Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.
Abstract
A temperatura é um fator ambiental onipresente que afeta como espécie distribuir e se comportar. Diferentes espécies de moscas de fruta Drosophila tem respostas específicas às mudanças de temperaturas, de acordo com sua tolerância fisiológica e adaptabilidade. Drosófila moscas também possuem uma sistema que se tornou fundamental para entender a base neural da temperatura de processamento na aditividade de sensores de temperatura. Apresentamos aqui uma arena de temperatura controlada que permite mudanças de temperatura rápida e precisa com controle temporal e espacial para explorar a resposta de moscas individuais às mudanças de temperaturas. Moscas individuais são colocadas na arena e expostas aos desafios de temperatura pré-programada, tais como uniforme gradual aumenta de temperatura a determinar normas de reação ou temperaturas espacialmente distribuídas ao mesmo tempo para determinar as preferências. Os indivíduos são controlados automaticamente, permitindo a quantificação da velocidade ou local de preferência. Esse método pode ser usado para quantificar rapidamente a resposta sobre uma vasta gama de temperaturas para determinar as curvas de desempenho de temperatura em Drosophila ou outros insetos de tamanho similar. Além disso, pode ser usada para estudos genéticos para quantificar a temperatura preferências e reações de mutantes ou selvagem-tipo moscas. Esse método pode ajudar a descobrir a base da especiação térmica e adaptação, bem como os mecanismos neurais subjacentes processamento de temperatura.
Introduction
A temperatura é um factor ambiental constante que afeta como organismos funcionam e se comportar1. As diferenças de latitude e altitude levam a diferenças no tipo de climas organismo são expostos, que resulta na seleção evolutiva para suas respostas a temperatura2,3. Os organismos respondem a temperaturas diferentes, através de adaptações morfológicas, fisiológicas e comportamentais que maximizar o desempenho sob seus determinados ambientes4. Por exemplo, na mosca da fruta Drosophila melanogaster, populações de diferentes regiões têm preferências de temperatura diferentes, tamanhos de corpo, vezes no desenvolvimento, longevidade, fecundidade e ambulante de desempenho em temperaturas diferentes2 ,5,6,7. A diversidade observada entre moscas de diferentes origens é explicada em parte pela variação genética e expressão de gene plástico8,9. Da mesma forma, espécies de Drosophila , de diferentes áreas distribuem diferentemente entre gradientes de temperatura e mostram as diferenças na resistência a calor extremo e frio testes10,11,12.
Drosófila recentemente também se tornou o modelo de escolha para entender a base genética e neural de temperatura percepção13,14,15,16,17. Em geral, moscas adultas percebem a temperatura através de sensores de temperatura periférica quentes e frias nas antenas e sensores de temperatura no cérebro14,13,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. os receptores da periferia para temperaturas quentes expressam Gr28b.d16 ou pirexia21, enquanto a periferia frios receptores são caracterizados por Brivido14. No cérebro, a temperatura é processada por neurônios expressando TrpA115. Estudos comportamentais em mutantes destas vias estão a melhorar a nossa compreensão de como a temperatura é processada e dar insights sobre mecanismos que variam entre as populações de Drosophila de diferentes regiões.
Aqui nós descrevemos uma arena de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápida e precisa. Investigadores podem pré-programar estas mudanças, o que permite manipulações de temperatura padronizados e repetíveis, sem intervenção humana. Moscas são registradas e controladas com software especializado para determinar sua posição e velocidade em diferentes fases de uma experiência. A principal medida apresentada neste protocolo é a velocidade ambulante em temperaturas diferentes, porque é um índice ecologicamente relevante de desempenho fisiológico que pode identificar a adaptabilidade individual térmico5. Juntamente com os mutantes do receptor de temperatura, esta técnica pode ajudar a revelar os mecanismos de adaptação térmica nível celular e bioquímico.
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Protocol
1. preparação da comida de mosca médio
- Despeje 1 L de água da torneira em um béquer de vidro de 2 L e adicionar uma barra de agitação magnética. Coloque o copo sobre uma chapa quente magnética a 300 ° C até a temperatura de ebulição é atingida.
