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Chemistry

Caractérisation physique à haute résolution des nanoparticules métalliques uniques

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58257
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,3
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour détecter les grappes d'oxygène métalliques discrets, les polyoxométalates (POM), à la limite de molécule unique utilisant une plate-forme électronique nanopore biologique. La méthode fournit une approche complémentaire aux outils traditionnels de chimie analytique utilisés dans l'étude de ces molécules.

Abstract

Les molécules individuelles peuvent être détectées et caractérisées en mesurant le degré par lequel elles réduisent le courant ionique qui circule à travers un seul porre à l'échelle nanométrique. Le signal est caractéristique des propriétés physicochimiques de la molécule et de ses interactions avec le pore. Nous démontrons que le nanopore formé par la protéine bactérienne exotoxine Staphylococcus aureus alpha hémolysine (HL) peut détecter des polyoxométalates (POM, amas d'oxygène métallique anionique), à la limite de la molécule unique. En outre, les produits multiples de dégradation de l'acide 12-phosphotungstic POM (PTA, H3PW12O40) dans la solution sont simultanément mesurés. La sensibilité à une seule molécule de la méthode des nanopores permet de caractériser les POM à des concentrations significativement inférieures à celles requises pour la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique pourrait servir de nouvel outil pour les chimistes pour étudier les propriétés moléculaires des polyoxométals ou d'autres amas métalliques, pour mieux comprendre les processus synthétiques POM, et peut-être améliorer leur rendement. Hypothétiquement, l'emplacement d'un atome donné, ou la rotation d'un fragment dans la molécule, et l'état d'oxydation du métal pourraient être étudiés avec cette méthode. En outre, cette nouvelle technique a l'avantage de permettre la surveillance en temps réel des molécules en solution.

Introduction

La détection des analytes biomoléculaires au niveau d'une seule molécule peut être effectuée en utilisant des nanopores et en mesurant les modulations de courant ionique. Typiquement, les nanopores sont divisées en deux catégories en fonction de leur fabrication : biologique (auto-assemblé à partir de protéines ou d'origami d'ADN)1,2,3, ou à l'état solide (parexemple,fabriqué avec outils de traitement des semi-conducteurs)4,5. Alors que les nanopores à l'état solide ont été suggérées comme potentiellement plus robustes physiquement et peuvent être utilisées sur un large éventail de conditions de solution, les nanopores protéiques offrent jusqu'à présent une plus grande sensibilité, une plus grande résistance à l'encrassement, une plus grande bande passante, une meilleure sélectivité, et un rapport signal/bruit plus élevé.

Une variété de canaux ioniques protéiques, tels que celui formé par Staphylococcus aureus -hémolysine , peut être utilisé pour détecter des molécules uniques, y compris les ions (parexemple, Het D)2,3, polynucléotides (ADN et ARN)6,7,8, ADN endommagé9, polypeptides10, protéines (pliées et dépliées)11, polymères (polyéthylène glycol et autres)12,13 , 14, nanoparticules d'or15,16,17,18,19, et d'autres molécules synthétiques20.

Nous avons récemment démontré que le nanopore de la LH peut également facilement détecter et caractériser les amas métalliques, les polyoxométalates (POM), au niveau d'une seule molécule. Les POM sont des grappes d'oxygène métalliques anioniques discrètes qui ont été découvertes en 182621,et depuis lors, beaucoup plus de types ont été synthétisés. Les différentes tailles, structures et compositions élémentaires des polyoxométals qui sont maintenant disponibles ont conduit à un large éventail de propriétés et d'applications, y compris la chimie22,23, catalyse24, science des matériaux25 ,26, et la recherche biomédicale27,28,29.

