Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.
Abstract
Einzelne Moleküle können erkannt und charakterisiert werden, indem sie den Grad messen, durch den sie den ionenförmigen Strom reduzieren, der durch eine einzelne Nanometer-Pore fließt. Das Signal ist charakteristisch für die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Moleküls und seine Wechselwirkungen mit der Pore. Wir zeigen, dass die durch das bakterielle Protein-Exotoxin Staphylococcus aureus alpha hämolysin (HL) gebildete Nanopore Polyoxometalate (POMs, anionische Metallsauerstoffcluster) an der Grenze zu einzelnen Molekülen nachweisen kann. Darüber hinaus werden mehrfache Abbauprodukte von 12-Phosphotungstic Acid POM (PTA, H3PW12O40) in Lösung gleichzeitig gemessen. Die Einzelmolekülempfindlichkeit der Nanoporenmethode ermöglicht es, POMs in deutlich niedrigeren Konzentrationen als für die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zu kennzeichnen. Diese Technik könnte als neues Werkzeug für Chemiker dienen, um die molekularen Eigenschaften von Polyoxometalaten oder anderen metallischen Clustern zu untersuchen, um pom synthetische Prozesse besser zu verstehen und möglicherweise ihre Ausbeute zu verbessern. Hypothetisch könnte mit dieser Methode die Position eines bestimmten Atoms oder die Rotation eines Fragments im Molekül und der Metalloxidationszustand untersucht werden. Darüber hinaus hat diese neue Technik den Vorteil, dass die Echtzeitüberwachung von Molekülen in Lösung ermöglicht wird.
Introduction
Die Detektion biomolekularer Analyten auf einzelmolekülebene kann durch Nanoporen und Messung von Ionenstrommodulationen durchgeführt werden. Typischerweise werden Nanoporen aufgrund ihrer Herstellung in zwei Kategorien eingeteilt: biologisch (selbstzusammengesetzt aus Protein oder DNA-Origami)1,2,3, oder Festkörper (z.B.hergestellt mit Halbleiterverarbeitungswerkzeuge)4,5. Während Festkörper-Nanoporen als potenziell physikalisch robuster und über eine Vielzahl von Lösungsbedingungen verwendet werden können, bieten Protein-Nanoporen bisher eine höhere Empfindlichkeit, eine höhere Resistenz gegen Fouling, eine größere Bandbreite, eine bessere chemische Selektivität und ein größeres Signal-Rausch-Verhältnis.
Eine Vielzahl von Proteinionenkanälen, wie z. B. der von Staphylococcus aureus (Hämolysin (HL) gebildete, kann verwendet werden, um einzelne Moleküle zu detektieren, einschließlich Ionen (z.B., H+ und D+)2,3, Polynukleotide (DNA und RNA)6,7,8, geschädigte DNA9, Polypeptide10, Proteine (gefaltet und entfaltet)11, Polymere (Polyethylenglykol und andere)12,13 , 14, gold nanoparticles15,16,17,18,19, und andere synthetische Moleküle20.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass die 'HL-Nanopore auch metallische Cluster, Polyoxometalate (POMs), auf der Ebene einzelner Moleküle leicht erkennen und charakterisieren kann. POMs sind diskrete nanoskalige anionische Metallsauerstoff-Cluster, die 182621entdeckt wurden, und seitdem wurden viele weitere Typen synthetisiert. Die verschiedenen Größen, Strukturen und elementaren Zusammensetzungen von Polyoxometallen, die jetzt verfügbar sind, führten zu einer Vielzahl von Eigenschaften und Anwendungen, einschließlich Chemie22,23, Katalyse24, Materialwissenschaft25 ,26, und biomedizinische Forschung27,28,29.
