Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att automatiskt avgöra Drosophila rörelseapparaten prestanda på förändrade temperaturer med hjälp av en programmerbar temperaturreglerade arena som ger snabb och korrekt temperaturförändringar i tid och rum.
Abstract
Temperaturen är en allestädes närvarande miljöfaktor som påverkar hur arter distribuera och uppträda. Olika arter av Drosophila bananflugor har specifika svar på förändrade temperaturer enligt deras fysiologiska tolerans och anpassningsförmåga. Drosophila flugor också äger en temperaturkännande system som blivit grundläggande förståelse personlighetens grund i temperatur behandling i ectotherms. Vi presenterar här en temperatur-kontrollerad arena som tillåter snabb och exakt temperaturförändringar med temporal och spatial kontroll att utforska svaret av enskilda flugor till förändrade temperaturer. Enskilda flugor placeras i arenan och utsätts för förprogrammerad temperatur utmaningar, såsom enhetlig gradvis ökar i temperatur att bestämma reaktion normer eller rumsligt distribuerade temperaturer samtidigt att bestämma inställningar. Enskilda personer spåras automatiskt, så att kvantifiering av hastighet eller läge preferens. Denna metod kan användas för att kvantifiera snabbt svar över ett stort utbud av temperaturer att bestämma temperaturen prestanda kurvor i Drosophila eller andra insekter av liknande storlek. Dessutom kan det användas för genetiska studier för att kvantifiera temperatur inställningar och reaktioner av mutanter eller vildtyp flugor. Denna metod kan hjälpa avslöja grunden för termisk artbildning och anpassning samt de neurala mekanismerna bakom temperatur bearbetning.
Introduction
Temperaturen är en konstant faktor som påverkar hur organismerna fungerar och beter sig1. Skillnader i latitud och höjd leda till skillnader i typ av klimat som organismen utsätts för, vilket resulterar i evolutionärt urval för sina svar till temperatur2,3. Organismer reagerar för olika temperaturer genom morfologiska, fysiologiska och beteendemässiga anpassningar som maximerar prestanda under deras särskilda miljöer4. Exempelvis i bananflugan Drosophila melanogasterhar populationer från olika regioner olika temperatur inställningar, storlekar, utvecklingsmässiga gånger, livslängd, fruktsamhet och promenader prestanda vid olika temperaturer2 ,5,6,7. Den mångfald som observerats mellan flugor av olika ursprung förklaras delvis av genetisk variation och plast gen uttryck8,9. Likaså Drosophila arter från olika områden fördela annorlunda bland temperaturgradienter och Visa skillnader i motstånd mot extrem värme och kalla tester10,11,12.
Drosophila har också nyligen blivit modellen av val att förstå den genetiska och neurala grunden temperatur perception13,14,15,16,17. Broady, vuxna flugor uppfattar temperatur genom kalla och varma perifer temperatursensorer i antenner och temperaturgivare i hjärnan13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. perifera receptorerna för varma temperaturer express Gr28b.d16 eller pyrexi21, medan periferin kalla receptorer kännetecknas av Brivido14. I hjärnan bearbetas temperatur av nervceller som uttrycker TrpA115. Beteendemässiga studier på mutanter av dessa vägar är att förbättra vår förståelse av hur temperatur bearbetas och ge insikter om mekanismer som varierar mellan olika populationer av Drosophila från olika regioner.
Här beskriver vi en temperatur-kontrollerad arena som ger snabb och exakt temperaturförändringar. Utredarna kan pre programmera dessa förändringar, som gör det möjligt för standardiserade och repeterbar temperatur manipulationer utan mänsklig inblandning. Flugor registreras och spåras med specialiserad mjukvara för att bestämma sin position och hastighet i olika faser av ett experiment. Den viktigaste mätningen presenteras i detta protokoll är gånghastighet vid olika temperaturer, eftersom det är ett ekologiskt relevanta index av fysiologiska prestanda som kan identifiera enskilda termisk anpassningsförmåga5. Tillsammans med temperatur receptor mutanter, kan denna teknik hjälpa avslöja mekanismerna av termiska anpassning på cellulära och biokemiska nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av flyga mat Medium
- 1 L vatten och häll i en 2 L glasbägare magnetiska rör bar. Sätta bägaren på en magnetisk värmeplatta vid 300 ° C tills kokande temperatur uppnås.