- Mexa em 500 rodadas/min e adicione o seguinte: 10 g de ágar-ágar, 30 g de glicose, 15 g de sacarose, 15 g de farinha de milho, 10 g de germe de trigo, 10 g de farinha de soja, 30 g de melaço e 35 g de ativo fermento seco.
- Quando a mistura espumas vigorosamente, abaixe a temperatura da placa quente até 120 ° C, continuando a mexer.
- Vire ainda mais a prato quente temperatura até 30 ° C após 10 min e continue mexendo até a mistura esfria a 48 ° C. Medir a temperatura através da inserção de um termômetro diretamente na comida sem tocar as paredes do copo.
- Dissolver 2 g de éster metílico de ácido p-hidroxi-benzoico em 10 mL de etanol a 96% e adicioná-lo à mistura, juntamente com 5 mL de ácido propiônico de 1m. Continue mexendo por 3 min.
- Desligue a chapa e despeje a criação garrafas e 6,5 mL de alimento para os coleção de frascos 45 mL de alimento.
2. preparação de moscas
- Lugar de 20 machos e 20 fêmeas voa nas garrafas criação contendo 45 mL de meio de comida de mosca. Transferi as moscas para garrafas de novas depois de 3 a 4 dias tocar-lhes para baixo e tocando-os nas garrafas frescas. Descarte as moscas após três alterações.
- Coloque as garrafas dentro da incubadora sob ciclos de escuros luz/12-h 12-h com uma temperatura constante de 25 ° C.
Nota: Uma nova geração de moscas será eclose depois de dez dias.
- Coloque as garrafas dentro da incubadora sob ciclos de escuros luz/12-h 12-h com uma temperatura constante de 25 ° C.
- ANESTHETIZE recém eclosed moscas em pastilhas de dióxido de carbono por um período máximo de 4 min e cobrá-los em frascos de criação voar 2.5 x 9.5 cm com 6,5 mL de meio de voar comida usando um pincel.
- Recolher a única virgens moscas e separá-los por sexo em grupos de 20 moscas por frasco de criação.
- Coloque os frascos dentro de incubadoras para 5-7 dias, mudando as moscas para novos frascos cada 2-3 dias e os dias antes de experimentos.
3. quadro de luzes
- Fazer uma moldura de madeira de 10 cm de comprimento, 4 cm de largura, 4 cm de altura e 0,5 cm de espessura.
- Em cada uma das arestas curtas, crie uma borda de 4 cm de comprimento, 4 cm de altura e largura de 1,5 cm para dentro área do frame de madeira. Deixe a face interna do fronteira aberta.
- Dois furos de 0,5 cm de diâmetro no cruzamento de uma das bordas da moldura de madeira longas e em cada uma das fronteiras nas extremidades curtas.
- Lugar de 10 cm de uma faixa de LED branca quente dentro de cada uma das fronteiras nas bordas curtas. Descasque a volta da faixa de LED para cola-lo imediatamente no lugar.
Nota: Para experimentos em que iluminação precisa ser eliminada, a faixa de LED branca quente pode ser substituída por LED infravermelho tiras. - Conecte uma extremidade da faixa de LED em uma das fronteiras para a alimentação e a outra extremidade à faixa de LED na borda oposta.
- Ligue a interruptor de alimentação para verificar que as duas tiras de LED acender.
- Cobrir o lado aberto de cada fronteira com um pedaço de papel branco.
- Cole um outro pedaço de papel para cada uma das fases internas das bordas longas.
4. temperatura controlada Arena
- Transformar a arena de temperatura controlada (figura 1A e 1C). Certifique-se que o ventilador começa a funcionar e o anel de alumínio começa a aquecer.
- Use um cabo USB para conectar a arena de temperatura controlada para o computador de controle executando o script TemperaturePhases com as sequências de temperatura.
- Abra o script TemperaturePhases no computador de controle e verifique se a sequência de temperatura está corretamente configurada (vídeo 1).
- Verifique se a duração de cada fase experimental é definida como 60 s verificando esse "par. StimulusDur"é igual a 60 s.
- Verifique se o número 1) igual ao desejado número de fases, 2) iterativos ON/OFF set-up a luz vermelha indicativa, emitindo-se diodos (LEDs), aumento de temperatura 3) 2 ° C por fase, e 4) 16 ° C, como a temperatura inicial estão todos corretos sob a "iniciar o experimental bloco"seção.