Die POM-Synthese ist ein Selbstmontageverfahren, das typischerweise in Wasser durch Mischen der stoichiometrisch erforderlichen Mengen monomerer Metallsalze durchgeführt wird. Einmal gebildet, zeigen POMs eine große Vielfalt an Größen und Formen. Zum Beispiel besteht die Keggin Polyanion Struktur, XM12O40q- aus einem Heteroatom (X) umgeben von vier Sauerstoffn, um ein Tetraeder zu bilden (q ist die Ladung). Das Heteroatom befindet sich zentral in einem Käfig, der durch 12 oktaeder MO 6-Einheiten gebildet wird (wobei M = Übergangsmetalle in ihrem hohen Oxidationszustand), die durch benachbarte gemeinsame Sauerstoffatome miteinander verbunden sind. Während die Struktur von Wolframpolyoxometallaten unter sauren Bedingungen stabil ist, führen Hydroxidionen zur hydrolytischen Spaltung von Metall-Sauerstoff-Bindungen (M-O)30. Dieser komplexe Prozess führt zum Verlust einer oder mehrerer MO6 Oktaeder-Untereinheiten, was zur Bildung von monovacantn und trivacant Arten und schließlich zur vollständigen Zersetzung der POMs führt. Unsere Diskussion wird sich hier auf die partiellen Zersetzungsprodukte von 12-Phosphotungssigsäure bei pH 5,5 und 7,5 beschränken.
Ziel dieses Protokolls ist es, diskrete Metallsauerstoffcluster an der Grenze zu einzelnen Molekülen mithilfe einer biologischen nanoporenbasierten elektronischen Plattform zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Detektion von metallischen Clustern in Lösung. Mehrere Arten in Lösung können mit einer größeren Empfindlichkeit als herkömmliche Analysemethoden diskriminiert werden33. Damit können feine Unterschiede in der POM-Struktur aufgeklärt werden und bei Konzentrationen deutlich niedriger als bei der NMR-Spektroskopie. Wichtig ist, dass dieser Ansatz sogar die Diskriminierung von isomerischen Formen von Na8HPW9O341ermöglicht.
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Protocol
Hinweis: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das Electronic BioSciences (EBS) Nanopatch DC System. Es kann jedoch leicht an andere elektrophysiologische Apparate angepasst werden, die verwendet werden, um den Strom durch planare Lipid-Doppelschichtmembranen (Standard-Lipid-Doppelschichtmembrankammer, U-Rohr-Geometrie, gezogene Mikrokapillaren usw.)zu messen. Die Identifizierung kommerzieller Materialien und ihrer Quellen dient der Beschreibung der experimentellen Ergebnisse. In keinem Fall impliziert diese Identifizierung eine Empfehlung des National Institute of Standards and Technology, noch impliziert sie, dass die Materialien die besten verfügbaren sind.
1. Lösungs- und Analytenvorbereitung
- Bereiten Sie alle Elektrolytlösungen mit 18 M-cm-Wasser aus einem Wasserreinigungssystem Typ-1 vor, um Spuren organische Arten zu entfernen, und filtern Sie dann alle Elektrolytlösungen durch einen 0,22 m-Vakuumfilter unmittelbar vor Ionenkanalaufzeichnungen.
Hinweis: Die Wasserqualität ist ein entscheidender Faktor für die Stabilität und Langlebigkeit des Membran-Nanoporensystems. - Wild-Typ -HL.
- Befolgen Sie die Vorsichtsmaßnahmen von MSDS beim Umgang mit dem Protein "HL-Toxin".
- Mischen Sie lyophilisiertes monomeres S. aureus-Hemolysinpulvermit 18 M-cm-Wasser bei 1 mg/ml. 10 bis 30 L Aliquots der Probe in kryosichere Zentrifugenrohre verteilen, schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann bei -80 °C lagern. Alternativ können Sie auch gereinigte vorgeformte heptamische HL31verwenden.
- Das Lipid 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhyPC) auf 0,2 mg/ml in n-Decan in einer 4 ml Glasszintillationsdurchstechflasche mit einer mit Polytetrafluorethyleneflon beschichteten Kappe auflösen. Bewahren Sie die Lösung bei 4 °C für den wiederholten Gebrauch bis zu einem Monat auf.
