Summary
ここでは、生物学的ナノポアベースの電子プラットフォームを用いて、単一分子限界で離散金属酸素クラスター、ポリオキソメタレート(POM)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、これらの分子の研究に使用される従来の分析化学ツールに対する補完的なアプローチを提供する。
Abstract
個々の分子は、単一ナノメートルスケールの細孔を流れるイオン電流を減少させる程度を測定することによって検出され、特徴付けることができる。このシグナルは、分子の物理化学的性質と細孔との相互作用の特徴です。細菌タンパク質エキソトキシン黄色ブドウ球菌αヘモリシン(αHL)によって形成されたナノポアが、単一分子限界でポリオキソメタレート(POM、アニオン金属酸素クラスター)を検出できることを実証する。また、溶液中の12-ホスホトンスチン酸POM(PTA、H3PW12O40)の複数の分解産物を同時に測定する。ナノポア法の単一分子感度により、核磁気共鳴(NMR)分光法に必要な濃度よりも有意に低い濃度でPOMを特徴付けることができます。この技術は、ポリオキソメタレートや他の金属クラスターの分子特性を研究し、POM合成プロセスをよりよく理解し、その収率を向上させる化学者のための新しいツールとして役立つ可能性があります。仮定的には、所定の原子の位置、または分子内の断片の回転、および金属酸化状態をこの方法で調べることができる。さらに、この新しい技術は、溶液中の分子のリアルタイムモニタリングを可能にするという利点があります。
Introduction
単一分子レベルでの生体分子検体の検出は、ナノポアを用いてイオン電流変調を測定することによって行うことができる。典型的には、ナノポアは、その製造に基づいて2つのカテゴリーに分けられます:生物学的(タンパク質またはDNA折り紙から自己組み立て)1、2、3、または固体(例えば、で製造された)半導体加工ツール)4,5.固体ナノポアは、潜在的により物理的に堅牢であると示唆され、溶液条件の広い範囲にわたって使用することができますが、タンパク質ナノポアは、これまでのところ、より大きな感度、ファウリングに対するより多くの耐性、より大きな帯域幅、より良い化学薬品を提供します選択性、およびノイズ比に大きな信号。
黄色ブドウ球菌α-ヘモリシン(αHL)によって形成されたタンパク質イオンチャネルの様々な、イオン(例えば、H+およびD+)2、3、ポリヌクレオチド(DNA)を含む単一分子を検出するために使用することができるおよびRNA)6,7,8, 損傷したDNA9, ポリペプチド10, タンパク質 (折り畳みおよび展開)11, ポリマー (ポリエチレングリコール他)12,13,14、金ナノ粒子15、16、17、18、19、および他の合成分子20。
我々は最近、αHLナノポアが単一分子レベルで金属クラスター、ポリオキソメタレート(POM)を容易に検出し、特徴付けできることを実証した。POMは、182621年に発見された離散ナノスケールのアニオン金属酸素クラスターであり、それ以来、より多くのタイプが合成されています。現在利用可能なポリオキソメタレ酸塩の異なるサイズ、構造、および元素組成物は、化学22、23、触媒24、材料科学25を含む特性と用途の広い範囲につながった ,26, および生物医学研究27,28,29.
POM合成は、典型的には、単量の単量の単量のモノメリック金属塩を混合して水中で行われる自己組織化プロセスである。一度形成されると、POMはサイズと形状の大きな多様性を示します。例えば、ケギンポリアニオン構造は、XM12O40q-が四重子を形成する4つの酸素で囲まれた1つのヘテロ原子(X)から構成され(qは電荷である)。ヘテロ原子は、12オクタヘドラルMO6単位(M=高酸化状態の遷移金属)によって形成されたケージ内に中央に位置し、隣接する共有酸素原子によって互いに連結される。タングステンポリオキソメタレーション構造は酸性条件下で安定であるが、水酸化物イオンは金属酸素(M-O)結合30の加水分解切断につながる。この複雑なプロセスは、1つ以上のMO6オクタヘドラルサブユニットの損失をもたらす,単空および三空種の形成につながり、最終的にはPOMの完全な分解につながる。ここでの議論は、pH 5.5および7.5における12-ホスホトン酸の部分分解産物に限定される。
このプロトコルの目的は、生物学的ナノポアベースの電子プラットフォームを使用して、単一分子限界で離散的な金属酸素クラスターを検出することです。この方法は、溶液中の金属クラスターの検出を可能にする。溶液中の複数の種は、従来の分析方法33よりも高い感度で判別することができる。それにより、POM構造の微妙な違いを解明することができ、NMR分光法に必要な濃度よりも著しく低い濃度で。重要なことに、このアプローチは、Na8HPW9O341の対方体形態の差別を可能にする。
