeling af individuelle POMs i nanopore. Estimere de fysiske og kemiske egenskaber af molekylet fra den ioniske nuværende blokade dybde, hændelses frekvens, og opholdstiden fordeling af blokader.
6. ion-kanal optagelser og data analyse
- Opnå de Ioniske aktuelle tidsserie målinger ved hjælp af en høj impedans, støjsvag forstærker og dataindsamling system. Udfør målingerne ved en anvendt spænding på-120 mV (i forhold til kanal CIS side) for hver pH-værdi.
- Anvend et low-pass 100 kHz 8-polet Bessel-filter på signalet, som efterfølgende digitaliseres ved 500 kHz (dvs. 2 MS/point). Uddrag begivenheder fra tidsserien og analysere begivenheder ved hjælp af Adept algoritme i Mosaic software Package32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I løbet af de sidste to årtier, membran-bundne protein nanometer-skala porer er blevet demonstreret som alsidige single-molekyle sensorer. Nanopore-baserede målinger er relativt ligetil at udføre. To kamre fyldt med elektrolyt opløsning adskilles af en opiekunka, der er indlejret i en elektrisk isolerende lipid-membran. Enten en patch-clamp forstærker eller en ekstern strømforsyning giver et elektrostatisk potentiale på tværs af opiekunka via Ag/AgCl elektroder nedsænket i elektrolyt reservoirer. Det elektriske felt driver individuelle ladede partikler ind i pore, som producerer forbigående reduktioner i ionstrømmen, der afhænger af partiklerne størrelse, form og ladning. Et edb-program styrer den anvendte spænding og skærme, i realtid, den ioniske nuværende blokader forårsaget af molekyler reversibelt partitionering i pore. Strømmen forstærkes og omdannes til spænding med en lav-støj, høj impedans felt-effekt transistor og digitaliseret ved hjælp af et data erhvervelse kort.
Her giver vi en generel procedure for påvisning af polyoxometalater med en biologisk nanopore. Som det ses i figur 2, har den uhindrede kanal før tilføjelsen af Poms en gennemsnitlig åben kanal strøm på ~ 100 Pa ved et anvendt potentiale på-120 mv. Tilføjelsen af POMs producerer forbigående blokader og nedsætter ionstrømmen med ca. 80%. Som forventet, fordi disse partikler er negativt opladet, er blokader ikke observeret, når polaritet af det anvendte potentiale er vendt. Bemærk, at hvis POMs ikke interagere med pore væggen, ville de diffus gennem pore i omkring 100 NS, som er alt for kort til at blive opdaget med en konventionel patch clamp forstærker. Således er det meste af tiden en given partikel tilbringer i pore er en direkte konsekvens af samspillet mellem partiklen og pore. Varigheden af en ionisk aktuel blokade begivenhed er defineret som opholdstiden, Tau (τ).
For at illustrere nytten af denne metode diskuterer vi brugen af en αhl opiekunka for at overvåge nedbrydningen af 12-phosphotungstisk syre (PTA, H3PW12O40) ved pH 5,5 og pH 7,5. Denne nedbrydning kan observeres med 31P NMR målinger, men den nødvendige koncentration er 2 mm, mens opiekunka målinger har brug for mindre end 30 μM, på grund af opiekunka måling følsomhed. På pH 5,5, [PW11O39]7- er den dominerende art30.
Dataanalysen udføres ved at beregne et histogram af det relative blokade Dybdeforhold (dvs.<i>/<io>, hvor <i> er middelstrømmen med pom i pore og < io > er den gennemsnitlige åbne kanal strøm). Histogrammet af de gennemsnitlige nuværende blokade Dybdeforhold på-120 mV og pH 5,5 udviser en mindre spids ved <i>/<io> ≈ 0,06 og Major peak på < i >/<io> ≈ 0,16 (figur 3 , grøn). Vi antager, at disse toppe svarer til [P2W5o23]6- og [PW11O39]7-, henholdsvis baseret på 31P NMR. 31 P NMR undersøgelser tyder på, at øge pH ændrer den relative koncentration af disse to arter, og dette bekræftes af ændringen i området af de to toppe vist i figur 3.
Når POM-opløsningen titreres til pH 7,5 ex situ, falder den totale POM-koncentration som følge af den delvise nedbrydning af de to vigtigste arter til uorganiske salte (dvs. fri fosfat, Hxpo4−3 + x og tungstate, wo42− ioner). Histogrammet for det relative blokade Dybdeforhold viser også to hovedtoppe (figur 3, orange), men med 20 gange færre hændelser (hvilket tyder på, at den totale POM-koncentration ved pH 7,5 er ca. 20 gange mindre end ved pH 5,5, hvis nanopores erobrings effektivitet for POMs er den samme ved de to pH-værdier). Det er interessant at bemærke, at på pH 7,5 og højere, de POM arter observeret her blev ikke påvist i 31P NMR spektrum på grund af deres lave koncentration forårsaget af deres dissociation til fosfat og tungstate ioner.