- Bereiten Sie Phosphotungstiksäure-Lösungen vor.
- Befolgen Sie die Vorsichtsmaßnahmen des MSDS beim Umgang mit dem Phosphotungsticacid-Pulver und bereiten Sie eine 2 mM Phosphotungssäure-Stammlösung vor, indem Sie 57,6 mg H3PW12O40 in 10 ml eines 1 M NaCl und 10 mM NaH2PO4 auflösen. Lösung, die die Lagerlösung darstellt.
- Nehmen Sie 5 ml dieser Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 mit 3 M NaOH ein. Stellen Sie den pH-Wert der anderen 5 ml der Lagerlösung auf 7,5 mit 3 M NaOH ein.
Hinweis: Bei pH 5,5 zersetzt sich 12-Phosphotungsticacid (PTA, H3PW12O40) in erster Linie in das monofreie Anion [PW11O39]7-.
2. Testzellenbaugruppe
- Montieren Sie die Testzelle gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Ein Ag/AgCl-Draht in Bleichmittel (Natriumhypochlorit) 10 Minuten nach dem Abschleifen mit 600 Körnungspapier einweichen. Positionieren Sie die Elektrode in der Quarz-Nanoporenmembran (QNM).
- Legen Sie eine zylindrische AgCl-Pelletelektrode in einen Silberdraht außerhalb des QNM ein.
- Sobald die Testzelle eingerichtet ist, schalten Sie das Netzteil- und Datenerfassungsprogramm ein. Stellen Sie sicher, dass der DC-Stromwert 0 pA beträgt, wenn in der Testzelle keine Lösung gefunden wird.
- Verwenden Sie eine Spritze, die über eine Fluidleitung mit der Testzelle verbunden ist, um eine gepufferte Elektrolytlösung über der Fläche des QNM hinzuzufügen und sicherzustellen, dass der Ionenstrom den Verstärker sättigt. Ist dies nicht der Fall, ist das QNM möglicherweise verstopft. Wenden Sie eine Pop-Spannung (ca. 1 V) und/oder einen Druck größer als 300 mm Hg an, um sie zu löschen. Wenn das funktioniert, reduzieren Sie die Spannung und den Druck.
3. Lipid Bilayer Formation
- Füllen Sie die Lösung in der Testzelle, sodass die Lösungsebene deutlich über dem Gesicht des QNM liegt. Senken Sie dann den Lösungspegel über eine Spritze unter das Gesicht, so dass der Strom auf Null abnimmt.
- Tauchen Sie eine 10-L-Pipettespitze in die Lipid-Durchstechflasche. Drücken Sie auf das hintere Ende der Pipettenspitze und tippen Sie auf die Seite der Durchstechflasche, um alle sichtbaren Lipide zu entfernen.
- Berühren Sie die Pipettenspitze auf die Luft-Wasser-Schnittstelle der Lösung in der Testzelle, wenn der Lösungsgrad über dem QNM-Gesicht liegt, und warten Sie zwei bis fünf Minuten, bis sich das Lipid gleichmäßig ausbreitet.
- Senken Sie den Lösungspegel unterhalb der Fläche des QNM langsam, bis der Strom gesättigt ist, und erhöhen Sie dann langsam den Lösungspegel über das Gesicht des QNM hinaus, um eine Lipid-Bilayer-Membran zu bilden.
- Sobald sich ein Doppelschichtwert zu bilden scheint(d. h., wenn der Strom auf Null geht), versuchen Sie es mehrmals, indem Sie den Druck erhöhen und sicherstellen, dass das QNM nicht verstopft ist. Um die Lipid-Doppelschichtmembran zu reformieren, senken Sie den Lösungspegel unterhalb des QNM und heben Sie ihn langsam an.
- Wenn sich die Lipid-Bilayer-Membran nicht zum ersten Mal bildet, senken Sie die Lösung unter dem Gesicht und heben Sie sie erneut an. Wenn es sich nach 3 Studien nicht bildet, fügen Sie weitere Lipide hinzu, wie in 3.2 und 3.3 beschrieben.
