Summary
여기 우리는 자동으로 시간과 공간에 신속 하 고 정확한 온도 변화를 생성 하는 프로그래밍 가능 온도 제어 경기장을 사용 하 여 온도 변화에 초파리 의 운동 성능을 결정 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
온도 종 배포 하 고 작동 하는 방법에 영향을 미치는 유비쿼터스 환경 요소 이다. 초파리 초파리의 다른 종은 그들의 생리 적인 포용 력과 적응성에 따라 온도 변화에 대 한 특정 응답 있다. 초파리 파리 또한 온도 감지 온도 ectotherms에 처리의 신경 기초를 이해 하는 데 기본 되는 시스템을가지고. 선물이 여기 신속 하 고 정확한 온도 변화 온도 변화에 개별 응답을 탐험을 시간적, 공간적 제어를 허용 하는 온도 제어 경기장. 개별 파리는 경기장에 배치 하 고 균일 한 점진적 증가 반응 규범을 결정 하는 온도 또는 공간적으로 분산된 온도 환경 설정을 확인 하려면 동시에 같은 전에 미리 프로그램 된 온도, 노출. 개인 자동으로 추적, 속도 위치 기본 설정의 정량화를 허용 합니다. 이 메서드는 빠르게 다양 한 초파리 의 온도 성능 곡선을 결정 하는 온도 또는 유사한 크기의 다른 곤충 응답 척도를 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 온도 환경과 돌연변이 또는 야생-타입 파리의 반응 척도를 유전자 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 열 종 분화와 적응, 뿐만 아니라 온도 처리 뒤에 신경 메커니즘의 기초를 밝히기 도울 수 있습니다.
Introduction
온도 어떻게 유기 체 기능 및1동작에 영향을 미치는 일정 한 환경 요소 이다. 위도 및 고도에 차이 유기 체 온도2,3에 대 한 답변에 대 한 진화 선택이 결과에 노출 되는 기후의 유형에 차이 이어질. 유기 체는4그들의 특정 환경 성능을 극대화 하는 형태, 생리, 및 행동 적응을 통해 다른 온도에 응답. 예를 들어, 초파리 melanogaster과일 파리에서 다른 지역에서 인구는 다른 온도, 신체 크기, 개발 시간, 장 수, 통치, 환경과 걷는 성능 다른 온도2에 ,5,,67. 다른 근원의 파리 사이 관찰 하는 다양성 유전 변이 및 플라스틱 유전자 식8,9부분에서 설명 합니다. 마찬가지로, 다른 지역에서 초파리 종 다르게 온도 그라디언트 가운데 고 극단적인 열 및 감기 테스트10,,1112에 저항에서 차이 보여.
초파리 도 최근 온도 인식13,14,15,,1617의 유전과 신경 기초를 이해 하는 선택의 모델 되고있다. 성인 파리는 안테나에 춥고 뜨거운 주변 온도 센서를 통해 및 뇌13,14,,1516 에 온도 센서를 통해 온도 인식 하는 광범위 하 게, , 17 , 18 , 19 , 20. 뜨거운 온도 대 한 주변 수용 체 Gr28b.d16 또는 Pyrexia21표현, 주변 동안 찬 수용 체는 Brivido14특징. 뇌에서 온도 TrpA115를 표현 하는 신경에 의해 처리 됩니다. 이 통로의 돌연변이에 행동 연구 온도 처리 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 개선 하 고 다른 지역에서 초파리 의 인구 가운데 다 메커니즘에 통찰력을 제공.
여기 우리는 신속 하 고 정확한 온도 변화를 일으키는 온도 제어 분야를 설명 합니다. 수 사관 프로그램 할 수 미리 이러한 변화, 인간의 개입 없이 표준화 하 고 반복 가능한 온도 조작에 대 한 수 있습니다. 파리는 기록 하 고 추적 하는 실험의 다른 단계에서 그들의 위치와 속도 결정 하기 위해 전문된 소프트웨어와 함께. 이 프로토콜에서 제시 하는 주요 측정 개별 열 적응성5를 식별할 수 있는 생리 적 성과의 생태학적으로 관련 색인 이기 때문에 다른 온도에 걷는 속도입니다. 온도 수용 체 돌연변이, 함께이 기술은 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 열 적응의 메커니즘을 밝힐 수. 있습니다
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Protocol
1입니다. 비행 음식 매체의 준비
- 수돗물의 1 L 2 L 유리 비 커에 부 어 고 추가 자기 저 어 바. 비등 온도 도달할 때까지 비 커 300 ° C에 자기 뜨거운 접시에 넣어.