Nota: Permitir que as moscas se adaptar à Arena voar por 7 min a 16 ° C para evitar um aumento artificial da velocidade durante as primeiras fases experimentais (Figura 2). - Execute o script TemperaturePhases . O software irá inicializar durante 5 segundos, conforme determinado no "arena. Esperar"e depois parar.
- Pressione a barra de espaço do teclado para começar a executar as fases experimentais, uma vez que uma mosca foi destruída para a Arena de voar (etapa 5.3).
Nota: O TemperaturePhases é o atual script controlando a caixa; no entanto, é possível criar outros scripts personalizados para usar este dispositivo que se ajustam às necessidades de diferentes experiências.
- Conecte a câmera em cima da arena para o gravação de computador usando o cabo USB da câmera.
- Abra o programa de gravação de vídeo (consulte Tabela de materiais) em gravação de computador, selecionando "arquivo | Nova gravação de filme". Abrirá uma tela mostrando a imagem da câmera.
- Certifique-se de que a imagem da câmera capta todas as bordas da arena e os LEDs vermelhos indicativos.
- Inicie a gravação, pressionando o botão vermelho no meio da borda inferior da tela, mostrando a imagem da câmera, uma vez que o quadro de luzes é definido em torno da arena (passo 5.4).
Nota: pequenas mudanças na iluminação pode afetar a precisão de rastreamento. É aconselhável manter a iluminação da arena temperatura controlada constante ao fixar a localização do aparelho.
5. temperatura experimentos comportamentais
- Prepare a Arena mosca (Figura 1).
- Coloque um fio de fita condutora branco na parte superior das telhas de cobre, garantindo que todas as bordas são cobertas.
- Coloque o anel de alumínio aquecido em torno das telhas de cobre. A borda do anel se encaixa perfeitamente em torno das telhas de cobre para isso sempre é colocado no mesmo local.
- Limpe a tampa de vidro com um tecido limpo e coloque-o na parte superior do anel de alumínio, deixando uma abertura através da qual uma mosca pode ser levada em.
Nota: Antes dos experimentos, revesti a tampa de vidro com o agente siliconizing para criar uma superfície escorregadia. Aplicar o agente siliconizing para 24h e enxague com água antes de usar.
- Execute o script TemperaturePhases (passo 4.3.3) e abrir o programa de gravação de vídeo (etapa 4.5).
- Explodir a mosca de um frasco de criação (etapa 2.2.2) para a Arena de voar (EG., 1 macho voar na Figura 3).
- Toma um frasco de moscas da incubadora, toque duas vezes para forçá-los a ir para o fundo, capturar uma mosca com um aspirador de boca e feche o frasco e colocá-lo de volta para a incubadora.
- Coloque a mosca na arena através da abertura que ficou entre a tampa de vidro e anel de alumínio (etapa 5.1.3).
- A lacuna entre a tampa de vidro e anel de alumínio, empurrando a tampa de vidro até atingir a borda do anel de alumínio como a mosca é introduzida para a Arena de voar.
- Coloque o quadro das luzes em torno da arena para garantir iluminação simétrica.
- Marca o local (ex., usando um marcador permanente) do quadro de luzes em torno da Arena voar (Figura 1) para garantir que o quadro é colocado sempre no mesmo local.
- Começar a gravar com o programa de gravação de vídeo (etapa 4.5.2) e pressione a barra de espaço do teclado do computador para começar a executar as fases experimentais (passo 4.3.4) controle.
- Fases experimentais afinal são feitas, salvar o vídeo em formato. MP4 ou. avi e remover a mosca da Arena de voar com o aspirador de boca.
Nota: O fim das fases experimentais pode ser determinado por ambos os LEDs vermelhos indicativos, sendo desligados ou parando o script TemperaturePhases .- Pare o gravação, pressionando o botão de parar no meio da parte inferior da tela no programa de gravação de vídeo. Pressione "arquivo | Salvar como"para salvar o vídeo.
6. vídeo monitoramento e análise de dados
- Use o FlySteps que segue o software (vídeo 2) para acompanhar os vídeos.
- Abra o "configuration_file.ini" dentro da pasta "FlyTracker".