- Legen Sie nach dem Bilden einer Membran den Stromversatz auf Null fest, wenn das angewendete Potential Null ist.
4. HLPorenbildung
- Fügen Sie der Testzelle 2,5 ng der gereinigten vorgeformten HL-häptameren Proteinprobe (oder 250 ng monomere HL) hinzu, um die Kanalbildung zu ermöglichen.
- Erhöhen Sie den Druck auf die Bilayer mit einer gasdichten Spritze (Abbildung1), nachdem eine Bilayergebildet eingehnt wurde, um die Membran aus dem QNM zu erweitern und das Einsetzen von Nanoporen zu erleichtern. Erhöhen Sie den aufgebrachten Gegendruck in der Regel zwischen 40 und 200 mmHg, je nach QNM.
Hinweis: Die EBS-Software verfügt über eine automatisierte Einfügefunktion, die eine höhere Verzerrung (in der Regel 200 bis 400 mV) anwendet, um die Porenbildung zu induzieren, und dann automatisch die gewünschte Spannung auf die Messverzerrung reduziert, sobald sich ein einzelner Kanal bildet. - Nach einer Nanopore-Form den Gegendruck auf etwa 1/2 des Einfügedrucks reduzieren. Wenn mehrere Kanäle beobachtet werden, entfernen Sie sie, indem Sie den Druck deutlich reduzieren.
5. Metallische Cluster-Partitionierung in der Nanopore
- Um Elektrodenungleichgewichte zu berücksichtigen, stellen Sie die DC-Offsetspannung so ein, dass, wenn das angelegte Potential auf Null eingestellt ist, kein gemessener Strom vorhanden ist.
- Führen Sie vor dem Hinzufügen der POM-Probe ein Kontrollexperiment durch, um sicherzustellen, dass sich keine Verunreinigungen(z. B.Nachverfolgen von POMs aus einem vorherigen Experiment) im Reservoir befinden. Insbesondere erwerben Sie eine ionenstromförmige Spur unter einem angewandten Potential von +120 mV bis -120 mV, wenn keine POMs vorhanden sind, um zu überprüfen, ob keine spontanen Stromblockaden vorhanden sind.
Hinweis: Aufgrund der asymmetrischen Struktur des HL-Kanals (Abbildung 1) unterscheidet sich die Magnitut des Ionenstroms für positive und negativ aufgebrachte Potentiale. Das Verhältnis des gemessenen Stroms über dieser angelegten Spannung ist bezeichnend für die Ausrichtung des HL-Nanoporens in der Membran. - Fügen Sie die POM-Probe hinzu, indem Sie das Reservoir mit einer metallischen Clusterlösung bei 1 bis 5 mM Konzentration spülen. Alternativ können Sie die Probe vor der Zellbaugruppe in die Kapillare laden, um die Partitionierung von POMs in das andere Ende des HL-Kanals zu untersuchen.
- Zeichnen Sie den Ionenstrom mit der Software des Herstellers auf, um vorübergehende Stromblockaden zu erkennen, die durch die Partitionierung einzelner POMs in die Nanopore verursacht werden. Schätzen Sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Moleküls anhand der Ionenstrom-Blockadetiefe, der Ereignishäufigkeit und der Verteilung der Verweilzeit der Blockaden.
6. Ionenkanalaufzeichnungen und Datenanalyse
- Erfassen Sie die ionischen Stromreihenmessungen mit einem hochimpedatorzeitlichen, geräuscharmen Verstärker und Datenerfassungssystem. Führen Sie die Messungen bei einer angelegten Spannung von -120 mV (relativ zur Kanal-cis-Seite) für jeden pH-Wert durch.
- Tragen Sie einen Tiefpass-100 kHz 8-poligen Bessel-Filter auf das Signal auf, der anschließend bei 500 kHz(d.h. 2 ms/Punkt) digitalisiert wird. Extrahieren Sie Ereignisse aus der Zeitreihe und analysieren Sie Ereignisse mit dem ADEPT-Algorithmus im MOSAIC-Softwarepaket32,33.