- Rör vid 500 rundor/min och tillsätt följande: 10 g agar, 30 g glukos, 15 g sackaros, 15 g majsmjöl, 10 g av vetegroddar, 10 g av sojamjöl, 30 g av melass och 35 g av aktiv torrjäst.
- När mixen skum kraftigt, sväng ner värmeplatta temperaturen till 120 ° C under fortsatt omrörning.
- Sväng värmeplatta temperaturen ytterligare ner till 30 ° C efter 10 min och fortsätt under omrörning tills blandningen svalnar till 48 ° C. Mät temperaturen genom att sätta in en termometer direkt i maten utan att vidröra väggarna i bägaren.
- Lös upp 2 g p-hydroxy-benzoic acid methyl Ester i 10 mL 96% etanol och lägga till mixen, tillsammans med 5 mL 1 M propionsyra. Fortsätt omrörningen i 3 min.
- Inaktivera värmeplattan och häll uppfödning flaskorna och 6,5 mL mat till samling injektionsflaskorna 45 mL mat.
2. beredning av flugor
- Placera 20 män och 20 kvinnor flyger i uppfödning flaskorna innehåller 45 mL flyga mat medium. Överföra flugorna till nya flaskor efter 3 till 4 dagar genom att trycka dem ner och sedan utnyttja dem färska flaskorna. Kassera flugorna efter tre förändringar.
- Placera flaskorna inuti inkubatorn under 12-h ljus/12-h mörka cykler med en konstant temperatur av 25 ° C.
Obs: En ny generation av flugor kommer eclose efter tio dagar.
- Placera flaskorna inuti inkubatorn under 12-h ljus/12-h mörka cykler med en konstant temperatur av 25 ° C.
- Söva nyligen eclosed flugor på koldioxid pads för upp till 4 min och samla dem i 2.5 x 9,5 cm flyga uppfödning injektionsflaskor med 6,5 mL flyga mat medium med en pensel.
- Samla bara oskuld flugor och separera dem med sex i grupper om 20 flugor per uppfödning injektionsflaska.
- Placera rören inuti inkubatorer för 5-7 dagar, förändras flyger till nya flaskor varje 2-3 dagar och dagar innan experiment.
3. ram av lampor
- Göra en träram av 10 cm längd, bredd 4 cm, höjd 4 cm och 0,5 cm tjock.
- Skapa en kant av 4 cm längd, höjd 4 cm och 1,5 cm Bredd mot insidan på varje kortsidorna, område med träram. Lämna gränserna öppna inre ansikte.
- Borra två hål diameter 0,5 cm i skärningspunkten mellan en av de långa kanterna på träram och på varje av gränserna på kortsidorna.
- Plats 10 cm en varm vit LED Strip inuti varje av gränserna på kortsidorna. Skala på baksidan av den LED strip till omedelbart limma den på plats.
Obs: För experiment i vilken belysning behöver elimineras, varm vit LED strip kan ersättas för IR LED strips. - Anslut ena änden av den LED strip i en av gränserna till det switchade nätaggregatet och dess andra änden till LED strip på motsatt gränsen.
- Aktivera det switchade nätaggregatet för att kontrollera att båda LED strips slå på.
- Täck den öppna sidan av varje gränsen med ett vitt papper.
- Limma en annan papperslapp till var och en av de interna faserna av långsidorna.
4. temperatur-kontrollerad Arena
- Slå på arenan temperaturreglerade (figur 1A och 1 C). Se till att fläkten startar och aluminium ringen börjar värmas upp.
- Använda en USB-kabel för att ansluta arenan temperaturreglerade kontroll datorn som kör skriptet TemperaturePhases med temperatur sekvenser.
- Öppna skriptet TemperaturePhases i kontroll datorn och kontrollera att sekvensen temperatur är korrekt inställd (Video 1).
- Kontrollera att varaktigheten av varje experimentell fas är inställd till 60 s genom att verifiera att ”par. StimulusDur ”är lika med 60 s.