Hver begivenheds opholdsperiode i pore er defineret af varigheden af de individuelle Ioniske aktuelle blokader. Fordelingen af opholds tiderne giver indsigt i de forskellige arter, der er til stede. Det blev vist tidligere, at for blokader forårsaget af en forskelligt mellemstore polymerer af poly (ethylenglykol), ophold tidsfordeling for hver størrelse af denne polymer er godt beskrevet af en enkelt eksponentiel. Dette resultat antyder samspillet mellem denne polymer er en simpel reversibel kemisk reaktion12,13,20.
Figur 4 viser, at tidsfordelingen for ophold for de to toppe var godt differentieret ved pH 5,5 og 7,5. To funktioner er klare. For det første er der under alle forhold behov for flere eksponentialer for at passe til hver af distributionerne, hvilket tyder på variationer af POMs inden for hver art. For det andet er opholds tiderne for POMs i pore er meget kortere på pH 7,5 sammenlignet med dem på pH 5,5, hvilket tyder på en svækkelse af samspillet mellem pore og POMs. Det er tidligere blevet påvist, at en ændring i pH ændrer det relative antal faste ladninger i eller i nærheden af αhl-kanalens lumen. Disse ændringer vil direkte ændre samspillet med partitioneringspoms inde i pore og derfor ændre deres opholdstider34,35.
Figur 1: skematisk diagram af den eksperimentelle opsætning. Metode til nanopore-baseret karakterisering af individuelle polyoxometalatmolekyler. Et protein opiekunka, som selv samler i en 4 nm tyk lipid-tolags membran, er badet af vandige elektrolytopløsninger i et glas kapillær og større reservoir. Der påføres et tryk på glasset kapillær med en gasstram sprøjte for at støtte opiekunka inkorporering. En potentiel V påføres på tværs af membranen med et matchet par Ag/AgCl elektroder og driver en ionstrøm (f. eks.na+ og CL-) gennem pore. Strømmen konverteres til spænding med en høj impedans forstærker, digitaliseret med en analog til digital konverter (ADC) og lagret på en computer. Computer software styrer det anvendte potentiale via en digital til analog Converter (DAC) og overvåger i realtid de forbigående aktuelle blokader forårsaget af enkelte molekyler, der partitionerer i pore. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Nanopore-baseret detektion af individuelle metallo-nanopartikler. En illustration af ionisk aktuel tidsserie spor, der opstår før og efter tilsætning af en POM-opløsning til opiekunka-apparatet. Opdelingen af individuelle anioniske POMs i pore er årsag til forbigående strøm reduktioner i den gennemsnitlige åbne pore strøm, <io>. (Højre) En typisk begivenhed, der illustrerer den gennemsnitlige strøm af blokaden (<i>) og opholdstiden (τ) af partiklen i pore. Det anvendte potentiale var-120 mV, og løsningerne indeholdt 1 M NaCl, 10 mM NaH2po4 ved pH 5,5. CIS-rummet indeholdt også 30 μM 12-phosphotungstisk syre. Den nuværende blokade dybde ratio (<i>/<io>) og opholds tiderne (τ) indeholder oplysninger om, hvilke POM-arter der er til stede i opløsningen. Under de betingelser, vi brugte her, er αHL-kanalen ikke porten (spontant lukket), når POMs ikke er til stede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: histogrammer af det aktuelle blokade Dybdeforhold ved pH 5,5 og 7,5. Histogrammer af det POM-inducerede ionaktuelle blokade Dybdeforhold ved pH 5,5 (grøn) og 7,5 (orange) med en anvendt potentiel V =-120 mv. De to toppe, der er til stede ved hver pH-værdi, svarer til de kendte fremherskende POM-arter i opløsning under disse betingelser. De nuværende blokade Dybdeforhold på 0 og 1 svarer til henholdsvis en fuldt blokeret og åben pore. Histogrammer blev oprettet med en placerings bredde på 0,001 og normaliseret til tæller/s ved at dividere med data anskaffelsestid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: bolig tidsfordeling og montering med flere eksponentialer. Fordelingen af opholds tiderne for POM-inducerede aktuelle blokader forårsaget af de to vigtigste arter (toppe 1 og 2 i figur 4) observeret ved pH 5,5 og 7,5 i et semi-log plot. For begge arters vedkommende er opholds tiderne markant kortere ved den højere pH-værdi, hvilket antyder, at samspillet mellem pore og POMs er ændret. De faste linjer passer til en eksponentiel blandingsmodel til dataene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af deres anioniske ladning, POMs sandsynligvis associere med organiske Counter kationer gennem elektrostatiske interaktioner. Derfor er det vigtigt at identificere de rette løsnings betingelser og de rigtige elektrolyt miljøer (især kationer i opløsning) for at undgå kompleksdannelse med POMs. Der kræves særlig omhu i buffer valget. For eksempel er erobrings hastigheden af POMs med tris (hydroxymethyl) aminomethan og citronsyre bufferopløsninger signifikant lavere end i fosfatbufferopløsning, sandsynligvis fordi en af de to første buffere danner et kompleks med POM, der ikke interagerer stærkt med nanopore. Desuden blev NaCl elektrolyt bevidst anvendt i stedet for KCl (samt de andre alkalimetaller) for at undgå udfældningen af [PW11O39]7- af K+.