- Defina a localização dos vídeos em "video_folder" e os nomes dos vídeos em "video_files".
- Especificar as bordas da Arena voar em "arena_settings", com base em (x, y) coordenadas de pixel de vários pontos na borda da arena.
- Especificar a localização dos LEDs vermelhas indicativas no "led_settings", com base em (x, y) coordenadas de pixel do local do centro dos LEDs.
- Verificar a localização das fronteiras da Arena voar, definindo "depurar" para "true" em "arena_settings", clicando em "Save" e executar o script no terminal. Uma captura de tela do vídeo vai aparecer com um quadrado azul, formado pelas coordenadas introduzidas em "arena_settings".
Nota: Esta praça rodeia a área a ser rastreado. - Alterar "depurar" em "arena_settings" para "false", clique em "Salvar" e executar a tela no terminal, mais uma vez.
Nota: Isto irá iniciar o processo de rastreamento.
Nota: Moscas podem sair da área de acompanhamento no anel de alumínio aquecido. Isso acontece durante os primeiros segundos de um experimento, após o qual moscas parem de tocar o anel aquecido e permanecem dentro da área de rastreamento.
Nota: Os vídeos podem ser rastreados com outro software de rastreamento de acordo com as preferências do experimentador.
- Uso o (x, y) a localização de cada mosca fornecida pelo software de monitoramento para calcular a medida de interesse para o desempenho de temperatura. Scripts personalizados (ex., FlyStepsAnalysis em complementar) pode ser usado.
- Comparar as curvas de desempenho de temperatura de diferentes grupos de voar usando medições repetidas (RM), análise de variância (ANOVA) e post-hoc comparações múltiplas, usando o software estatístico (ver Tabela de materiais).
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Representative Results
A arena de temperatura controlada (figura 1A) é composto por três telhas de cobre, cuja temperatura pode ser controlada individualmente através de um circuito programável. Cada telha cobre possui um sensor de temperatura que dá feedback ao circuito programável. O circuito ativa uma fonte de alimentação para aumentar a temperatura de cada telha. Passivos elementos termoelétricos atuam como elementos de aquecimento constante para manter a temperatura desejada, enquanto um dissipador de calor por um ventilador de refrigeração fornece resfriamento constante. A magnitude da mudança de temperatura determina a velocidade do processo de uma forma não-linear. Um aumento de 2 ° C requer apenas 0,1 s e um aumento de 18 ° C requer 4 s. Uma tela ligada ao circuito de programável (Figura 1) informa ao usuário da temperatura medida por sensores de temperatura em cada uma das telhas. As telhas de cobre estão rodeadas por um anel de alumínio constantemente aquecido a 50 ° C (figura 1B e 1C) por semicondutores em torno da periferia. Este anel constitui as bordas da arena voar (Figura 1), a área em que moscas estão a ser colocados. A Arena de voar é coberta por uma tampa de vidro siliconizado (figura 1A e 1C), que fornece um espaço de 3 mm alta que garante que voa pode andar mas não voar. Ao lado da Arena de voar são dois LEDs vermelhos (Figura 1) que podem ser programados para marcar diferentes fases experimentais. Por exemplo, para os resultados mostrados na Figura 2A, cada LED é associado com uma temperatura diferente, enquanto na Figura 2B, cada LED indica 60 s. O software de FlySteps pode registrar quando cada um dos LEDs indicativos está ligado, e o pesquisador pode usar essas informações para determinar automaticamente as fases experimentais, com base em temperatura ou tempo.
A arena de temperatura controlada pode ser usada para comparar a resposta comportamental de moscas de diferentes origens genéticas às mudanças de temperatura dinâmica. Por exemplo, moscas de diferentes espécies podem ser expostas ao aumentar gradualmente as temperaturas (Figura 3) para comparar as diferenças no desempenho térmico. Aumenta a velocidade de todas as espécies, como a temperatura aumenta até atingir um ponto de desempenho máximo, após o qual ele deteriorado e pereceu. No entanto, cada espécie tem uma curva de resposta particular com velocidades de resposta específica máxima e tolerância térmica. Relatórios anteriores mostraram que drosófila de diferentes espécies diferem entre o momento do desenvolvimento, longevidade, fecundidade, dimensões do corpo, comunicação sexual e temperatura tolerância3,6,7 ,8,22. Assim, nossa descrição de locomoção espécie-específicas em um gradiente de temperatura adiciona a este corpo de trabalho.