- Kontrollera att (1) antalet lika med önskat antal faser, 2) iterativ ON/OFF set-up av den vägledande röda lysdioder (LEDs), 3) 2 ° C temperaturökning per fas, och 4) 16 ° C som start temperatur är alla rätt under ”Start i experimental «««blockera ”avsnitt.
Obs: Låt flugorna till acclimate till flyga Arena för 7 min på 16 ° C till undvika en konstgjord ökning av hastigheten under de första experimentella faserna (figur 2). - Kör skriptet TemperaturePhases . Programvaran kommer att initiera i 5 sekunder som bestäms i ”arena. Vänta ”och sedan sluta.
- Tryck på blanksteg på tangentbordet för att börja köra de experimentella faserna när en fluga har blåsts in i flyga Arena (steg 5.3).
Obs: Den TemperaturePhases är det aktuella scriptet kontrollerar rutan. Det är dock möjligt att skapa andra anpassade skript för att använda denna enhet att anpassar sig till kraven i olika experiment.
- Anslut kameran ovanpå arenan till inspelning datorn med hjälp av kamerans USB-kabel.
- Öppna programmet videoinspelning (se Tabell för material) i inspelning datorn genom att välja ”fil | Ny filminspelning ”. En skärm som visar bilden från kameran öppnas.
- Se till att kamerabilden fångar alla kanter av arenan och de vägledande röda lysdioderna.
- Starta inspelningen genom att trycka på den röda knappen i mitten av skärmens nedre kant visar kamerabilden när ramen för lamporna ligger runt arenan (steg 5,4).
Obs: små förändringar i belysning kan påverka noggrannheten av spårning. Det rekommenderas att hålla belysningen av arenan temperaturreglerade konstant genom att fastställa platsen för apparaten.
5. temperatur beteende experiment
- Förbereda den flyga arenan (figur 1 c).
- Placera en del av vit konduktiv tejp på toppen av koppar brickor, se till att alla kanter täcks.
- Placera den uppvärmda aluminium ringen runt koppar plattorna. Kanten av ringen passar perfekt runt koppar plattorna så det placeras alltid på samma plats.
- Rengöra glaset locket med en ren trasa och placera den på toppen av aluminium ringen, lämnar en lucka genom vilken en fluga kan blåsas i.
Obs: Innan experimenten, täck locket glas med siliconizing agent att skapa en hal yta. Applicera den siliconizing agenten för 24 h och skölj med vatten före användning.
- Kör skriptet TemperaturePhases (steg 4.3.3) och öppna programmet videoinspelning (steg 4,5).
- Blåsa i farten från en uppfödning injektionsflaska (steg 2.2.2) i arenan flyga (t.ex., 1 hane flyga i figur 3).
- Ta en flaska med flugor ur ruvmaskinen, tryck på den två gånger för att tvinga dem att gå till botten, fånga en fluga med en mun insugningsventil, och Stäng flaskan och sätt tillbaka i inkubatorn.
- Placera flugan i arenan genom den lucka som har lämnats mellan glaskupa och aluminium ring (steg 5.1.3).
- Överbrygga klyftan mellan glaskupa och aluminium ring genom att trycka luckan glas tills den når kanten av aluminium ringen så fort flugan introduceras till flyga Arena.
- Placera ramen av ljus runt arenan att säkerställa symmetrisk belysning.
- Markera platsen (t.ex., med en permanent markörpenna) av ramen av ljus runt flyga arenan (figur 1 c) att se till att ramen placeras alltid på samma plats.
- Starta inspelningen med videoinspelning program (steg 4.5.2) och tryck på mellanslagstangenten på tangentbordet på datorn för kontroll att börja köra de experimentella faserna (steg 4.3.4).
- Efter alla experimentella faser är klar, spara video i MP4- eller AVI-format och ta bort flugan från arenan flyga med munnen Sugenheten.
Obs: I slutet av de experimentella faserna kan bestämmas genom både vägledande röda lysdioder att vara avstängd eller TemperaturePhases skriptet stoppa.- Stoppa videoinspelning genom att trycka på stop-knappen i mitten av skärmens nedre kant i programmet för inspelning. Tryck på ”fil | Spara som ”att spara videon.