La synthèse de POM est un processus d'auto-assemblage typiquement effectué dans l'eau en mélangeant les quantités stoichiométriques exigées des sels de métal monomeric. Une fois formés, les POM présentent une grande diversité de tailles et de formes. Par exemple, la structure de polyanion de Keggin, XM12O40q- est composée d'un hétéroatom (X) entouré de quatre oxygènes pour former un tétraèdre (q est la charge). L'hétéroatome est situé au centre d'une cage formée par 12 unités octaèdres MO6 (où les métaux de transition M dans leur état d'oxydation élevé), qui sont liés les uns aux autres par les atomes d'oxygène partagés voisins. Tandis que la structure de polyoxometalates de tungstène est stable dans des conditions acides, les ions hydroxydes mènent au clivage hydrolytique des liaisons métal-oxygène (M-O)30. Ce processus complexe entraîne la perte d'une ou de plusieurs sous-unités octaèdres MO 6, entraînant la formation d'espèces monovacants et trivacantes et, éventuellement, la décomposition complète des MA. Notre discussion ici se limitera aux produits de décomposition partielle de l'acide 12-phosphotungstic au pH 5.5 et 7.5.

L'objectif de ce protocole est de détecter des grappes d'oxygène métalliques discrètes à la limite d'une seule molécule à l'aide d'une plate-forme électronique biologique à base de nanopore. Cette méthode permet la détection des amas métalliques en solution. Plusieurs espèces en solution peuvent être discriminées avec une plus grande sensibilité que les méthodes analytiques conventionnelles33. Avec elle, les différences subtiles dans la structure de POM peuvent être élucidées, et à des concentrations nettement inférieures à celles exigées pour la spectroscopie de RMN. Fait important, cette approche permet même la discrimination des formes iomériques de Na8HPW9O341.

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Protocol

Note: Le protocole ci-dessous est spécifique au système Nanopatch DC electronic BioSciences (EBS). Cependant, il peut être facilement adapté à d'autres appareils d'électrophysiologie utilisés pour mesurer le courant à travers les membranes bicouches lipidiques planaires (chambre standard de membrane bicouche lipidique, géométrie u-tube, microcapillés tirés, etc.). L'identification des matériaux commerciaux et de leurs sources est donnée pour décrire les résultats expérimentaux. En aucun cas cette identification n'implique une recommandation du National Institute of Standards and Technology, ni qu'elle n'implique que les matériaux sont les meilleurs disponibles.

1. Préparation de solution et d'analyte

  1. Préparer toutes les solutions d'électrolytes avec de l'eau de 18 cm d'eau provenant d'un système de purification de l'eau de type 1 pour éliminer les traces d'espèces organiques, puis filtrer toutes les solutions d'électrolytes à l'intérieur d'un filtre à vide de 0,22 m immédiatement avant les enregistrements des canaux ioniques.
    Note: La qualité de l'eau est un facteur essentiel pour la stabilité et la longévité du système de nanopore membranaire.
  2. Type sauvage 'HL'.
    1. Suivez les précautions du SMDlors lors de la manipulation de la protéine toxine de la LSH.
    2. Mélanger la poudre monomérique monomérisée de type sauvage S. aureus etla poudre d'hémolyse avec 18 cm d'eau à 1 mg/mL. Distribuer de 10 à 30 aliquots l'échantillon dans des trompes de centrifugeuse cryo-sécuritaires, rapidement clignoter dans de l'azote liquide et ensuite stocker à -80 oC. Alternativement, utilisez l'heptameric préformé purifié HL31.
  3. Dissoudre le lipide 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhyPC) à 0.2 mg/mL dans n-decane dans un flacon de scintillation en verre de 4 ml avec un capuchon polytetrafluoroethyleneeflon-enduit. Conserver la solution à 4 oC pour une utilisation répétée jusqu'à un mois.
  4. Préparer des solutions d'acide phosphotungstique.
    1. Suivez les précautions MSDS lors de la manipulation de la poudre d'acide phosphotungstic et préparer une solution de stock d'acide phosphotungstic 2 mM en dissolvant 57,6 mg de H3PW12O40 en 10 ml d'un NaCl 1 M et 10 mM NaH2PO4 solution, qui constitue la solution de stock.
    2. Prenez 5 ml de cette solution et ajustez le pH à 5,5 avec 3 M NaOH. Ajuster le pH des 5 ml de la solution de stock à 7,5 avec 3 M NaOH.
      Note: Au pH 5.5, l'acide 12-phosphotungstic (PTA, H3PW12O40) se décompose principalement dans l'anion monovacant [PW11O39]7-.