- 500 발/분에 저 어 하 고 다음을 추가: 한 천 10 g, 포도의 30 g, 자당의 15 g, cornmeal의 15 g, 밀 세균의 10 g, 콩 가루 10 g, 당 밀의 30 g 및 활성 건조 효 모 35 g.
- 때 혼합 foams 적극적으로, 거절 열판 온도 120 ° C를 교 반 하면서.
- 10 분 후 열판 온도 30 ° C까지 추가 설정 하 고 교 반 혼합 48 ° c에 냉각 될 때까지 계속 비 커의 벽을 건드리지 않고 음식에 직접 온도계를 삽입 하 여 온도 측정 합니다.
- P-hydroxy-benzoic 산 메 틸 에스테 르의 2 세대 96% 에탄올 10 mL에 녹이 고 1 M 프로 산의 5 mL와 함께 믹스에 추가. 3 분 교 반을 계속 합니다.
- 핫 플레이트를 끄고 열이 양육 컬렉션 튜브에 음식의 6.5 mL 병으로 식품의 45 mL를 따르고.
2입니다. 파리의 준비
- 장소 20 남성과 20 여성 비행 음식 매체의 45 mL를 포함 하는 양육 병에서 난다. 내려 그들을 도청 하 고 신선한 병으로 그들을 활용 하 여 새로운 병 3 ~ 4 일 후 파리 전송. 3 변경 후 파리를 버리십시오.
- 25 ° c 12 h 빛/12-h 어두운 주기에 일정 한 온도에서 인큐베이터 안에 병을 배치
참고: 파리의 새로운 세대는 10 일 후 eclose를 것입니다.
- 25 ° c 12 h 빛/12-h 어두운 주기에 일정 한 온도에서 인큐베이터 안에 병을 배치
- Anesthetize 새로 이산화탄소 패드 4 분의 최대에 eclosed 파리 고 그림 붓을 사용 하 여 비행 음식 매체의 6.5 mL와 2.5 x 9.5 c m 비행 양육 튜브에서 그들을 수집 합니다.
- 만 처녀 파리를 수집 하 고 섹스에 의해 양육 유리병 당 20의 그룹으로 그들을 분리.
- 5-7 일, 새로운 튜브 2-3 일 마다 하 고 실험 하기 전에 일에 파리를 변경에 대 한 incubators 내부 튜브를 놓습니다.
3입니다. 빛의 구조
- 10 cm 길이, 4 cm 폭, 4cm 높이 및 0.5 ㎝ 두께의 나무 프레임을 확인 합니다.
- 각각의 짧은 가장자리, 4cm 길이, 높이 4 cm, 및 안쪽으로 1.5 c m 너비의 테두리를 만들 나무 프레임의 영역. 테두리의 내부 얼굴을 둡니다.
- 0.5 cm 직경의 나무 프레임의 긴 가장자리 중 교차로에서 그리고 짧은 가장자리에 테두리의 각에서 두 구멍을 드릴 합니다.
- 짧은 가장자리에 테두리의 각각 안에 따뜻한 백색 LED 스트립의 장소 10 cm. 즉시 자리에 접착제로 LED 스트립의 뒷면을 껍질.
참고: 적외선 LED 돼야 하는 조명 요구에 따뜻한 백색 LED 스트립을 대체 하실 수 있습니다 하는 실험에 대 한 제거 합니다. - 스위칭 전원 공급 장치 및 그것의 다른 쪽 끝 반대 테두리에 LED 스트립 테두리 중 하나에 LED 스트립의 한쪽 끝을 연결 합니다.
- 모두 LED 스트립 설정 확인 하려면 스위칭 전원 공급 장치를 켜십시오.