6. video spårning och analys av Data
- Använda den FlySteps spårning programvara (Video 2) för att spåra videor.
- Öppna den ”configuration_file.ini” i mappen ”FlyTracker”.
- Ange platsen för video i ”video_folder” och namnen på videor i ”video_files”.
- Ange den flyga Arena i ”arena_settings” baserat på gränser (x, y) bildpunktskoordinater flera punkter vid kanten av arenan.
- Ange platsen för de vägledande röda lysdioderna i ”led_settings” baserat på (x, y) pixel koordinaterna för placeringen av centrera av lysdioderna.
- Kontrollera placeringen av arenan flyga gränser genom att ange ”debug” till ”true” i ”arena_settings”, klicka på ”Spara” och kör skriptet i terminalen. En skärmbild av videon visas med en blå fyrkant som bildas av de koordinater som matas in i ”arena_settings”.
Obs: Denna ruta omger området spåras. - Ändra ”debug” i ”arena_settings” till ”false”, klicka på ”Spara” och köra skärmen i terminalen gång.
Obs: Detta startar processen spårning.
Obs: Flugor kan gå ut ur området spårning på den uppvärmda aluminium ringen. Detta händer under de första sekunderna av ett experiment, varefter flugor sluta röra uppvärmd ringen och förbli inom området spårning.
Obs: Videor kan spåras med andra spårningsprogram enligt de experimenter's önskemål.
- Användning (x, y) läge av varje fluga som tillhandahålls av mjukvara att beräkna måttet av intresse för temperatur prestanda. Anpassade skript (t.ex., FlyStepsAnalysis i kompletterande) kan användas.
- Jämför den temperatur prestanda kurvor av olika flyga grupper som använder upprepade mätningar (RM) variansanalys (ANOVA) och post-hoc- multipla jämförelser med hjälp av statistisk programvara (se Tabell för material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temperaturreglerade arenan (figur 1A) består av tre koppar brickor vars temperatur kan styras individuellt via en programmerbar krets. Varje koppar bricka äger en temperatursensor som ger feedback till programmerbara krets. Kretsen aktiveras ett nätaggregat för att höja temperaturen i varje platta. Passiva termoelektriska element fungera som konstant värmeelement för att upprätthålla den önskade temperaturen, medan en kylfläns som kyls av en fläkt ger konstant kylning. Omfattningen av temperaturförändring bestämmer hastigheten på processen i ett icke-linjärt sätt. En ökning med 2 ° C kräver bara 0,1 s, och en ökning med 18 ° C kräver 4 s. En skärm som är ansluten till den programmerbara kretsen (figur 1 c) informerar användaren om temperaturen mäts av temperaturgivarna i var och en av brickorna. Koppar brickor är omgivna av en aluminium ring ständigt uppvärmt till 50 ° C (figur 1B och 1 C) av halvledare runt periferin. Denna ring bildar kanterna på flyga arenan (figur 1 c), det område där flugor kommer att placeras. Arenan flyga täcks av en silikoniserad glaskupa (figur 1A och 1 C), vilket ger en 3 mm hög utrymme som säkerställer att flugor kan gå men inte flyga. Bredvid arenan flyga finns två röda lysdioder (figur 1 c) som kan programmeras att markera olika experimentella faser. Till exempel för de resultat som visas i figur 2A, varje LED är associerad med annan temperatur, medan i figur 2B, varje LED indikerar 60 s. FlySteps programvaran kan registrera när var och en av de vägledande lysdioderna är på, och forskaren kan sedan använda informationen för att automatiskt avgöra de experimentella faser utifrån temperatur eller tid.
Temperaturreglerade arenan kan användas till jämföra den beteendemässiga Svaren av flugor från olika genetiska bakgrunder för dynamisk temperaturförändringar. Till exempel kan flugor från olika arter utsättas för gradvis ökande temperaturer (figur 3) för att jämföra skillnader i termisk prestanda. Hastigheten på alla arter ökar när temperaturen ökar tills de når en punkt av maximal prestanda, varefter den skämda och omkom. Varje art har dock en viss responskurva med specifika maximirespons hastigheter och termisk toleranser. Tidigare rapporter har visat som Drosophila från olika arter skiljer sig bland utvecklingsmässiga timing, livslängd, fruktsamhet, karosstorlek, sexuell kommunikation och temperatur tolerans3,6,7 ,8,22. Således vår Beskrivning av artspecifika förflyttning i en temperaturgradient lägger till detta organ arbete.