2. Assemblage de cellules d'essai

  1. Assembler la cellule d'essai selon les instructions du fabricant.
  2. Faire tremper un fil Ag/AgCl dans de l'eau de Javel (hypochlorite de sodium) pendant 10 minutes après l'avoir abrasé avec du papier de verre de 600 grains. Placez l'électrode à l'intérieur de la membrane de quartz nanopore (QNM).
  3. Placez une électrode cylindrique de granule AgCl encastrée dans un fil d'argent à l'extérieur du QNM.
  4. Une fois la cellule d'essai mise en place, activez le programme d'alimentation et d'acquisition de données. Assurez-vous que la lecture actuelle DC est 0 pA en l'absence de solution dans la cellule d'essai.
  5. Utilisez une seringue reliée à la cellule d'essai via une ligne fluide pour ajouter une solution d'électrolyte tamponnée au-dessus de la face du QNM et pour s'assurer que le courant ionique sature l'amplificateur. Si ce n'est pas le cas, le QNM peut être obstrué. Appliquer une tension pop (no 1 V) et/ou une pression supérieure à 300 mm Hg pour l'effacer. Si cela fonctionne, réduire la tension et la pression.

3. Formation de bicouches lipidiques

  1. Remplissez la solution dans la cellule de test afin que le niveau de solution soit bien au-dessus de la face du QNM. Ensuite, abaissez le niveau de la solution par seringue au-dessous de la face, de sorte que le courant diminue à zéro.
  2. Trempez une pointe de pipette de 10 l dans le flacon lipidique. Poussez sur l'extrémité arrière de la pointe de la pipette et appuyez sur le côté de la fiole pour enlever tous les lipides visibles.
  3. Touchez la pointe de la pipette sur l'interface air-eau de la solution dans la cellule d'essai lorsque le niveau de la solution est au-dessus du visage du QNM et attendez de deux à cinq minutes que le lipide se propage uniformément.
  4. Abaissez lentement le niveau de solution sous la face du QNM jusqu'à ce que le courant sature, puis augmentez lentement le niveau de la solution au-delà de la face du QNM pour former une membrane bicouche lipidique.
    1. Une fois qu'un bicouche semble se former(c.-à-d. quand le courant va à zéro), essayez de le faire éclater plusieurs fois en augmentant la pression et assurez-vous que le QNM n'est pas obstrué. Pour réformer la membrane bicouche lipidique, abaissez le niveau de solution sous la face du QNM et augmentez-le lentement.
  5. Si la membrane bicouche lipidique ne s'est pas formé la première fois, abaissez la solution sous le visage et soulevez-la à nouveau. S'il ne se forme pas après 3 essais, ajoutez plus de lipides comme décrit dans 3.2 et 3.3.
  6. Après avoir formé une membrane, définir le décalage actuel à zéro lorsque le potentiel appliqué est nul.

4. Formationde pore de HL

  1. Ajouter 2,5 ng d'échantillon de protéines heptamériques préformés purifiés (ou 250 ng de monomérique) à la cellule d'essai (volume de 200 oL) pour permettre la formation du canal.
  2. Augmenter la pression sur la bicouche avec une seringue étanche au gaz (Figure 1) après la formation d'une couche bicouche, pour élargir la membrane du QNM et faciliter l'insertion de nanopores. Augmenter la pression arrière appliquée généralement entre 40 et 200 mmHg, selon chaque QNM.
    Note: Le logiciel EBS a une fonction d'insertion automatisée qui applique un biais plus élevé (généralement 200 à 400 mV) pour induire la formation de pores, puis réduit automatiquement la tension désirée au biais de mesure une fois qu'un seul canal se forme.
  3. Après la formation d'un nanopore, réduire la pression arrière à environ la moitié de la pression d'insertion. Si plusieurs canaux sont observés, retirez-les en réduisant considérablement la pression.