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Protocol
注:以下のプロトコルは、電子バイオサイエンス(EBS)ナノパッチDCシステムに固有です。しかしながら、平面脂質二重層膜(標準脂質二重層膜室、U管幾何学、引っ張られた微小キャピラーなど)を介して電流を測定するために用いられる他の電気生理学装置に容易に適合させることができる。実験結果を記述するために、商業材料とその供給源の同定が与えられる。この識別は、国立標準技術研究所による勧告を意味するものではなく、また、材料が利用可能な最良であることを意味するものではありません。
1. ソリューションと解数の準備
- Type-1浄水システムから18 MΩ-cmの水を使用したすべての電解質溶液を準備して、微量有機種を除去し、イオンチャネル記録の直前に0.22 μmの真空フィルターを通してすべての電解質溶液をろ過します。
注:水質は、膜ナノポア系の安定性と寿命の重要な要因です。 - ワイルドタイプαHL。
- αHL毒素タンパク質を取り扱う場合は、MSDS の注意事項に従ってください。
- 凍結乾燥した野生型単体S.アウレウス-ヘモリシン(α HL)粉末を1mg/mLで18 MΩ-cmの水と混合します。サンプルの10~30μLのアリコートを凍結安全な遠心管に分配し、液体窒素中で素早く凍結し、-80°Cに保存します。あるいは、精製前形成ヘプタメリックαHL31を用いる。
- 脂質1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhyPC)をn-デカン中0.2mg/mLにポリテトラフルオロエロチレンフロンコーティングキャップで4mLガラスシンチレーションバイアルで溶解する。溶液を4°Cで保存し、最大1ヶ月間繰り返し使用してください。
- ホスホトン酸溶液を調剤する。
- ホスホトン酸粉末を取り扱う場合のMSDSの注意事項に従い、H3 PW12O40の57.6mgを1M NaClおよび10 mM NaH2PO4の10mLに溶解することにより、2mMホスホトン酸ストック溶液を調出す。ストックソリューションを構成するソリューション。
- この溶液の5 mLを取り、3 M NaOHでpHを5.5に調整します。ストック溶液の他の5 mLのpHを3M NaOHで7.5に調整します。
注:pH 5.5では、12-ホスホトン酸(PTA、H3PW12O40)が主に単空アニオンに分解する[PW11O 39]7-.
2. テストセルアセンブリ
- 製造元の指示に従ってテスト セルを組み立てます。
- 600グリットサンドペーパーで摩耗した後、漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム)にAg/AgClワイヤーを1本浸し、10分間浸します。石英ナノポア膜(QNM)内に電極を配置します。
- QNMの外側に銀線に埋め込まれた円筒形のAgClペレット電極を配置します。
- テストセルをセットアップしたら、電源装置とデータ集録プログラムをオンにします。テスト セルに溶液がない場合は、DC 電流読み取り値が 0 pA であることを確認します。
- 流体線を介して試験セルに接続されたシリンジを使用して、QNMの面の上に緩衝電解液を追加し、イオン電流がアンプを飽和させるようにします。そうでない場合は、QNM が詰まっている可能性があります。ポップ電圧(±1V)および/または300 mm Hgを超える圧力を加えてクリアします。それがうまくいけば、電圧と圧力を下げる。
3. 脂質二層形成
- ソリューションレベルがQNMの面をはるかに上回るように、テストセルに溶液を塗りつぶします。次に、シリンジを介して溶液レベルを顔の下に下げ、電流がゼロに減少するようにします。
- 脂質バイアルに10μLピペットチップを浸します。ピペット先端のバックエンドを押し、バイアルの側面をタップして、目に見える脂質をすべて取り除きます。
- 溶液レベルがQNMの顔の上にある場合は、テストセル内の溶液の空気水界面にピペット先端をタッチし、脂質が均一に広がるのを2~5分待ちます。
- 現在飽和するまでQNMの面より下の溶液レベルをゆっくりと下げ、次にQNMの面を越えて溶液レベルをゆっくりと上げて脂質二層膜を形成する。
- バイレイヤーが形成されると(つまり、電流がゼロになったとき)、圧力を上げて数回ポップし、QNMが詰まらないようにしてください。脂質二重層膜を改質するには、溶液レベルをQNMの面より下に下げ、ゆっくりと上げます。
- 脂質二重層膜が初めて形成されなかった場合は、顔の下の溶液を下に下げ、再び上げます。3つの試験の後に形成されない場合は、3.2および3.3に記載されているように、より多くの脂質を追加します。