- 종이의 백색 조각으로 각 테두리의 열린 측면을 커버.
- 긴 가장자리의 내부 단계의 각 지의 다른 조각을 접착제.
4. 온도 제어 분야
- 온도 제어 분야 (그림 1A 및 1c)을 켭니다. 알루미늄 링 워밍업 시작 팬 실행 됩니다 확인 하십시오.
- 온도 제어 경기장 온도 시퀀스 TemperaturePhases 스크립트를 실행 하는 제어 컴퓨터에 연결 하는 USB 케이블을 사용 합니다.
- 제어 컴퓨터에서 TemperaturePhases 스크립트를 열고 온도 시퀀스 (비디오 1)를 제대로 설정 되어 있는지 확인 합니다.
- 각 실험 단계 기간 60로 설정 된 검사는 "파 확인 하 여 s. StimulusDur "는 60 s.
- 1) 수와 같은 원하는 단계, 2) 반복 ON/OFF 표시 하는 빨간 빛 발광 다이오드 (Led), 위상, 당 3) 2 ° C 온도 증가 수 및 시작 온도 4) 16 ° C는 "시작 실험에서 모두 올바른지 확인 블록"섹션입니다.
참고: 첫 번째 실험 단계 (그림 2) 속도의 인공 증가 피하기 위해 16 ° C에서 7 분 동안 비행 분야에 적응 하는 파리 수 있습니다. - TemperaturePhases 스크립트를 실행 합니다. 소프트웨어 경기장"결정으로 5 초 동안 초기화. "고 중지입니다.
- 일단 비행 비행 아레나 (5.3 단계)으로 날 려 왔다 실험 단계를 실행 하려면 키보드의 스페이스바를 누릅니다.
참고: TemperaturePhases 는 현재 스크립트 제어 상자; 그러나, 그것이 다른 실험의 요구를 조정 하는이 장치를 사용 하 여 다른 사용자 지정 스크립트를 만들 수 있습니다.
- 카메라의 USB 케이블을 사용 하 여 녹음 컴퓨터에 경기장의 위에 카메라를 연결 합니다.
- 비디오 녹화 프로그램 ( 재료의 표참조)을 선택 하 여 녹음/녹화 컴퓨터에서 "파일 | 새로운 영화 기록 "입니다. 카메라에서 이미지를 표시 하는 화면이 열립니다.
- 카메라 이미지 캡처 경기장 및 나타내는 빨간색 Led의 모든 모서리를 확인 합니다.
- 아레나 (단계 5.4) 주위 빛의 프레임 설정 되 면 카메라 이미지를 보여주는 스크린의 아래쪽 가장자리에 중간에 빨간 버튼을 눌러 녹음을 시작 합니다.
참고: 조명에 작은 변화는 추적의 정확도 발생할 수 있습니다. 온도 제어 분야의 조명 기구의 위치를 고정 하 여 일정 한 유지 하는 것이 좋습니다.
5. 온도 행동 실험
- 비행 아레나 (그림 1C)을 준비 합니다.
- 모든 가장자리는 포함 하는 보장 구리 타일 위에 흰색 전도성 테이프의 가닥을 놓습니다.
- 장소 구리 타일 주위 온수 알루미늄 반지. 링의 가장자리는 구리 타일 주위 완벽 하 게 맞는 그래서 그것은 항상 같은 위치에 배치 됩니다.
- 깨끗 한 티슈로 커버 유리를 청소 하 고는 파리에서 날 수 있는 격차를 떠나 알루미늄 링 위에 두십시오.
참고: 실험을 하기 전에 미 끄 러운 표면을 만들 siliconizing 에이전트와 함께 유리 커버 코트. 24 h에 대 한 siliconizing 에이전트를 적용 하 고 사용 하기 전에 물으로 그것을 씻어.
- TemperaturePhases 스크립트 (4.3.3 단계)를 실행 하 고 비디오 녹화 프로그램 (4.5 단계).
- 비행 무대로 양육 유리병 (단계 2.2.2)에서 파리를 날 려 (예., 남성 1 비행 그림3에서).