Afgørende for den nøjagtige måling af opholdstiden fordelinger er evnen til at måle strømmen på en tilstrækkelig høj båndbredde. For eksempel, med eksponentielt fordelte opholdstider er der langt flere blokader med kort end lange bopæls tider, og en nøjagtig vurdering af opholdstiden udlodninger er bedre opnået ved at indsamle en stor del af data (dvs. erhverve det på så højt som en båndbredde systemets elektriske kapacitance tillader). For at opnå denne tilstand i opiekunka spektroskopi bør systemets kapacitans (membran og omstrejfende kapacitans) minimeres. Omstrejfende kapacitans reduceres ved at reducere længden af alle tilslutningskabler og ved hjælp af elektriske kontakter af høj kvalitet. Membran kapacitansen minimeres ved at reducere overfladearealet af den bilayer, øge tykkelsen af understøttende materialer (dvs., kvarts, polytetrafluorethylen, etc.), og mindske arealet af eksponerede understøttende materialer til elektrolyt. I praksis vil et typisk Instruments omstrejfende kapacitans (≈ 2 pF) begrænse støjen for membraner ≈ 1 micron til 5 micron i diameter. Dette udgør metodens begrænsning. For eksempel kan påvisning af små og meget ladede enkelt molekyler være udfordrende på grund af deres relativt korte opholdstider.
Den mekanisme, hvormed trykket muliggør kontrol af kanal indsættelse er ikke helt forstået. Kvarts mikrokapillærer har en meget lille diameter, hvorpå membranen dannes. Påføring af tryk vil få membranen til at bule (og derved øge membranens overfladeareal) og muligvis tynde membranen. Begge effekter ville øge hastigheden, hvormed kanalerne vil danne i membranen. Når en enkelt kanal spontant former, reducere trykket for at forhindre indsættelse af ekstra kanaler. Det er ikke nødvendigt at fjerne ikke-indsatte αhl fra bulkvandfasen, hvis koncentrationen af α-hl er tilstrækkelig lav.
Strukturerne og afgifterne for polyoxometalater er i øjeblikket undersøgt ved hjælp af traditionelle analytiske kemi teknikker, herunder NMR, ultraviolet-synlig, infrarød og Raman spektroskopi, massespektrometri og røntgen diffraktion. Vi forventer, at opiekunka målinger vil supplere karakteriseringen af disse og andre fysiske egenskaber af Poms, samt studiet af deres artsbestemmelse ved lav koncentration, som vil hjælpe bedre at forstå den syntetiske vej af polyoxometalater Dannelsen. Det blev også tidligere påvist, at αhl pore endda kan skelne mellem 2 isomerer af den Triledige Keggin form na8hpw9O3430.
Sammenfattende har vi vist, at en membran-bundet protein opiekunka kan bruges til at detektere og karakterisere wolframoxid metalliske klynger (heteropolytungstates) i opløsning ved hjælp af en simpel høj opløsning elektrisk måling. Den følsomhed, som denne nye tilgang giver mulighed for sporing af subtile forskelle i POM struktur, der opstår ved forskellige pH-værdier i koncentrationer, der er væsentligt lavere (> 70-fold) end krævet for traditionelle metoder som NMR Spektroskopi. På grund af nanopores ' enkelt molekyle detekteringsevne kan den faktiske detektionsgrænse i metoden gøres meget lavere ved at måle strømmen i længere tid (indfangnings graden skaleres i forhold til POM-koncentrationen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for økonomisk støtte fra den europæiske molekylær biologi organisation for et postdoktorat stipendium (til J.E.) og et stipendium fra NIH NHGRI (til J.J.K.). Vi sætter pris på hjælp fra professorer Jingyue Ju og Sergey Kalachikov (Columbia University) for at give heptameric αHL, og for inspirerende diskussioner med Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
- Dekker, C.
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F.
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