A arena de temperatura controlada também pode ser usada para explorar a resposta para experimentos com base na temperatura de condicionamento. A forma mais simples desta abordagem é uma paradigma de condicionamento operante em que moscas são treinadas a preferir um lado da arena sobre o outro, pelo aquecimento do lado que será evitado23,24,25. Estamos expostos moscas individuais a 40 ° C no meio e dentre as telhas do lado, deixando a outra lado telha em um confortável 22 ° C (Figura 4). Selvagem-tipo moscas rapidamente pararam de se mover ao longo da arena e permaneceram no local confortável. Em contraste, o mutante de memória clássico Dunce continuou explorando a arena e gasto menos tempo do que os controles no local confortável. As diferenças entre o desempenho das moscas tipo selvagem e mutantes Dunce tornou-se maior quando todas as telhas foram definidas a 22 ° C e comparações foram feitas entre os grupos de tratamento. Dunce mutantes também mostraram diferenças maiores entre as fases de treinamento e teste em comparação com as moscas do selvagem-tipo (Figura 4). Estes resultados sugerem um efeito de memória em permanecer em posição confortável.
Combinações de temperatura e localização também são úteis para entender a função dos receptores de temperatura diferentes durante as mudanças de temperatura dinâmica. Estamos expostos individual d. melanogaster Gr28b.d e TrpA1GAL4 mutantes ao aumento das temperaturas (2 ° C e aumentar a cada 60 s), proporcionando um local confortável a 22 ° C (Figura 5). O local confortável deslocado da esquerda para a direita e vice-versa, por iteração. Os resultados mostram que os mutantes de Gr28b.d periferia do receptor de temperatura se comportam como o controle, como eles passam mais tempo no local confortável enquanto a temperatura aumenta. No entanto, cérebro temperatura receptor TrpA1GAL4 mutantes não são afetados pelo aumento das temperaturas... e não mudam suas localizações na arena. A aumentos e diminuição da curva de mutantes TrpA1GAL4 mostram o efeito em moscas que já estavam sentados na posição confortável antes de se tornar confortável e permaneceram lá durante essa fase. A consistência dos picos e vales da curva do TrpA1GAL4 sugerem que estas moscas manteve-se ainda para a maioria do experimento; daí, eles foram contados constantemente quando sua localização foi considerado confortável. Esta conclusão foi confirmada por inspeção visual dos vídeos gravados. Estes resultados suporte anterior fisiológicos relatórios sugerindo que essa percepção da periferia de mudanças rápidas e grandes não depende de Gr28b.d17 e que moscas possuem um mecanismo central principal à temperatura de sentido com base na TrpA1 14,21.
Figura 1: diagrama de temperatura controlada-arena. (A) vista lateral da arena de temperatura controlada. Um circuito programável conecta um sensores de temperatura e fornecimento de poder para resistências sob telhas de cobre para controlar sua temperatura. As telhas são constantemente arrefecidas através de um dissipador de calor, ligado a um ventilador. Um anel de alumínio aquecido sobre os quais repousa uma tampa de vidro circunda as telhas. (B) térmica de imagens mostrando os azulejos a 24 ° C (topo) e telhas de lado a 24 ° C com um azulejo meio a 30 ° C (parte inferior). (C) A vista de cima da arena. Uma câmera registra as telhas de cobre, anel de alumínio e LEDs vermelhos e, em seguida, determina automaticamente as fases experimentais. Uma tela no canto da caixa, não gravado pela câmera, exibe a temperatura atual da telha. (D) o anel de luz: duas tiras de branco quentes LED dentro de uma caixa de madeira coberta de papel branco garantir iluminação constante e simétrica da arena inteira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: moscas devem adaptar à arena antes de iniciar o protocolo de temperatura. (A) única moscas masculinas foram introduzidas para a arena e permitiu explorar uma constante 16 ° c por 1 min, depois que a temperatura começou a aumentar. (B) único moscas expostas a 24 ° C, 20 ° C ou 16 ° C (não há diferenças de grupo; bidirecional ANOVA F (2.570) = 4.156, p = 0.162) têm uma maior locomoção no início do experimento do que depois de 5 min (bidirecional RM