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Representative Results
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden membrangebundene Protein-Nanometer-Poren als vielseitige Einzelmolekülsensoren nachgewiesen. Nanoporenbasierte Messungen sind relativ einfach durchzuführen. Zwei mit Elektrolytlösung gefüllte Kammern sind durch eine Nanopore getrennt, die in eine elektrisch isolierende Lipidmembran eingebettet ist. Entweder ein Patch-Clamp-Verstärker oder ein externes Netzteil bietet über Ag/AgCl-Elektroden, die in die Elektrolytspeicher eingetaucht sind, ein elektrostatisches Potenzial über die Nanopore. Das elektrische Feld treibt einzelne geladene Teilchen in die Pore, was zu transienten Reduktionen des Ionenstroms führt, die von der Größe, Form und Ladung der Partikel abhängen. Ein Computerprogramm steuert die angelegte Spannung und überwacht in Echtzeit die Ionenstromblockaden, die durch Moleküle verursacht werden, die sich reversibel in die Pore aufteilen. Der Strom wird verstärkt und mit einem geräuscharmen, hochimpedatorischen Feldeffekttransistor in Spannung umgewandelt und mit einer Datenerfassungskarte digitalisiert.
Hier bieten wir ein allgemeines Verfahren zum Nachweis von Polyoxometalaten mit einem biologischen Nanopore an. Wie in Abbildung 2zu sehen, hat der ungehinderte Kanal vor dem Hinzufügen von POMs einen mittleren offenen Kanalstrom von 100 pA bei einem angewandten Potential von -120 mV. Die Zugabe von POMs erzeugt vorübergehende Blockaden und verringert den Ionenstrom um ca. 80%. Wie erwartet, da diese Teilchen negativ geladen sind, werden die Blockaden nicht beobachtet, wenn die Polarität des angewendeten Potentials umgekehrt wird. Beachten Sie, dass die POMs, wenn sie nicht mit der Porenwand interagieren, in etwa 100 ns durch die Poren diffundieren würden, was viel zu kurz ist, um mit einem herkömmlichen Patchklemmenverstärker erkannt zu werden. Somit ist die meiste Zeit, die ein bestimmtes Teilchen in der Pore verbringt, eine direkte Folge der Wechselwirkung zwischen dem Teilchen und der Pore. Die Dauer eines ionenaktuellen Blockadeereignisses ist definiert als die Verweilzeit, tau () .
Um den Nutzen dieser Methode zu veranschaulichen, diskutieren wir die Verwendung einer Nanopore , um die Zersetzung von 12-Phosphotungsticsäure (PTA, H3PW12O40) bei pH 5,5 und pH 7,5 zu überwachen. Diese Zersetzung kann bei 31P NMR-Messungen beobachtet werden, aber die benötigte Konzentration beträgt 2 mM, während Nanoporenmessungen aufgrund der Nanoporen-Messempfindlichkeit weniger als 30 m benötigen. Bei pH 5,5 ist [PW11O39]7- die vorherrschende Art30.
Die Datenanalyse wird durchgeführt, indem ein Histogramm des relativen Blockadetiefenverhältnisses berechnet wird (d. h.<i>/<io>, wobei <i> der Mittelwertstrom mit dem POM in der Pore und <io > ist der mittlere offene Kanalstrom). Das Histogramm der mittleren Stromblockadetiefenverhältnisse bei -120 mV und pH 5,5 weist einen kleinen Spitzenwert bei <i>/<io> 0,06 und der Hauptgipfel bei /<io> 0,16 (Abbildung 3) auf. , grün). Wir gehen davon aus, dass diese Spitzen [P2W5O23]6- bzw. [PW11O39]7-entsprechen, bezogen auf 31P NMR. 31 P NMR-Studien deuten darauf hin, dass die Erhöhung des pH-Werts die relative Konzentration dieser beiden Arten verändert, was durch die Veränderung des Bereichs der beiden in Abbildung 3dargestellten Spitzen bestätigt wird.