- 인큐베이터에서 파리의 유리병, 아래쪽으로 입 흡 인기와 함께 한 비행 트랩 및 유리병 닫고 다시 인큐베이터에 넣어가 서 그들을 두 번 누릅니다.
- 유리 덮개와 알루미늄 반지 (단계 5.1.3) 사이 남아 있다 차이 통해 경기장에 비행을 놓습니다.
- 비행 비행 분야에 도입 되 자 마자 알루미늄 링의 가장자리에 도달할 때까지 유리 덮개를 밀어 유리 덮개와 알루미늄 반지 사이 간격을 닫습니다.
- 대칭 조명 되도록 경기장 주위 빛의 프레임을 배치 합니다.
- 위치를 표시 (예., 영구 마커를 사용 하 여) 프레임 항상 같은 위치에 배치 되도록 보장 하기 위해 비행 아레나 (그림 1C) 주위 빛의 프레임의.
- 비디오 녹화 프로그램 (4.5.2 단계)으로 녹음을 시작 하 고 실험 단계 (단계 4.3.4)를 실행 하려면 제어 컴퓨터의 키보드에서 스페이스바를 누릅니다.
- 결국 실험 단계.mp4 또는.avi 포맷 비디오 저장 완료 되 고 입 흡 인기와 비행 경기장에서 파리를 제거 합니다.
참고: TemperaturePhases 스크립트 중지 또는 모두 나타내는 빨간색 led가 해제 되 고 의해 실험 단계 끝을 확인할 수 있습니다.- 비디오 레코딩 프로그램에서 화면의 아래쪽 가장자리의 중간에 중지 버튼을 누르면 녹화를 중지 합니다. 언론 "파일 | 다른 이름으로 저장"비디오를 하기.
6. 비디오 추적 및 데이터 분석
- FlySteps 추적 소프트웨어 (동영상 2)를 사용 하 여 동영상을 추적.
- "FlyTracker" 폴더 안에 "configuration_file.ini"를 엽니다.
- "Video_folder"에서 동영상의 위치 및 "video_files"에 동영상의 이름을 설정 합니다.
- "Arena_settings"에 따라 비행 아레나의 테두리를 지정 (x, y)는 경기장의 가장자리에 여러 점의 픽셀 좌표.
- "Led_settings"에 따라 나타내는 빨간색 Led의 위치 지정 (x, y) Led의 중심의 위치를 픽셀 좌표.
- 체크인 비행 아레나의 국경의 위치 "디버그"를 설정 하 여 "true"로 "arena_settings", "저장"을 클릭 하 고 터미널에서 스크립트를 실행 합니다. 비디오의 화면 캡처는 "arena_settings"에 입력 된 좌표에 의해 형성 된 파란색 사각형으로 표시 됩니다.
참고:이 사각형 영역 추적을 포위 한다. - "False"로 "arena_settings"에서 "디버그"을 변경 하 고 "저장"을 클릭 한 터미널에서 화면을 한 번 더 실행.
참고:이 추적 프로세스를 시작 합니다.
참고: 파리 온수 알루미늄 반지에 추적 영역 밖으로 걸을 수 있습니다. 이 후 파리 온수 반지를만 지 중지 하 고 추적 영역 내부 유지 실험의 첫 번째 초 동안 발생 합니다.
참고: 비디오는 실험의 기본 설정에 따라 다른 추적 소프트웨어와 함께 추적할 수 있습니다.
- 사용 (x, y)의 각 온도 성능에 대 한 관심의 계산에 추적 소프트웨어에 의해 제공 된 위치. 사용자 지정 스크립트 (예., FlyStepsAnalysis 보충에) 사용할 수 있습니다.
- 비교를 사용 하 여 반복된 측정 (RM) 분산 분석 (ANOVA) 및 게시물-임시 통계 소프트웨어를 사용 하 여 여러 비교 다른 비행 그룹의 온도 성능 곡선 ( 재료의 표참조).