5. Partitionnement de cluster métallique dans le Nanopore

  1. Pour tenir compte des déséquilibres des électrodes, définir la tension de compensation DC de telle sorte que lorsque le potentiel appliqué est réglé à zéro, il n'y a pas de courant mesuré.
  2. Avant d'ajouter l'échantillon de POM, effectuez une expérience de contrôle pour vous assurer qu'il n'y a pas de contaminants(p. ex.,trace zappons provenant d'une expérience précédente) dans le réservoir. Plus précisément, acquérir une trace de courant ionique sous un potentiel appliqué de 120 mV à -120 mV en l'absence de POM s'il n'y a pas de POM pour vérifier qu'il n'y a pas de blocus spontané actuel.
    Note: En raison de la structure asymétrique du canal de la LH (Figure 1), le magnitute du courant ionique variera pour les potentiels appliqués positifs et négatifs. Le rapport du courant mesuré au-dessus de cette tension appliquée est indicatif de l'orientation du nanopore HL dans la membrane.
  3. Ajouter l'échantillon de POM en rinçant le réservoir avec une solution métallique à grappes métalliques à une concentration de 1 à 5 mm. Vous pouvez également charger l'échantillon dans le capillaire avant l'assemblage cellulaire afin d'étudier le cloisonnement des POM à l'autre extrémité du canal de la LH.
  4. Enregistrez le courant ionique à l'aide du logiciel du fabricant pour détecter les blocages actuels transitoires causés par le cloisonnement des POM individuels dans le nanopore. Estimer les propriétés physiques et chimiques de la molécule à partir de la profondeur de blocus du courant ionique, de la fréquence des événements et de la répartition du temps de résidence des blocus.

6. Enregistrements et analyse de données ionchannel

  1. Acquérir les mesures ioniques de la série temporelle actuelle à l'aide d'un amplificateur à haut bruit et d'un système d'acquisition de données. Effectuer les mesures à une tension appliquée de -120 mV (par rapport au côté cis canal) pour chaque pH.
  2. Appliquer un filtre Bessel à faible passage de 100 kHz 8 pôles au signal, qui est ensuite numérisé à 500 kHz (soit 2 ms/point). Extraire les événements de la série chronologique et analyser les événements à l'aide de l'algorithme ADEPT dans le logiciel MOSAIC 32,33.

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Representative Results

Au cours des deux dernières décennies, des pores à l'échelle nanométrique de protéines membranaires ont été démontrés comme des capteurs polyvalents à une seule molécule. Les mesures basées sur les nanopors sont relativement simples à exécuter.  Deux chambres remplies de solution d'électrolyte sont séparées par un nanopore intégré dans une membrane lipidique isolante électrique. Un amplificateur de patch-clamp ou une alimentation externe offre un potentiel électrostatique à travers le nanopore via des électrodes Ag/AgCl immergées dans les réservoirs d'électrolytes. Le champ électrique entraîne des particules chargées individuelles dans le pores, ce qui produit des réductions transitoires du courant ionique qui dépendent de la taille, de la forme et de la charge des particules. Un programme informatique contrôle la tension appliquée et surveille, en temps réel, les blocages de courant ionique s'explique par le cloisonnement réversible des molécules dans les pores. Le courant est amplifié et converti en tension avec un transistor à faible bruit et à fort effet d'impédance et numérisé à l'aide d'une carte d'acquisition de données.

Ici, nous fournissons une procédure générale pour détecter les polyoxométalates avec un nanopore biologique. Comme on le voit à la figure 2, avant l'ajout de POM, le canal non obstrué a un courant de canal ouvert moyen de 100 pA à un potentiel appliqué de -120 mV. L'ajout de POM produit des blocages transitoires et diminue le courant ionique d'environ 80%. Comme prévu, parce que ces particules sont chargées négativement, les blocages ne sont pas observés lorsque la polarité du potentiel appliqué est inversée. Notez que si les POM n'interagissaient pas avec la paroi des pores, ils se diffuseraient à travers les pores en environ 100 ns, ce qui est beaucoup trop bref pour être détecté avec un amplificateur de pince à patch classique. Ainsi, la plupart du temps qu'une particule donnée passe dans le pores est une conséquence directe de l'interaction entre la particule et le pore. La durée d'un événement de blocus en cours ionique est définie comme le temps de résidence, tau.