Temperaturreglerade arenan kan också användas att utforska svaret på luftkonditionering experiment utifrån temperatur. Den enklaste formen av detta tillvägagångssätt är en operant betingning paradigm där flugor är utbildade att föredra en sida av arenan över det andra, genom att värma upp den sida som kommer att undvikas23,24,25. Vi utsätts enskilda flugor till 40 ° C i mitten och en av sida kakel, medan andra sida kakel på en bekväm 22 ° C (figur 4). Vildtyp flugor snabbt slutat röra sig längs arenan och förblev i den bekväma läge. Däremot klassiska minne mutant dumbom höll utforska arenan och mindre tid än kontroller i den bekväma läge. Skillnaderna mellan prestanda Flugornas vildtyp och dumbom mutanter blev större när alla plattor sattes till 22 ° C och jämförelser gjordes mellan behandlingsgrupperna. Dumbom mutanter visade också större skillnader mellan utbildning och testfaser i jämförelse med vildtyp flugor (figur 4). Dessa resultat tyder på en påverkan minne på kvar i den bekväma läge.
Kombinationer av temperatur och läge är också användbart för att förstå funktionen av olika temperatur receptorer under dynamiska temperaturförändringar. Vi utsätts enskilda D. melanogaster Gr28b.d och TrpA1GAL4 mutanter att stigande temperaturer (2 ° C öka varje 60 s) samtidigt som den ger ett bekvämt läge vid 22 ° C (figur 5). Den bekväma läge skiftade från vänster till höger, och vice versa, per iteration. Resultaten visar att periferin temperatur receptor Gr28b.d mutanter beter sig som kontroll, eftersom de tillbringar mer tid i den bekväma läge när temperaturen ökar. Men hjärnan temperatur receptor TrpA1GAL4 mutanter påverkas inte av stigande temperaturer och ändrar inte deras platser i arenan. De ökar och minskning av kurvan för TrpA1GAL4 mutanter visar effekten i flugor som satt redan i den bekväma läge innan det blev bekväma och förblev det under denna fas. Konsekvens av topparna och Dalarna i kurvan för TrpA1GAL4 tyder på att dessa flugor förblev fortfarande för de flesta av experimentet; de räknades därför ständigt när deras läge var den anses vara bekväma. Denna slutsats bekräftades av okulärbesiktning av det inspelade videor. Dessa resultat stöd tidigare fysiologiska rapporter tyder på det periphery föreställningen av snabba och stora förändringar inte beror på Gr28b.d17 och att flugor har en viktigaste centrala mekanismen till sense temperatur utifrån TrpA1 14,21.
Figur 1: Diagram över temperaturen kontrolleras-arena. (A) en lateral bild av temperaturreglerade arena. En programmerbar krets ansluts en power supply och temperatur sensorer till värmeelement under koppar brickor för att styra sin temperatur. Kakel kyls ständigt ned genom en kylfläns som är ansluten till en fläkt. En uppvärmd aluminium ring som vilar en glaskupa omger brickor. (B) termisk avbildning visar brickor vid 24 ° C (överst) och sida brickor vid 24 ° C med en mellersta bricka vid 30 ° C (nederst). (C) A ovanifrån av arenan. En kamera registrerar den koppar kakel, aluminium ring och röda lysdioder, sedan avgör automatiskt experimentella faser. En skärm i hörnet av rutan inte registreras av kameran, visar den aktuella temperaturen i kakel. (D) ring av ljus: två varm vit LED strips inuti en trälåda som behandlas i vitboken säkerställa konstant och symmetrisk belysning av hela arenan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flugor måste acklimatisera till arenan innan protokollet temperatur. (A) enda manliga flugor infördes till arenan och tillåtet att utforska vid en konstant 16 ° C i 1 min, varefter temperaturen började öka. (B) enstaka flugor utsätts för 16 ° C, 20 ° C eller 24 ° C (inga grupp skillnader; tvåvägs ANOVA F (2 570) = 4.156, p = 0.162) har en högre locomotion i början av experimentet än efter 5 min (tvåvägs RM ANOVA F (9 570) = 7.803, p < 0,0001). Uppgifterna är medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet (± SEM) av 20 oskuld kvinnliga flugor 5 till 7 dagar gamla testade över flera dagar. Asterisken indikerar signifikant skillnad mellan grupperna (*** p < 0,0001, Tukey är flera jämförande test, p = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förflyttning av 5 Drosophila arter utsätts för gradvis ökande temperaturer. Enskild hane flyger från tempererade (blått), tropical (röd) och kosmopolitiska (brun) Drosophila arter utsattes för en ökande temperaturgradient (2 ° C var 60 s) mellan 16 och 46 ° C. De första 7 min skulle ständigt vid 22 ° C tillåta flugor att utforska arenan. Arterna var signifikant (tvåvägs RM ANOVA F(4,70) = 28.46, p < 0,001). (a) D. melanogaster (brun; fyllda cirklar) var snabbare när arenan. (b) D. yakuba (röda; tomma rutor) var snabbare som temperaturen ökat. (c) D. suzukii (brun; fylld kvadrat) var långsammare än andra kosmopolitiska flugorna på sin maximala prestanda punkt. (d) D. simulans (brun, Töm cirklar) var i förfall vid den högsta punkten i D. melanogaster. Varje punkt representerar medelvärdet (± SEM) av 15 manliga flugor 5 till 7 dagar gamla testade över flera dagar. Betydelse indikeras av symboler (♦ = skillnaden från alla, p < 0,0001, † = skillnaden från alla utom D. melanogaster, p < 0,0001; • = skillnad från D. melanogaster, p < 0,01; ¢ = skillnad från D. melanogaster, p < 0,001; = skillnaden mellan namngivna grupper, p < 0,0001, Tukey är flera jämförande test, p = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: temperatur-kontrollerad arenan kan användas för operant betingning. D. melanogaster Canton-S stam (vildtyp; svart gränsen) och dnc1 (dumbom; röd kantlinje) mutanter utbildades att föredra en lateral kakel vid 22 ° C efter uppvärmningen mitten och mittemot lateral plattor till 40 ° C under 4 minuter (utbildning, inte mönster). Minnet av de uppvärmda områdena testas sedan genom att ange alla brickor till 22 ° C (test; rutmönster). Flugorna var betingad att föredra plattor till vänster under hälften av experimenten, sedan plattor till höger i den andra halvan. Procentandelen av total tid inuti panelen vid 22 ° C under utbildning och testning mättes för att jämföra föreställningar. Grupperna var signifikant (one-way ANOVA F(3,76) = 23,23, p < 0,0001), med dumbom utför värre än vildtyp övergripande. Uppgifterna är medelvärdet (± SEM) av 20 oskuld kvinnliga flugor 5 till 7 dagar gamla testade över flera dagar. Asterisker visar betydelsen skillnad mellan grupperna (*** p > 0,0001, *** p > 0,001; ** p > 0,01; Tukey är flera jämförande test, p = 0,05) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: svar av temperatur mutanter på ökande temperatur när en bekväm plats tillhandahålls. Temperatur mutanter Gr28b.d (green; fyrkanter) svara som kontroller (w1118, svart, cirklar) genom att öka procentandelen av tiden i området bekväma när temperaturen ökar (tvåvägs RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0,479). TrpA1GAL4 mutanter (gul; trianglar) skiljer sig från kontrollerna (w1118, svart), eftersom de inte ökar tiden i området bekväma när temperaturen ökar (tvåvägs RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0,019). Uppgifterna är medelvärdet (± SEM) av 20 manliga flugor 5 till 7 dagar gamla testade över flera dagar. TrpA1GAL4 skiljer sig markant från Gr28b.d och kontroll (p < 0,05; Tukey är flera jämförande test, p = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi presenterat en automatiserad temperaturreglerade arena (figur 1) som producerar exakt temperaturförändringar i tid och rum. Denna metod tillåter exponering av enskilda Drosophila inte bara till förprogrammerade gradvis ökning av temperaturen (figur 2 och figur 3), men också till dynamiska temperatur utmaningar där varje kakel flyga Arena var uppvärmd självständigt till en annan temperatur (figur 4 och figur 5).