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Representative Results
3 구리 타일의 온도 개별적으로 프로그래밍 가능한 회로 통해 통제 될 수 있다 (그림 1A) 온도 제어 분야에 의하여 이루어져 있다. 각 구리 타일 프로그래밍 가능한 회로 피드백을 제공 하는 온도 센서를가지고 있습니다. 회로 전원 공급 장치 각 타일의 온도 증가를 활성화 합니다. 수동 열전 요소는 팬에 의해 냉각 방열판 일정 한 냉각을 제공 하는 동안 원하는 온도 유지 하기 위해 일정 난방 요소 역할을 합니다. 온도 변화의 크기는 비 선형 방식으로 프로세스의 속도를 결정합니다. 2 ° C의 증가 필요에 0.1 s, 18 ° C의 증가 필요 합니다 4 s. 프로그래밍 가능한 회로 (그림 1C)에 연결 된 화면 타일의 각 온도 센서에 의해 측정 온도의 사용자를 알려줍니다. 구리 타일 50 ° C (그림 1B 및 1 C) 반도체 주위에서 끊임없이 열 하는 알루미늄 반지에 의해 포위 된다. 이 반지는 비행 아레나 (그림 1C), 파리는 배치 영역의 가장자리를 형성 한다. 비행 아레나 파리 걸 수 있지만 비행 하지 보장 3 m m 높은 공간을 제공 하는 시 유리 덮개 (그림 1A 및 1c), 적용 됩니다. 비행 아레나 옆은 다른 실험 단계를 표시 하도록 프로그래밍 될 수 있다 2 개의 빨간 Led (그림 1C). 예를 들어 그림 2A에 표시 된 결과 대 한 각 LED가 관련 다른 온도, 그림 2B에 각 LED 나타냅니다 60 s. FlySteps 소프트웨어는 때 나타내는 Led의 각각, 그리고 연구원 실험 단계 온도 또는 시간에 따라 자동으로 결정을 다음이 정보를 사용할 수 있습니다 등록할 수 있습니다.
온도 제어 아레나 동적 온도 변화에 다른 유전 배경에서 파리의 행동 대응 비교를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 파리 다른 종에서 점차적으로 증가 하는 온도 (그림 3) 열 성능에서 차이 비교 하에 노출 될 수 있습니다. 모든 종족의 속도 증가 온도 최대 성능, 이후 그것은 부패 하 고 죽 었 소의 지점에 도달할 때까지 증가 합니다. 그러나, 각 종 특정 최대 응답 속도와 열 공차 특정 응답 곡선을 있다. 이전 보고서와는 다른 종에서 초파리 발달 타이밍, 장 수, 통치, 신체 치수, 성적 통신 및 온도 공차3,6,7 사이 다 ,,822. 따라서, 온도 기울기에서 종의 운동의 우리의 설명 작업의이 본문에 추가합니다.
온도 제어 분야 탐구 실험 온도에 따라 컨디셔닝에 대 한 응답을 사용할 수 있습니다. 이 접근의 가장 간단한 형태는 파리 될 측면을 온난 하 여 다른 분야의 1 개의 측 피해23,,2425선호 하 훈련 한 조작 컨디셔닝 패러다임 이다. 우리는 편안한 22 ° C (그림 4)에서 다른 쪽 타일을 떠나 있는 동안 40 ° C는 중간에 측면 타일 중 하나를 개별 파리 노출. 야생-타입 파리는 신속 하 게 경기장을 따라 이동 중지 하 고 편안한 위치에 남아 있었다. 대조적으로, 고전적인 메모리 돌연변이 무지 렁이 경기장을 탐험 계속 하 고 편안한 위치에 컨트롤 보다 더 적은 시간을 보냈다. 모든 타일은 22 ° C로 설정 하 고 치료 그룹 간의 비교 했다 야생-타입 파리의 성능 및 무지 렁이 돌연변이 차이 더 크게 되었다. 무지 렁이 돌연변이 또한 야생-타입 파리 (그림 4)에 비해 교육 및 테스트 단계 사이의 큰 차이 보였다. 이러한 결과에 편안한 위치에 남아 있는 메모리의 영향을 건의 한다.