Pour illustrer l'utilité de cette méthode, nous discutons de l'utilisation d'un nanopore de HL pour surveiller la décomposition de l'acide 12-phosphotungstic (PTA, H3PW12O40) au pH 5.5 et pH 7.5. Cette décomposition peut être observée avec 31mesures De rmN P, mais la concentration nécessaire est de 2 mM tandis que les mesures nanopore nécessitent moins de 30 M, en raison de la sensibilité de mesure nanopore. Au pH 5.5, [PW11O39]7- est l'espèce prédominante30.

L'analyse des données est effectuée en calculant un histogramme du rapport relatif de profondeur de blocus(c.-à-d.,'lt;i'lt;io'gt;où 'lt;i'gt; est le courant moyen avec le POM dans le pore et 'lt;io Le courant de canal ouvert moyen est-il le courant de canal ouvert moyen). L'histogramme des rapports de profondeur de blocus actuels moyen à -120 mV et pH 5,5 montre un pic mineur à 'lt;i'gt;/lt;io'gt; '0.06 et pic majeur à 'lt;i 'gt; , vert). Nous supposons que ces pics correspondent à [P2W5O23]6- et [PW11O39]7-, respectivement, sur la base de 31P NMR. 31 Ans, états-unis ( Les études de RmN P suggèrent que l'augmentation du pH modifie la concentration relative de ces deux espèces, ce qui est confirmé par le changement dans la zone des deux pics indiqués à la figure 3.

Lorsque la solution POM est titrée au pH 7,5 ex situ, la concentration totale de POM diminue en raison de la dégradation partielle des deux espèces principales en sels inorganiques (c.-à-d. phosphate libre, HxPO4 et tungstate, WO42ions). L'histogramme du rapport relatif de profondeur de blocus montre également deux pics principaux (Figure 3, orange), mais avec 20 fois moins d'événements (ce qui suggère que la concentration totale de POM au pH 7,5 est environ 20 fois inférieure à celle du pH 5,5, si le l'efficacité de capture de nanopore pour les POM est la même aux deux valeurs de pH). Il est intéressant de noter qu'au pH 7,5 et plus, les espèces de POM observées ici n'ont pas été détectées dans le spectre de 31P RmN en raison de leur faible concentration causée par leur dissociation en phosphate et en ions tungstate.

Le temps de résidence de chaque événement dans le pores est défini par la durée des blocages courants ioniques individuels. La répartition des temps de résidence donne un aperçu des différentes espèces présentes. Il a été démontré plus tôt que pour les blocages causés par un polymère de taille différente de poly (éthylène glycol), la répartition du temps de résidence pour chaque taille de ce polymère est bien décrite par un seul exponentiel. Ce résultat suggère que l'interaction de ce polymère est une simple réaction chimique réversible12,13,20.