- 膜を形成した後、適用電位がゼロの場合は、電流オフセットをゼロに設定します。
4. αHL細孔形成
- 精製された前形成されたα HLヘプタメリックタンパク質サンプル(または250ngのモノメリックαHL)を試験細胞に加え(体積≥200μL)チャネル形成を可能にする。
- 二重層が形成された後にガスタイトシリンジ(図1)で二層層への圧力を高め、QNMから膜を膨張させ、ナノポア挿入を容易にする。各QNMに応じて、通常40~200mmHgの間で適用される背圧を上げます。
注:EBSソフトウェアは、より高いバイアス(通常は200~400mV)を適用して細孔形成を誘導し、単一チャンネルが形成されると自動的に測定バイアスに必要な電圧を低減する自動挿入機能を備えています。 - ナノポアが形成された後、挿入圧力の約1⁄2に背圧を下げる。複数のチャネルが観察される場合は、圧力を大幅に減らしてそれらを削除します。
5. ナノポアにおける金属クラスターのパーティショニング
- 電極の不均衡を考慮して、適用電位がゼロに設定されている場合に測定電流が発生しないようなDCオフセット電圧を設定します。
- POMサンプルを追加する前に、制御実験を行い、貯留所に汚染物質(例えば、前の実験からPOMをトレースする)がないことを確認します。具体的には、任意のPOMがない場合に+120 mVから-120 mVの適用電位の下でイオン電流トレースを取得し、自発的な電流遮断が存在しないことを確認します。
注:αHLチャネル(図1)の非対称構造により、イオン電流のマグニテは正と負の印電位で異なります。この印加電圧を上回る測定電流の比率は、膜中のαHLナノポアの配向を示す。 - 1~5mM濃度で金属クラスター溶液でリザーバを洗い流してPOMサンプルを追加します。あるいは、細胞集合の前にサンプルを毛細血管にロードし、αHLチャネルのもう一方の端へのPOMの分割を調べたい。
- 製造元のソフトウェアを使用してイオン電流を記録し、個々のPOMをナノポアに仕切ることによって引き起こされる一時的な電流遮断を検出します。イオン電流遮断深さ、事象頻度、および封鎖の滞留時間分布から分子の物理的および化学的特性を推定する。
6. イオンチャンネルの記録とデータ分析
- 高インピーダンス、低ノイズアンプ、データ集録システムを使用して、イオン電流時系列測定を取得します。各pHに対して-120 mV(チャネルシス側に対して)の印加電圧で測定を行います。
- ローパス100 kHzの8極ベッセルフィルタを信号に適用し、その後500kHz(2ミリ秒/ポイント)でデジタル化します。時系列からイベントを抽出し、MOSAIC ソフトウェア パッケージ32, 33の ADEPT アルゴリズムを使用してイベントを分析します。
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Representative Results
過去20年間にわたり、膜結合タンパク質ナノメートルスケールの細孔は、汎用性の高い単一分子センサとして実証されてきました。ナノポアベースの測定は比較的簡単に実行できます。 電解質溶液で満たされた2つのチャンバーは、電気的に絶縁脂質膜に埋め込まれたナノポアによって分離される。パッチクランプアンプまたは外部電源は、電解質リザーバに浸漬されたAg/AgCl電極を介してナノポア全体に静電電位を提供します。電界は個々の荷電粒子を細孔に駆動し、粒子の大きさ、形状、電荷に依存するイオン電流の一時的な減少を生み出します。コンピュータプログラムは、印加電圧を制御し、リアルタイムで、分子が可逆的に細孔に仕切ることによって引き起こされるイオン電流遮断を制御します。電流は増幅され、低ノイズ、高インピーダンスフィールド効果トランジスタで電圧に変換され、データ集録カードを使用してデジタル化されます。
ここでは、生物学的ナノポアを用いてポリオキソメタレートを検出するための一般的な手順を提供する。図2に見られるように、POMを添加する前に、遮るもののないチャネルは、適用電位-120 mVで~100 pAの平均オープンチャネル電流を有する。POMを加えることで一時的な遮断が発生し、イオン電流が約80%減少します。予想通り、これらの粒子は負に帯電するため、適用電位の極性が逆転した場合、封鎖は観察されない。POMが細孔壁と相互作用しなかった場合、それらは約100nsで細孔を通して拡散することに注意してください。したがって、与えられた粒子が細孔に費やす時間のほとんどは、粒子と細孔との相互作用の直接的な結果である。イオン電流遮断イベントの持続時間は、滞留時間、タウ(τ)として定義されます。