온도 및 위치 조합 동적 온도 변화 하는 동안 다른 온도 수용 체의 기능을 이해 하는 데 유용 있습니다. 우리가 증가 하는 온도를 개별 D. melanogaster Gr28b.d 및 TrpA1GAL4 돌연변이 노출 (2 ° C 증가 마다 60 s) 22 ° C (그림 5)에서 편안 하 게 위치를 제공 하는 동안. 편안한 위치 이동 왼쪽에서 오른쪽, 그리고 반대로, 반복 당. 결과 그들은 온도 증가 편안한 위치에 더 많은 시간을 보내고 주변 온도 수용 체 Gr28b.d 돌연변이 컨트롤 처럼 동작을 보여준다. 그러나, 뇌 온도 수용 체 TrpA1GAL4 돌연변이 온도 증가 의해 영향을 받지 않습니다 및 경기장에 그들의 위치를 변경 하지 마십시오. 증가 TrpA1GAL4 돌연변이의 곡선에서 감소 되었다 편안 하 고 남아 있다 그 단계 전에 이미 편안한 위치에 앉아 파리에 효과 보여준다. 봉우리의 일관성과 TrpA1GAL4 의 곡선의 골짜기 제안이 파리; 실험의 대부분을 위해 아직도 남아 따라서, 그들은 끊임없이 그들의 위치는 편안 하 게 간주 한 때 계산 했다. 이 결론은 녹화 비디오의 시각적 검사에 의해 확인 되었다. 이전 파리 감각 온도 TrpA1에 따라 주요 중앙 메커니즘을 보유 하 고 그 주변 인식 빠르고 큰 변화를 제안 하는 생리 적 보고서 Gr28b.d17 에 의존 하지 않는 이러한 결과 지원 14,21.
그림 1: 온도 제어 분야의 다이어그램. (A)는 온도 제어 분야의 측면 볼 수 있습니다. 프로그래밍 가능한 회로 그들의 온도 제어 하는 구리 타일에서 히터에 전원 공급 및 온도 센서를 연결 합니다. 타일 끊임없이 방열판 팬에 연결을 통해 냉각 된다. 열띤된 알루미늄 반지는 유리 커버 달려 주변 타일. (B) 열에서 24 ° C (위)와 24 ° C에서 30 ° C (아래)에서 중간 타일 쪽 타일 타일을 보여주는 영상. (C) 분야의 최고 보기. 카메라 구리 도와, 알루미늄 반지, 그리고 빨간색 led가 기록 후 자동으로 실험 단계를 결정 합니다. 카메라에 의해 기록 되지 상자의 모서리에 있는 화면에는 현재 타일 온도를 표시 됩니다. (D) 빛의 반지: 백서에서 덮은 나무 상자 안에 두 개의 따뜻한 백색 LED 스트립 보장 전체 경기장의 일정 한 대칭 조명. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 파리 온도 프로토콜을 시작 하기 전에 경기장에 적응 해야 합니다. (A) 단일 남성 파리 경기장에 소개 되었고 이후 온도가 증가 시작 1 분 동안 일정 16 ° C에서 찾아보기 수 있습니다. (B) 단일 파리 16 ° C, 20 ° C, 또는 24 ° C에 노출 (그룹 차이가; 양방향 ANOVA F (2,570) = 4.156, p = 0.162) 높은 운동 5 분 후 보다 실험의 시작 부분에 있다 (양방향 RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0.0001). 데이터는 의미와 20 처녀 여성 파리 5 ~ 7 한 일 동안 테스트의 평균 (± SEM)의 표준 오차. 별표 나타냅니다 그룹 간의 중요 한 차이 (* * * p < 0.0001; Tukey의 다중 비교 테스트, p = 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 운동 5 초파리 종 점차적으로 증가 하는 온도에 노출의. 개별 남성 (파란색), 온화한 열 대 (빨강)에서 파리와 코스모폴리탄 (갈색) 초파리 종 증가 온도 기울기에 노출 됐다 (2 ° C 마다 60 s) 16, 46 ° C. 사이의 첫 번째 7 분 파리 경기장을 찾아보기 수 있도록 22 ° C에서 끊임없이 했다. 