ANOVA F (9.570) = 7.803, p < 0,0001). Dados são média e erro padrão da média (± SEM) de 20 moscas fêmeas virgens 5 a 7 dias de idade testado ao longo de vários dias. Asterisco indica uma diferença significativa entre os grupos (* * * p < 0,0001; Tukey o teste de comparação múltipla, p = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Locomoção de 5 espécies de Drosophila , exposto a aumentando gradualmente a temperatura. Individual masculino voa de clima temperado (azul), tropical (vermelho), e espécies de Drosophila cosmopolitas (marrons) foram expostos a um gradiente de temperatura crescente (2 ° C cada 60 s) entre 16 e 46 ° C. O primeiro 7 min estavam constantemente a 22 ° C permitir que voa para explorar a arena. Espécies foram significativamente diferentes (duas vias F(4,70) de ANOVA RM = 28.46, p < 0,001). (a) d. melanogaster (marrom; cheio de círculos) foi mais rápido quando introduzido para a arena. (b) d. yakuba (vermelho; esvaziar quadrados) foi mais rápido, como aumentada de temperatura. (c) d. suzukii (marrom quadrado preenchido) foi mais lento do que as outras moscas cosmopolitas no seu ponto de desempenho máximo. (d) d. simulans (marrom; esvaziar círculos) estava em decadência no ponto máximo de D. melanogaster. Cada ponto representa a média (± SEM) de 15 moscas machos 5 a 7 dias de idade testados ao longo de vários dias. Importância indicada pelos símbolos (♦ = diferença de todos, p < 0,0001; † = diferença de todos, exceto d. melanogaster, p < 0,0001; • = diferença de d. melanogaster, p < 0,01; ¢ = diferença de d. melanogaster, p < 0,001; = diferença entre grupos nomeados, p < 0,0001; Tukey o teste de comparação múltipla, p = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: temperatura controlada arena pode ser usada para o condicionamento operante. Estirpe de Cantão-S d. melanogaster (wild-type; preto fronteira) e dnc1 (burro; borda vermelha) mutantes foram treinados para preferir uma telha lateral a 22 ° C após aquecimento no meio e em frente laterais telhas a 40 ° C por 4 min (formação, não teste padrão). Memória das áreas aquecidas é então testada definindo todas as telhas para 22 ° C (teste; padrão de grade). Moscas foram condicionadas a preferir telhas à esquerda na metade das experiências e, em seguida, telhas da direita na outra metade. A porcentagem do tempo total dentro da telha a 22 ° C, durante o treinamento e os testes foi medida para comparar performances. Grupos foram significativamente diferentes (One-Way ANOVA F(3,76) = 23.23, p < 0,0001), com burro desempenho pior do que o selvagem-tipo geral. Dados são média (± SEM) de 20 virgens femininas moscas 5 a 7 dias de idade testados ao longo de vários dias. Asteriscos indicam diferença de significado entre os grupos (* * * p > 0,0001; * * * p > 0,001; * * p > 0,01; Tukey o teste de comparação múltipla, p = 0,05) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: resposta de mutantes de temperatura para aumentar a temperatura quando é fornecido um local confortável. Mutantes de temperatura Gr28b.d (verde; praças) respondem como controles (w1118, preto; círculos), aumentando a porcentagem de tempo na área confortável enquanto a temperatura aumenta (bidirecional RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 mutantes (amarelo; triângulos) são diferentes dos controles (w1118, preto), como eles não aumentam o tempo na área confortável enquanto a temperatura aumenta (bidirecional RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0,019). Dados são média (± SEM) de 20 moscas machos 5 a 7 dias de idade testados ao longo de vários dias. TrpA1GAL4 é significativamente diferente do Gr28b.d e o controle (p < 0,05; Tukey o teste de comparação múltipla, p = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós apresentamos uma automatizado controlado por temperatura arena (Figura 1) que produz alterações de temperatura preciso no tempo e no espaço. Esse método permite que a exposição de individuais drosófila não só para pré-programados aumentos graduais de temperatura (Figura 2 e Figura 3), mas também aos desafios de temperatura dinâmica em que cada telha da arena voar era aquecida independentemente a uma temperatura diferente (Figura 4 e Figura 5).