La figure 4 montre que les répartitions du temps de résidence pour les deux sommets ont été bien différenciées au pH 5,5 et 7,5. Deux caractéristiques sont claires. Tout d'abord, dans toutes les conditions, de multiples exponentiels sont nécessaires pour s'adapter à chacune des distributions, ce qui suggère qu'il existe des variations des POM au sein de chaque espèce. Deuxièmement, les temps de résidence des POM dans les pores sont beaucoup plus courts au pH 7,5 par rapport à ceux du pH 5,5, ce qui suggère un affaiblissement de l'interaction entre les pores et les POM. Il a été démontré précédemment qu'un changement de pH modifie le nombre relatif de charges fixes dans ou près du lumen du canal HL. Ces changements modifieront directement les interactions avec les POM de partitionnement à l'intérieur du pore et modifieront donc leurs temps de résidence34,35.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique de la configuration expérimentale. Méthode pour la caractérisation à base de nanopore des molécules individuelles de polyoxometalate. Un nanopore protéique qui s'auto-assemble dans une membrane bicouche lipidique de 4 nm d'épaisseur est baigné par des solutions d'électrolytes aqueuses dans un réservoir capillaire en verre et plus grand. Une pression est appliquée sur le capillaire en verre avec une seringue étanche au gaz pour faciliter l'incorporation des nanopores. Un V potentiel est appliqué à travers la membrane avec une paire assortie d'électrodes Ag/AgCl et conduit un courant ionique (parexemple,Na et Cl-) à travers le pore. Le courant est converti en tension avec un amplificateur à haute impédance, numérisé avec un convertisseur analogique au convertisseur numérique (ADC) et stocké sur un ordinateur. Le logiciel informatique contrôle le potentiel appliqué à l'aide d'un convertisseur numérique à analogique (DAC) et surveille, en temps réel, les blocages actuels transitoires causés par des molécules uniques qui se divisent dans le pore. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Détection à base de nanopore des metallo-nanoparticules individuelles. Une illustration des traces ioniques de série de temps de courant qui se produisent avant et après l'ajout d'une solution de POM à l'appareil de nanopore. Le partitionnement des POM anioniques individuels dans le pore provoque des réductions de courant transitoires dans le courant de pores ouverts moyen, lt;io'gt;.  (Droite) Un événement typique, illustrant le courant moyen du blocus (lt;i'n.) et le temps de résidence () de la particule dans le pores. Le potentiel appliqué était de -120 mV, et les solutions contenaient 1 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 au pH 5,5. Le compartiment cis contenait également 30 M d'acide phosphotungstic de 12.m. Le rapport de profondeur actuel du blocus (lt;i'' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Dans les conditions que nous avons utilisées ici, le canal de la LH n'est pas à l'aise (spontanément fermé) lorsque les POM ne sont pas présents. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Histogrammes du rapport de profondeur actuel du blocus au pH 5,5 et 7,5. Histogrammes du rapport de profondeur de blocus ionique induit par le POM au pH 5.5 (vert) et 7,5 (orange) avec un potentiel appliqué V - -120 mV. Les deux pics présents à chaque valeur de pH correspondent aux espèces plusiades prédominantes connues en solution dans ces conditions. Les rapports de profondeur de blocus actuels de 0 et 1 correspondent à un pore entièrement bloqué et ouvert, respectivement. Les histogrammes ont été créés avec une largeur de bac de 0,001 et normalisés à des comptes / s en divisant par le temps d'acquisition de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Répartition du temps de résidence et ajustement avec plusieurs exponentiels. La répartition des temps de résidence pour les blocus actuels induits par le POM causés par les deux espèces principales (pics 1 et 2 à la figure 4) observées au pH 5,5 et 7,5 dans une parcelle semi-log. Pour les deux espèces, les temps de résidence sont nettement plus courts à la valeur de pH plus élevée, ce qui suggère que l'interaction entre les pores et les POM a changé. Les lignes solides sont des ajustements d'un modèle de mélange exponentiel aux données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

En raison de leur charge anionique, les POM s'associent probablement aux contre-cations organiques par des interactions électrostatiques. Par conséquent, il est important d'identifier les conditions de solution appropriées et les bons environnements électrolytes (en particulier les cations en solution) pour éviter la formation complexe avec les POM. Une attention particulière est requise dans le choix de la mémoire tampon. Par exemple, le taux de capture des POM avec tris (hydroxyméthyl)aminométhane et les solutions tamponnés par l'acide citrique est significativement inférieur à celui de la solution tamponnée de phosphate, probablement parce que l'un ou l'autre des deux premiers tampons forme un complexe avec le POM qui ne fortement interagir avec le nanopore. En outre, l'électrolyte NaCl a été utilisé à dessein à la place de KCl (ainsi que les autres métaux alcalins) pour éviter la précipitation de [PW11O39]7- par K.