종 크게 달랐다 (양방향 RM ANOVA F(4,70) 28.46, p < 0.001 =). (a) D. melanogaster (갈색; 동그라미 가득) 경기장에 도입 되었을 때 더 빨리 했다. (b) D. yakuba (빨간; 빈 사각형) 빠른으로 온도가 증가 했다. (c) D. suzukii (갈색 채워진 사각형)은 최대 성능 지점에서 다른 국제적인 파리 보다 느립니다. (d) D. simulans (브라운, 원 빈) D. melanogaster의 최대 시점에서 부패에. 각 포인트 15 남성 파리 5 ~ 7 일 오래 된 몇 일 동안 테스트의 평균을 (± SEM)를 나타냅니다. 의미 표시 기호 (♦ 모든 p < 0.0001; 차이 = † D. melanogaster, 제외 하 고 모두에서 차이 = p < 0.0001; • D. melanogaster, 차이 = p < 0.01; ¢ D. melanogaster, p에서 차이 = < 0.001; 명명 된 그룹, p < 0.0001;의 차이 = Tukey의 다중 비교 테스트, p = 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 온도 제어 분야 기사 조절에 사용할 수 있습니다. D. melanogaster 구획-S 스트레인 (야생-타입; 검은 테두리) dnc1 (무지 렁이; 빨간 테두리) 돌연변이 선호 하 22 ° C에서 측면 타일 중간 온난 후 반대 측면 타일 (교육, 아니 4 분 동안 40 ° C에 훈련 했다 패턴)입니다. 가 열 영역의 메모리 다음 22 ° c (테스트, 그리드 패턴) 모든 타일을 설정 하 여 테스트 됩니다. 파리 절반은 실험의 왼쪽에 타일 다음 나머지 절반에서 오른쪽에 타일을 선호 하는 조절 했다. 학습 및 테스트 하는 동안 22 ° C에서 타일 내부 총 시간 비율 공연 비교 측정 했다. 그룹은 크게 다른 (일방통행 ANOVA F(3,76) 23.23, p < 0.0001 =), 무지 렁이 전반적으로 야생-타입 보다 더 수행으로. 데이터는 20 처녀 여성 파리 5 ~ 7 일 오래 된 몇 일 동안 테스트의 평균 (± SEM). 별표 표시 그룹 간의 의미 차이 (* * * p > 0.0001; * * * p > 0.001; * * p > 0.01; Tukey의 다중 비교 테스트, p = 0.05) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 편안한 위치를 제공 하는 경우 온도 증가 하는 온도 돌연변이의 응답. 온도 돌연변이 Gr28b.d (그린, 사각형) 컨트롤 (w1118, 블랙; 원) 온도 증가로 편안한 영역에서 시간 비율을 증가 하 여 응답 (양방향 RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). 그들은 증가 하지 시간 편안한 영역에서 온도 증가할수록 TrpA1GAL4 돌연변이 (노란색; 삼각형)는 컨트롤 (w1118, 블랙), 다른 (양방향 RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0.019). 데이터는 20 남성 파리 5 ~ 7 일 오래 된 몇 일 동안 테스트의 평균 (± SEM). TrpA1GAL4 는 크게 다른 Gr28b.d 및 제어 (p < 0.05; Tukey의 다중 비교 테스트, p = 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 자동된 온도 제어 아레나 (그림 1) 시간과 공간에 정확한 온도 변화를 일으키는 제시. 이 방법을 사용 하면 개별 초파리 의 온도 (그림 2 및 그림 3), 미리 프로그램 된 점진적 증가 뿐만 아니라 동적 온도 전에 비행 분야의 각 도와 열 되었다 노출 다른 온도에 독립적으로 (그림 4 및 그림 5).