Wenn die POM-Lösung auf pH 7,5 ex situtitriert wird, nimmt die gesamtpom-Konzentration aufgrund des teilweisen Abbaus der zweihauptigen Arten zu anorganischen Salzen ab (d.h. freies Phosphat, HxPO 4 und Wolframat, WO42- Ionen). Das Histogramm des relativen Blockadetiefenverhältnisses zeigt auch zwei Hauptspitzen (Abbildung 3, orange), aber mit 20-fach weniger Ereignissen (was darauf hindeutet, dass die gesamte POM-Konzentration bei pH 7,5 etwa 20-mal geringer ist als bei pH 5,5, wenn die die Erfassungseffizienz von nanopore für POMs ist bei den beiden pH-Werten gleich). Es ist interessant festzustellen, dass bei pH 7,5 und höher die hier beobachteten POM-Arten im 31P NMR-Spektrum aufgrund ihrer geringen Konzentration, die durch ihre Dissoziation in Phosphat- und Wolframationen verursacht wurde, nicht nachgewiesen wurden.
Die Verweilzeit jedes Ereignisses im Poren wird durch die Dauer der einzelnen Ionenstromblockaden definiert. Die Verteilung der Aufenthaltszeiten gibt Einblick in die verschiedenen Arten, die vorhanden sind. Es wurde zuvor gezeigt, dass bei Blockaden, die durch unterschiedlich große Polymere aus Poly (Ethylenglykol) verursacht werden, die Verweilzeitverteilung für jede Größe dieses Polymers durch ein einziges Exponential gut beschrieben wird. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Wechselwirkung dieses Polymers eine einfache reversible chemische Reaktion12,13,20ist.
Abbildung 4 zeigt, dass die Verteilungen der Verweilzeiten für die beiden Spitzen bei pH 5,5 und 7,5 gut differenziert waren. Zwei Merkmale sind klar. Erstens sind unter allen Bedingungen mehrere Exponentials erforderlich, um jede der Verteilungen anzupassen, was darauf hindeutet, dass es Variationen der POMs innerhalb jeder Art gibt. Zweitens sind die Verweilzeiten der POMs in der Pore bei pH 7,5 viel kürzer als bei pH 5,5, was auf eine Schwächung der Wechselwirkung zwischen Poren und POMs hindeutet. Es wurde bereits gezeigt, dass eine Änderung des pH-Wertes die relative Anzahl der fixen Ladungen in oder in der Nähe des HL-Kanallumens verändert. Diese Änderungen ändern direkt die Interaktionen mit partitionierenden POMs innerhalb der Pore und ändern daher ihre Verweilzeiten34,35.