この方法の有用性を説明するために、我々はpH 5.5およびpH 7.5で12-ホスホトンスチン酸(PTA、H3 PW12O40)の分解を監視するためにαHLナノポアの使用について議論する。この分解は31P NMR測定で観察できますが、ナノポア測定はナノポア測定感度が30μM未満であるのに対し、必要な濃度は2mMです。pH 5.5では、[PW11O 39]7-が優勢な種30である。
データ分析は、相対封鎖深度比のヒストグラム (つまり、<i>/< io>ここで <i> poM を持つ平均電流であり、< io)を計算することによって実行されます。> は平均オープンチャネル電流です)-120 mV および pH 5.5 の平均電流遮断深度比のヒストグラムは、<i>/<i o> 0.06 と主要ピークの/> i> ≥ 0.16 (図 3)、緑)。これらのピークは、31 P NMR に基づいて[P2W5O23]6-および[PW11O39]7-にそれぞれ対応すると仮定します。31歳P NMR研究は、pHを増加させることがこれらの2種の相対濃度を変化させることを示唆しており、これは図3に示す2つのピークの面積の変化によって生じる。
POM溶液をpH 7.5 exituに引き上げた場合、無機塩に対する2元物種の部分的な分解により総POM濃度が低下する(すなわち、フリーリン酸塩、HxPO4−3+x)タングステート、WO42-イオン)。相対封鎖深度比のヒストグラムはまた、2つの主要なピーク(図3、オレンジ)を示していますが、20倍少ない事象(pH 7.5でのPOM濃度がpH5.5の場合よりも約20倍低いことを示唆しています)POMに対するナノポアの捕捉効率は、2つのpH値で同じです)pH 7.5以上では、リン酸イオンとタングステートイオンへの解離によって引き起こされる濃度が低いため、ここで観測されたPOM種は31P NMRスペクトルでは検出されなかったことに注意してください。
細孔内の各イベントの滞留時間は、個々のイオン電流遮断の持続時間によって定義されます。滞留時間の分布は、存在する異なる種に関する洞察を提供します。ポリ(エチレングリコール)の異なるサイズのポリマーによって引き起こされる封鎖のために、そのポリマーの各サイズの滞留時間分布は、単一の指数によってよく記述されることが以前に示された。その結果は、そのポリマーの相互作用が単純な可逆的な化学反応12、13、20であることを示唆している。
図 4は、2 つのピークの滞留時間分布が pH 5.5 と 7.5 で十分に区別されたことを示しています。2つの特徴は明確である。まず、すべての条件下で、各分布に合わせて複数の指数が必要であり、各種内にPOMのバリエーションがあることを示唆しています。第二に、細孔内のPMの滞留時間はpH5.5の場合に比べてpH7.5ではるかに短く、毛穴とPM間の相互作用の弱体化を示唆している。pHの変化は、α HLチャネル内膜内のまたは近くで固定荷料金の相対的な数を変化することを以前に示されている。これらの変更は、細孔内の POM のパーティション分割とのやり取りを直接変更するため、居住時間34,35を変更します。
図1:実験セットアップの概略図。個々のポリオキソメタ酸分子のナノポアベースの特性特性を有する方法。4nmの厚い脂質二重層膜で自己集合するタンパク質ナノポアは、ガラス毛細血管と大きな貯蔵所に水性電解質溶液を浴びています。ナノポアの取り込みを助けるためにガスタイトなシリンジでガラス毛細血管に圧力がかかります。潜在的なVはAg/AgCl電極の一致したペアで膜全体に適用され、細孔を通してイオン電流(例えば、Na+およびCl-)を駆動する。電流は高インピーダンスアンプで電圧に変換され、アナログからデジタルコンバータ(ADC)にデジタル化され、コンピュータに保存されます。コンピュータソフトウェアは、デジタルからアナログコンバータ(DAC)を介して適用された電位を制御し、リアルタイムで、細孔に分割する単一分子によって引き起こされる一時的な電流遮断を監視します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:個々のメタロナノ粒子のナノポアベース検出。ナノポア装置にPOM溶液を添加する前後に発生するイオン電流時系列トレースの図。個々のアニオンPMを細孔に分割すると、平均開細孔電流、
図 3: pH 5.5 および 7.5 の現在の封鎖深度比のヒストグラム。pH 5.5 (緑)および 7.5 (オレンジ) で POM 誘発イオン電流遮断深度比のヒストグラムを適用した潜在的な V = -120 mV.各pH値に存在する2つのピークは、これらの条件下で溶液中の既知の優勢POM種に対応する。現在の封鎖深度比 0 と 1 は、それぞれ完全にブロックされた開いている細孔に対応します。ヒストグラムは、ビン幅 0.001 で作成され、データ取得時間で除算してカウント/s に正規化されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 居住時間分布と複数の指数を使用したフィッティング。半対数プロットでpH 5.5および7.5で観察された2元物種(図4のピーク1および2)によって引き起こされるPOM誘発電流遮断の滞留時間の分布。いずれの種も、pH値が高いほど滞留時間が著しく短く、毛穴とPMの相互作用が変化していることを示唆している。実線は、データに対する指数混合モデルの適合です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