La capacité de mesurer le courant à une bande passante suffisamment élevée est essentielle à la mesure précise des distributions de temps de résidence. Par exemple, avec les temps de résidence distribués de façon exponentielle, il y a beaucoup plus de blocages avec des temps de résidence courts que longs, et une estimation précise des répartitions du temps de résidence est mieux réalisée en recueillant beaucoup de données(c.-à-d., l'acquérir à un niveau aussi élevé qu'une bande passante permet la capacité électrique du système). Pour atteindre cette condition dans la spectroscopie nanopore, la capacité du système (membrane et capacité errante) doit être réduite au minimum. La capacité de Stray est réduite en diminuant la longueur de tous les câbles de raccordement et en utilisant des contacts électriques de haute qualité. La capacité de membrane est réduite au minimum en diminuant la surface du bilayer, en augmentant l'épaisseur des matériaux de soutien(c.-à-d., quartz, polytetrafluoroéthylène, etc.),et en diminuant la zone des matériaux de support exposés à l'électrolyte. Dans la pratique, la capacitance errante d'un instrument type (2 pF) limitera le bruit des membranes de 1 micron à 5 microns de diamètre. Cela constitue la limitation de la méthode. Par exemple, la détection de molécules individuelles petites et très chargées peut être difficile en raison de leur temps de résidence relativement court.

Le mécanisme par lequel la pression permet le contrôle de l'insertion du canal n'est pas complètement compris. Les microcapillaires de quartz ont un très petit diamètre sur lequel la membrane est formée. L'application de la pression entraînera le renflement de la membrane (augmentant ainsi la surface de la membrane) et peut-être éclaircir la membrane. Les deux effets augmenteraient la vitesse à laquelle les canaux se formeront dans la membrane. Lorsqu'un seul canal se forme spontanément, réduisez la pression pour empêcher l'insertion de canaux supplémentaires. L'élimination de la HL non insérée de la phase aqueuse en vrac n'est pas nécessaire si la concentration de HL est suffisamment faible.

Les structures et les charges des polyoxométals sont actuellement étudiées à l'aide de techniques traditionnelles de chimie analytique, y compris la RMN, la spectroscopie infrarouge et raman, la spectrométrie de masse et la diffraction des rayons X. Nous nous attendons à ce que les mesures des nanopores complètent la caractérisation de ces propriétés physiques et d'autres des POM, ainsi que l'étude de leur spéciation à faible concentration, ce qui aidera à mieux comprendre la voie synthétique des polyoxométals formation. Il a également été démontré précédemment que le pore HL peut même distinguer entre 2 isomères de la forme trivacant Keggin Na8HPW9O3430.

En résumé, nous avons montré qu'un nanopore de protéine membranaire peut être utilisé pour détecter et caractériser les amas métalliques d'oxyde de tungstène (hétéropolytungstates) en solution utilisant une mesure électrique simple à haute résolution. La sensibilité offerte par cette nouvelle approche permet de suivre les différences subtiles dans la structure du POM qui se posent à différentes valeurs de pH à des concentrations qui sont sensiblement inférieures (-gt; 70 fois) que requises pour les méthodes traditionnelles telles que la RMN Spectroscopie. En raison de la capacité de détection des nanopores à une seule molécule, la limite réelle de détection dans la méthode peut être rendue beaucoup plus faible en mesurant le courant pendant de plus longues périodes (les échelles de taux de capture proportionnellement à la concentration de POM).

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Disclosures

aucun.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de l'Organisation européenne de biologie moléculaire pour une bourse postdoctorale (à J.E.) et une subvention du NHGRI des NIH (à J.J.K.). Nous apprécions l'aide des professeurs Jingyue Ju et Sergey Kalachikov (Université Columbia) pour avoir fourni l'heptameric HL, et pour des discussions inspirantes avec le professeur Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanopatch DC System Electronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAK Millipore vacuum filter
1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850356P
Decane, ReagentPlus, ≥99%, Sigma-Aldrich D901
αHL List Biological Laboratories, Campbell, CA
Ag wire Alfa Aesar
2 mm Ag/AgCl disk electrode In Vivo Metric E202
High-impedance amplifier system Electronic Biosciences, San Diego, CA
quartz capillaries
custom polycarbonate test cell
Data Processing and Analysis MOSAIC https://pages.nist.gov/mosaic/
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 455970
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507

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References

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Chimie Numéro 148 Nanopore -Hémolysine Bilayer lipidique Analyse monomolécule Polyoxometalates Isomers
Caractérisation physique à haute résolution des nanoparticules métalliques uniques
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Ettedgui, J., Forstater, J., Robertson, J. W., Kasianowicz, J. J. High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (148), e58257, doi:10.3791/58257 (2019).

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