Abbildung 1: Schematisches Diagramm des Versuchsaufbaus. Methode zur Nanoporen-basierten Charakterisierung einzelner Polyoxometalatmoleküle. Eine Protein-Nanopore, die sich in einer 4 nm dicken Lipid-Doppelschichtmembran selbst zusammensetzt, wird durch wässrige Elektrolytlösungen in eine Glaskapillare und ein größeres Reservoir gebadet. Ein Druck wird auf die Glaskapillare mit einer gasdichten Spritze ausgeübt, um die Einarbeitung von Nanoporen zu unterstützen. Ein potentialv wird mit einem abgestimmten Paar Ag/AgCl-Elektroden über die Membran aufgebracht und treibt einen Ionenstrom(z.B.Na+ und Cl-) durch die Pore. Der Strom wird mit einem Hochimpedanzverstärker in Spannung umgewandelt, mit einem Analog-Digital-Wandler (ADC) digitalisiert und auf einem Computer gespeichert. Computersoftware steuert das angewandte Potenzial über einen digitalen analogen Konverter (DAC) und überwacht in Echtzeit die transienten Stromblockaden, die durch einzelne Moleküle verursacht werden, die sich in die Pore aufteilen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nanoporenbasierter Nachweis einzelner Metallo-Nanopartikel. Eine Abbildung von ionischen Stromreihenspuren, die vor und nach dem Hinzufügen einer POM-Lösung zum Nanoporenapparat auftreten. Die Aufteilung einzelner anionischer POMs in die Pore bewirkt vorübergehende Stromreduktionen im mittleren offenen Porenstrom, <io>. (Rechts) Ein typisches Ereignis, das den mittleren Strom der Blockade (<i>) und die Verweilzeit (A) des Teilchens in der Pore veranschaulicht. Das angewandte Potential betrug -120 mV, und die Lösungen enthielten 1 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 bei pH 5,5. Das cis-Fach enthielt auch 30 M 12-Phosphotungssäure. Das aktuelle Blocktiefenverhältnis (<i>/<io>) und die Verweilzeiten (') geben Auskunft darüber, welche POM-Arten in Lösung sind. Unter den Bedingungen, die wir hier verwendet haben, wird der Kanal von HL nicht geschlossen (spontan schließen), wenn POMs nicht vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histogramme des aktuellen Blockadetiefenverhältnisses bei pH 5,5 und 7,5. Histogramme des POM-induzierten Ionenstrom-Blockadetiefenverhältnisses bei pH 5,5 (grün) und 7,5 (orange) mit einem aufgebrachten Potential V = -120 mV. Die beiden Spitzen, die bei jedem pH-Wert vorhanden sind, entsprechen den bekannten vorherrschenden POM-Arten, die unter diesen Bedingungen in Lösung sind. Die aktuellen Blockadetiefenverhältnisse von 0 bzw. 1 entsprechen einer voll gesperrten bzw. offenen Pore. Die Histogramme wurden mit einer Lagerplatzbreite von 0,001 erstellt und durch Division durch die Datenerfassungszeit auf Anzahl/s normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verteilung und Anpassung der Verweilzeit mit mehreren Exponentials. Die Verteilung der Verweilzeiten für POM-induzierte Stromblockaden, die durch die zwei Hauptarten (Spitzen 1 und 2 in Abbildung 4) verursacht werden, die bei pH 5,5 und 7,5 in einem Halbholzplot beobachtet wurden. Bei beiden Arten sind die Verweilzeiten beim höheren pH-Wert deutlich kürzer, was darauf hindeutet, dass sich die Wechselwirkung zwischen Poren und POMs verändert hat. Die durchgezogenen Linien sind Anpassungen eines exponentiellen Mischungsmodells zu den Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Aufgrund ihrer anionischen Ladung werden POMs wahrscheinlich durch elektrostatische Wechselwirkungen mit organischen Gegenkationen assoziiert. Daher ist es wichtig, die richtigen Lösungsbedingungen und die richtigen Elektrolytumgebungen (insbesondere Kationen in Lösung) zu identifizieren, um komplexe Bildungen mit POMs zu vermeiden. Besondere Sorgfalt ist bei der Pufferwahl erforderlich. Beispielsweise ist die Erfassungsrate von POMs mit Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan und Zitronensäure-gepufferten Lösungen deutlich niedriger als bei Phosphatgepufferten, wahrscheinlich, weil einer der ersten beiden Puffer einen Komplex mit dem POM bildet, der stark mit dem Nanoporen interagieren. Darüber hinaus wurde der NaCl-Elektrolyt absichtlich anstelle von KCl (sowie den anderen Alkalimetallen) verwendet, um die Ausfällung von [PW11O39]7- by K+zu vermeiden.
