Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.
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Methodenartikel
Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einzelne Moleküle können erkannt und charakterisiert werden, indem sie den Grad messen, durch den sie den ionenförmigen Strom reduzieren, der durch eine einzelne Nanometer-Pore fließt. Das Signal ist charakteristisch für die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Moleküls und seine Wechselwirkungen mit der Pore. Wir zeigen, dass die durch das bakterielle Protein-Exotoxin Staphylococcus aureus alpha hämolysin (HL) gebildete Nanopore Polyoxometalate (POMs, anionische Metallsauerstoffcluster) an der Grenze zu einzelnen Molekülen nachweisen kann. Darüber hinaus werden mehrfache Abbauprodukte von 12-Phosphotungstic Acid POM (PTA, H3PW12O40) in Lösung gleichzeitig gemessen. Die Einzelmolekülempfindlichkeit der Nanoporenmethode ermöglicht es, POMs in deutlich niedrigeren Konzentrationen als für die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zu kennzeichnen. Diese Technik könnte als neues Werkzeug für Chemiker dienen, um die molekularen Eigenschaften von Polyoxometalaten oder anderen metallischen Clustern zu untersuchen, um pom synthetische Prozesse besser zu verstehen und möglicherweise ihre Ausbeute zu verbessern. Hypothetisch könnte mit dieser Methode die Position eines bestimmten Atoms oder die Rotation eines Fragments im Molekül und der Metalloxidationszustand untersucht werden. Darüber hinaus hat diese neue Technik den Vorteil, dass die Echtzeitüberwachung von Molekülen in Lösung ermöglicht wird.
Einleitung
Die Detektion biomolekularer Analyten auf einzelmolekülebene kann durch Nanoporen und Messung von Ionenstrommodulationen durchgeführt werden. Typischerweise werden Nanoporen aufgrund ihrer Herstellung in zwei Kategorien eingeteilt: biologisch (selbstzusammengesetzt aus Protein oder DNA-Origami)1,2,3, oder Festkörper (z.B.hergestellt mit Halbleiterverarbeitungswerkzeuge)4,5. Während Festkörper-Nanoporen als potenziell physikalisch robuster und über eine Vielzahl von Lösungsbedingungen verwendet werden können, ....
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Protokoll
Hinweis: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das Electronic BioSciences (EBS) Nanopatch DC System. Es kann jedoch leicht an andere elektrophysiologische Apparate angepasst werden, die verwendet werden, um den Strom durch planare Lipid-Doppelschichtmembranen (Standard-Lipid-Doppelschichtmembrankammer, U-Rohr-Geometrie, gezogene Mikrokapillaren usw.)zu messen. Die Identifizierung kommerzieller Materialien und ihrer Quellen dient der Beschreibung der experimentellen Ergebnisse. In keinem Fall impliziert diese Identifizierung eine Empfehlung des National Institute of Standards and Technology, noch impliziert sie, dass die Materialien die be....
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Ergebnisse
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden membrangebundene Protein-Nanometer-Poren als vielseitige Einzelmolekülsensoren nachgewiesen. Nanoporenbasierte Messungen sind relativ einfach durchzuführen. Zwei mit Elektrolytlösung gefüllte Kammern sind durch eine Nanopore getrennt, die in eine elektrisch isolierende Lipidmembran eingebettet ist. Entweder ein Patch-Clamp-Verstärker oder ein externes Netzteil bietet über Ag/AgCl-Elektroden, die in die Elektrolytspeicher eingetaucht sind, e.......
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Diskussion
Aufgrund ihrer anionischen Ladung werden POMs wahrscheinlich durch elektrostatische Wechselwirkungen mit organischen Gegenkationen assoziiert. Daher ist es wichtig, die richtigen Lösungsbedingungen und die richtigen Elektrolytumgebungen (insbesondere Kationen in Lösung) zu identifizieren, um komplexe Bildungen mit POMs zu vermeiden. Besondere Sorgfalt ist bei der Pufferwahl erforderlich. Beispielsweise ist die Erfassungsrate von POMs mit Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan und Zitronensäure-gepufferten Lösungen deutlich niedr.......
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Danksagungen
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die European Molecular Biology Organization für ein Postdoktorandenstipendium (an J.E.) und ein Stipendium des NIH NHGRI (an J.J.K.). Wir schätzen die Hilfe der Professoren Jingyue Ju und Sergey Kalachikov (Columbia University) für die Bereitstellung heptamerischer HL und für inspirierende Diskussionen mit Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore Vakuumfilter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-phosphocholin (DPhPC) | Avanti Polare Lipide, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decan, ReagentPlus, ≥ 99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| α HL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag-Draht | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl-Scheibenelektrode | In Vivo Metric | E202 | |
| Hochohmiges Verstärkersystem | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| Quarzkapillaren | |||
| kundenspezifische Polycarbonat-Testzelle | |||
| Datenverarbeitung und -analyse MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungssäurehydrat | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Natriumphosphat monobasisches Monohydrat | Sigma-Aldrich | 71507 |
Referenzen
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