온도 제어 분야 난방 과정에 혁신적인 접근 방식을 사용합니다. 전통적인 방법에서 사용 하는 열전 Peltier 난방 요소 타일에 온도 변화를 생성 하는 대신 온도 제어 분야를 사용 하 여 현재 구리 질량 구리 타일을 따뜻하게 하 고 파리는 상단에 배치 됩니다. 구리 질량은 지속적으로 팬에 연결 된 방열판 블록에 의해 냉각 된다. Peltier 같은 요소는 일단 그것은 워밍업은 구리 질량의 원하는 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 이러한 요소는 주요 온도 발전기 때문에 그들은 덜 스트레스, 그들의 수명을 확장 하 고 빠른 온도 변화를 겪고 있습니다. 저전압 전원 공급 장치를 활성화할 수 있습니다 또한, 구리 타일의 각 온도 센서에서 피드백을 수신 하는 프로그래밍 가능한 회로 난방 메커니즘을 조정 합니다. 연구원은 언제 그리고 어디 온도 변화 발생 하 고 이러한 변경의 방향과 강도 결정 지정할 수 있습니다. 또한, 특수 메서드 커플링 추적 소프트웨어, FlySteps, 등 허용 온도 또는 특정 위치 (에서 소요 시간 특정에 전반적인 속도 같은 초파리의 움직임에 관련 된 모든 측면의 분석 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5). 그럼에도 불구 하 고, 모든 결과 특성 그들의 운동에 영향을 미칠 수 있는 행동 비행에 내재 된 고려해 야 합니다. 예를 들어 파리 경기장을 탐구 하 고 온도 변경 하기 전에 정착을 허용 되지 않는 경우 속도 측정 수도 인위적으로 높은 (그림 2). 파리 또한 odorants 후속 파리; 영향을 남길 수 있습니다. 따라서, 커버 유리를 청소 해야 합니다, 그리고 타일을 덮고 테이프 주제 사이 변경 해야 합니다. 그 운동 거부로 나이26파리, 파리 결과에 변화를 피하기 위해 나이 대 한 표준화는 중요 하다. 우리의 분야에서 파리 또한 centrophobism, 가장자리를 선호 하는 중간 영역 표시. 경험과 대 평가 사이트 환경 설정을 방지 하기 위해 편안한 영역의 위치를 변경 하 여이 대 한 제어 해야 합니다.
경기장의 현재 특성 및 요구 사항 추적 프로세스의 몇 가지 실험 절차를 제한할 수 있습니다. 예를 들어 경기장의 주변 환경이 포함 되지 않습니다 액세스 포인트는 냄새 소개 될 수 있던, 어떤이 자극은 중요 한 연구를 방지. 마찬가지로, FlyStepts 추적기를 균일 한 배경의 동영상 파리의 환경에 음식 또는 다른 항목 추가의 가능성을 제한 하 필요로 합니다. 경기장 수 가스 밸브에 대 한 연결을 포함 하도록 적응 하며 소프트웨어 개발에 있어야 더 많은 개체에 대 한 수 있습니다. 미래의 프로젝트 온도 제어 분야 실험의 특정 요구에 맞게 이러한 가능성을 이용할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 다른 종의 초파리 수행 다르게 온도 증가 (그림 3)와 온도 돌연변이 컨트롤 (그림 5)와 같은 방법에 응답 하지 않는 결과에 나타났습니다. 이 초파리의 열 동작 및 자연 선택과 기능적 특성에 의해 영향을 어떻게 탐험이 새로운 메서드를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 마지막으로, 그것은 우리의 방법은 도움이 수 추가 열 적응의 이해 및 speciation 뿐만 아니라 다른 자극으로 온도 수용 체의 상호 작용에서 미래 연구를 보여 줍니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품 일부에 의해 지원 되었다 장학금 Behavioural 그로 닝 겐 대학 및 대학원 장학금 Consejo 나시오날 드 많은 y 멕시코에서 과학 (CONACyT)에서 인지 신경 과학 프로그램에서 부여 된 안드레아 소 토-빠 디 야, 그리고 Hedderik 반 린 장-크리스토프 Billeter에 게 수 여 하는 시간 연구에 대 한 존 템플턴 재단에서 부여를. 우리는 또한 FlySteps 추적기를 개발에 자신의 참여에 대 한 피터 Gerrit Bosma에 감사입니다.
스크립트 TemperaturePhases, FlySteps, 및 FlyStepAnalysis 보충 정보 및 다음 임시 및 공개적으로 사용할 수 있는 링크에서 찾을 수 있습니다.
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
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