そのアニオン電荷のために、POMは静電相互作用を通じて有機カチオンと関連する可能性が高い。したがって、POMとの複雑な形成を避けるためには、適切な溶液条件と適切な電解質環境(特に溶液中の陽イオン)を特定することが重要です。バッファーの選択には、特に注意が必要です。例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよびクエン酸緩衝液を用いたPOMの捕捉率は、リン酸緩衝液のそれよりも有意に低い。ナノポアと強く相互作用する。また、NaCl電解質は、KCl(および他のアルカリ金属と同様に)の代わりに意図的に使用され、[PW11O 39]7-by K+の沈殿を回避した。
滞留時間分布の正確な測定に不可欠なのは、十分に高い帯域幅で電流を測定する能力です。例えば、指数関数的に分散した居住時間では、居住時間が長い場合よりもはるかに多くの封鎖があり、多くのデータを収集することで、居住時間分布の正確な推定が得られます(システムの電気容量が可能な帯域幅と同じ高さでそれを取得する)。ナノポア分光法でこの状態を達成するためには、システム容量(膜および迷走容量)を最小限に抑える必要があります。すべての接続ケーブルの長さを減少させ、高品質の電気接点を使用することで、迷子の静電容量が減少します。膜容量は、二重層の表面積を減少させ、支持材料の厚さを増やし(石英、ポリテトラフルオロエチレンなど)、露出支持材料の面積を減少させることによって最小化される。電解質に。実際には、典型的な計測器の迷走静容量(≥2 pF)は、膜のノイズを直径1ミクロンから5ミクロンに制限します。これは、メソッドの制限を構成します。例えば、小さくて電荷の高い単一分子の検出は、比較的短い滞留時間のために困難な場合があります。
圧力がチャネル挿入の制御を可能にするメカニズムは完全には理解されていない。石英微小キャピラリーは、膜が形成される非常に小さな直径を有する。圧力をかけると、膜が膨らみ(それによって膜表面積が増加する)、膜が薄くなります。両方の効果は、チャネルが膜内で形成される速度を増加させるだろう.単一のチャネルが自発的に形成される場合は、追加のチャネルの挿入を防ぐために圧力を下げる。αHL濃度が十分に低い場合は、バルク水相からの非挿入αHLの除去は必要ない。
ポリオキソメタレートの構造と荷料金は、現在、NMR、紫外線可視、赤外線およびラマン分光法、質量分析、X線回折などの従来の分析化学技術を使用して研究されています。ナノポア測定は、POMのこれらおよびその他の物理的特性の特性を補完するだけでなく、低濃度での種分化の研究を補完し、ポリオキソメタレーゼの合成経路をよりよく理解するのに役立つことを期待しています。形成。また、αHL細孔は、三空ケギン形態Na8 HPW9O34 30の2つの性同体を区別することもできることも以前に示された。
要約すると、膜結合タンパク質ナノポアを使用して、単純な高解像度電気測定を用いて溶液中のタングステン酸化物金属クラスター(ヘテロポリタングステート)を検出し、特徴付けできることを示しました。この新しいアプローチによって与えられる感受性はNMRのような従来の方法に必要とされるより実質的に低い(>70倍)濃度で異なったpH値で起こるPOM構造の微妙な違いの追跡を可能にする分光。ナノポアの単一分子検出能力により、この方法における検出の実際の限界は、より長い時間(捕捉速度がPOM濃度に比例してスケール)を測定することによってはるかに低くすることができます。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
欧州分子生物学機構のポスドク・フェローシップ(J.E.)とNIH NHGRI(J.J.K.)からの助成金に対する財政的支援に感謝します。我々は、ヘプタメリックαHLを提供し、ジョセフ・ライナー教授(バージニア・コモンウェルス大学)との刺激的な議論のために、ジンギュエ・ジュ教授とセルゲイ・カラチコフ教授(コロンビア大学)の助けを借りて感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
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