A arena de temperatura controlada utiliza uma abordagem inovadora para o processo de aquecimento. Em vez de produzir mudanças de temperatura nas telhas através de elementos de aquecimento Peltier termoelétrica usados em métodos tradicionais, a arena de temperatura controlada usa atual para aquecer uma massa cobre com as telhas de cobre, e moscas são colocadas no topo. A massa de cobre constantemente é arrefecida por um bloco de dissipador de calor, ligado a um ventilador. Peltier, como elementos são usados para manter a temperatura desejada da massa cobre uma vez que ele tem sido aquecido. Porque esses elementos não são os geradores de temperatura principal, sofrem menos stress, que estende sua vida útil e permite mudanças mais rápidas de temperatura. Um circuito programável que recebe feedback dos sensores de temperatura sob cada telha cobre, que pode também ativar a fonte de alimentação de baixa tensão, coordena o mecanismo de aquecimento. Pesquisadores podem especificar quando e onde as mudanças de temperatura ocorrem e determinam a intensidade e a direção de tais mudanças. Além disso, o método de acoplamento com especializada software de monitoramento, tais como FlySteps, permite a análise de todos os aspectos relativos à circulação da drosófila , tais como a velocidade total em determinadas temperaturas ou tempo gasto em determinados locais ( Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5). No entanto, todos os resultados devem considerar características inerentes a voar de comportamento que pode afetar sua locomoção. Por exemplo, se moscas não são permitidas para explorar a arena e liquidar antes de mudar a temperatura, as medições de velocidade podem ser artificialmente elevadas (Figura 2). Moscas também podem deixar odores que afetam moscas subsequentes; Portanto, a tampa de vidro deve ser limpo, e fita cobrindo as telhas deve ser alterada entre os sujeitos. Dado que a locomoção declina enquanto voa a idade26, é importante que moscas são padronizadas por idade evitar a variação nos resultados. Em nossa arena, moscas também mostraram centrophobism, preferindo bordas sobre área média. Experimentadores devem controlar para isso, alterando a localização das áreas confortáveis para evitar superestimando a preferência de local.
As características atuais da arena e requisitos do processo de rastreamento poderiam limitar alguns procedimentos experimentais. Por exemplo, o ambiente próximo da arena não inclui pontos de acesso, através do qual poderiam ser introduzidos odores, que impede que estudos em que esse estímulo é importante. Da mesma forma, o rastreador de FlyStepts necessita de vídeos com fundos uniformes, que limita a possibilidade de acrescentar alimentos ou outros itens ao ambiente da mosca. A arena pode ser adaptada para incluir uma conexão a uma válvula de gás, e desenvolvimentos de software existem que podem permitir mais objetos estar presente. Futuros projetos podem tirar proveito dessas possibilidades para adaptar a arena de temperatura controlada para necessidades específicas experimentais.
Finalmente, temos mostrado nos resultados que diferentes espécies de Drosophila executam de forma diferente conforme a temperatura aumenta (Figura 3) e que os mutantes de temperatura não respondem da mesma forma como controles (Figura 5). Isto mostra que este novo método pode ser usado para explorar o comportamento térmico da drosófila e como é afetado pela seleção natural e características funcionais. Finalmente, ele ilustra que nosso método pode ajudar ainda mais a compreensão da adaptação térmica e especiação, bem como as interações dos receptores de temperatura com outros estímulos estuda no futuro.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma bolsa de estudos da Behavioural e programa de neurociência cognitiva da Universidade de Groningen e uma bolsa de estudos de pós-graduação do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) do México, concedida a Andrea Soto-Padilla e uma doação da Fundação John Templeton, para o estudo de tempo atribuído a Hedderik van Rijn e Jean-Christophe Billeter. Nós também somos gratos a Peter Gerrit Bosma por sua participação no desenvolvimento do rastreador de FlySteps .
Scripts TemperaturePhases, FlySteps e FlyStepAnalysis podem ser encontrado como informação suplementar e no seguinte link temporário e publicamente disponível:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
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