Temperaturreglerade arenan använder en innovativ strategi att uppvärmningsprocessen. Istället för att producera temperaturförändringar i kakel genom termoelektrisk Peltier värmeelement som används i traditionella metoder, arenan temperaturreglerade använder aktuella för att värma upp en koppar massan med koppar brickor och flugor är placerade på toppen. Koppar massan kyls hela tiden ner av en kylfläns block ansluten till en fläkt. Peltier-liknande element används för att upprätthålla den önskade temperaturen av koppar massan när det har värmt. Eftersom dessa element inte är den huvudsakliga temperatur generatorer, lider de mindre stress, vilket förlänger deras livslängd och tillåter snabbare temperaturförändringar. En programmerbar krets som tar emot feedback från temperaturgivare under varje koppar kakel, som kan också aktivera låg spänning strömförsörjningen, samordnar mekanismen för uppvärmning. Forskare kan ange när och var temperaturförändringar uppstå och bestämma intensitet och riktning av sådana förändringar. Dessutom möjliggör koppling metoden med specialiserad mjukvara, såsom FlySteps, analys av alla aspekter på Drosophilas rörelse, såsom den totala hastigheten på vissa temperaturer eller tid i vissa platser ( Bild 2, bild 3, bild 4, bild 5). Alla resultat måste dock överväga egenskaper inneboende att flyga beteende som kan påverka deras förflyttning. Till exempel om flugor inte är tillåtna att utforska arenan och betala innan du ändrar temperaturen, hastighetsmätningar skulle vara konstlat höga (figur 2). Flugor kan också lämna odoranter som påverkar efterföljande flugor; Därför luckan glas måste rengöras, och band som täcker plattorna måste ändras mellan ämnen. Eftersom locomotion minskar som flyger ålder26, är det viktigt att flugor är standardiserat för ålder att undvika variation i resultat. I vår arena, har flugor också visat centrophobism, föredrar kanterna över det mellersta området. Praktiker måste styra för detta genom att ändra placeringen av bekväma utrymmen att förhindra överskattar webbplats preferens.
Kraven i processen spårning och arenan aktuella egenskaper kan begränsa vissa experimentella procedurer. Till exempel inkluderar nära miljön av arenan inte åtkomstpunkter genom vilken lukt kunde införas, som förhindrar studier där denna stimulans är viktigt. Likaså nödvändiggör FlyStepts tracker videor med enhetliga bakgrunder, vilket begränsar möjligheten att lägga till livsmedel eller andra objekt i flugans miljö. Arenan skulle kunna anpassas till inkluderar en anslutning till en gasventil, och programvara utveckling existerar som kan tillåta fler objekt att närvara. Framtida projekt kan utnyttja dessa möjligheter att anpassa arenan temperaturreglerade experimentella behov.
Slutligen har vi visat i de resultat som olika arter av Drosophila utföra annorlunda eftersom temperaturen ökar (figur 3) och som temperatur mutanter inte svarar på samma sätt som kontrollerna (figur 5). Detta visar att denna nya metod kan användas för att utforska Drosophilas termiska beteende och hur den påverkas av naturligt urval och funktionella egenskaper. Slutligen, det visar att vår metod kan hjälpa ytterligare förståelse för termiska anpassning och artbildning samt samspelet mellan temperatur receptorer med andra stimuli i framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av ett stipendium från beteende och kognitiv neurovetenskap Program av universitetet i Groningen och graduate stipendium från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) från Mexiko, beviljas till Andrea Soto-Padilla, och ett bidrag från stiftelsen John Templeton för studien av tid tilldelas Hedderik van Rijn och Jean-Christophe Billeter. Vi är också tacksamma att Peter Gerrit Bosma för hans deltagande i utvecklingen av FlySteps tracker.
Skript TemperaturePhases, FlySteps, och FlyStepAnalysis kan hittas som kompletterande information och i följande tillfälliga och allmänt tillgängliga länk:
https://Dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