Entscheidend für die genaue Messung der Verweilzeitverteilungen ist die Fähigkeit, den Strom bei einer ausreichend hohen Bandbreite zu messen. Bei exponentiell verteilten Verweilzeiten gibt es beispielsweise weit mehr Blockaden mit kurzen als langen Verweilzeiten, und eine genaue Schätzung der Verweilzeitverteilungen lässt sich besser durch das Sammeln einer Vielzahl von Daten erreichen(d. h. mit einer Bandbreite, die die elektrische Kapazität des Systems zulässt). Um diesen Zustand in der Nanoporenspektroskopie zu erreichen, sollte die Systemkapazität (Membran und Streukapazität) minimiert werden. Die Streukapazität wird reduziert, indem die Länge aller Verbindungskabel verringert und hochwertige elektrische Kontakte verwendet werden. Die Membrankapazität wird minimiert, indem die Oberfläche der Doppelschicht verringert, die Dicke der Trägermaterialien(z. B. Quarz, Polytetrafluorethylen usw.)erhöht und die Fläche der exponierten Trägermaterialien verringert wird. elektrolyten. In der Praxis wird die streunende Kapazität eines typischen Instruments (ca. 2 pF) das Rauschen für Membranen mit einem Durchmesser von 1 Mikron bis 5 Mikron begrenzen. Dies stellt die Einschränkung der Methode dar. Beispielsweise kann der Nachweis kleiner und hochgeladener Einzelmoleküle aufgrund ihrer relativ kurzen Verweilzeiten eine Herausforderung darstellen.
Der Mechanismus, mit dem Druck die Steuerung des Kanaleinschubs ermöglicht, ist nicht vollständig verstanden. Die Quarzmikrokapillaren haben einen sehr kleinen Durchmesser, auf dem die Membran gebildet wird. Durch Druck wird die Membran wölbt (wodurch die Membranoberfläche erhöht wird) und möglicherweise die Membran dünn. Beide Effekte würden die Geschwindigkeit erhöhen, mit der sich Kanäle in der Membran bilden. Wenn sich spontan ein einzelner Kanal bildet, reduzieren Sie den Druck, um das Einsetzen zusätzlicher Kanäle zu verhindern. Die Entfernung des nicht eingelegten HLaus der schüttelhaltigen Phase ist nicht erforderlich, wenn die HL-Konzentration ausreichend gering ist.
Die Strukturen und Ladungen von Polyoxometallaten werden derzeit mit traditionellen analytischen Chemietechniken untersucht, einschließlich NMR, Ultraviolett-sichtbar, Infrarot- und Raman-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Röntgenbeugung. Wir erwarten, dass Nanoporenmessungen die Charakterisierung dieser und anderer physikalischer Eigenschaften von POMs ergänzen werden, sowie die Untersuchung ihrer Artbeiation bei geringer Konzentration, was dazu beitragen wird, den synthetischen Weg von Polyoxometalaten besser zu verstehen. gründung. Es wurde auch bereits gezeigt, dass die HLPore sogar zwischen 2 Isomen der trivacantn Keggin Form Na8HPW9O3430unterscheiden kann.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass ein membrangebundenes Protein-Nanopore verwendet werden kann, um Wolframoxid-Metallcluster (Heteropolywolframate) in Lösung mit einer einfachen hochauflösenden elektrischen Messung zu erkennen und zu charakterisieren. Die Sensibilität, die dieser neuartige Ansatz bietet, ermöglicht die Verfolgung subtiler Unterschiede in der POM-Struktur, die bei unterschiedlichen pH-Werten bei Konzentrationen auftreten, die wesentlich niedriger sind (> 70-fach) als bei herkömmlichen Methoden wie NMR erforderlich. Spektroskopie. Durch die Einzelmoleküldetektionsfähigkeit von Nanoporen kann die tatsächliche Nachweisgrenze in der Methode durch die Messung des Stroms für längere Zeiten (die Erfassungsrate im Verhältnis zur POM-Konzentration) wesentlich gesenkt werden.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die European Molecular Biology Organization für ein Postdoktorandenstipendium (an J.E.) und ein Stipendium des NIH NHGRI (an J.J.K.). Wir schätzen die Hilfe der Professoren Jingyue Ju und Sergey Kalachikov (Columbia University) für die Bereitstellung heptamerischer HL und für inspirierende Diskussionen mit Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
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