Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.
Abstract
Temperatur ist eine allgegenwärtige Umweltfaktor, das betrifft wie Arten verteilen und Verhalten. Verschiedene Arten von Drosophila Fruchtfliegen haben spezifische Reaktionen auf wechselnde Temperaturen entsprechend ihrer physiologischen Toleranz und Anpassungsfähigkeit. Drosophila -fliegen besitzen auch eine Temperatur sensing-System, die grundlegend für das Verständnis der neuronalen Grundlagen der Temperatur, die Verarbeitung in Kaltblütler geworden ist. Wir stellen Ihnen hier eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen mit zeitlichen und räumlichen Steuerung, die Reaktion der einzelnen fliegen zu erkunden, wechselnde Temperaturen zulässt. Einzelne fliegen sind in der Arena platziert und vorprogrammierte Temperatur Herausforderungen ausgesetzt, wie einheitliche schrittweise Temperatur Reaktion Normen bestimmen oder räumlich verteilten Temperaturen gleichzeitig Vorlieben bestimmen erhöht. Einzelpersonen werden automatisch erfasst und erlauben die Quantifizierung der Geschwindigkeit oder Standort bevorzugt. Diese Methode kann verwendet werden, um schnell die Antwort über eine große Auswahl an Temperaturen Leistung Temperaturkurven in Drosophila bestimmen oder andere Insekten von ähnlicher Größe zu quantifizieren. Darüber hinaus kann es für genetische Studien verwendet werden, um Temperatur-Einstellungen und Reaktionen der Mutanten und Wildtyp fliegen zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, die Grundlage der thermischen Speziation und Anpassung sowie die neuronalen Mechanismen hinter Temperatur Verarbeitung aufzudecken.
Introduction
Temperatur ist eine Konstante Umweltfaktor, das betrifft, wie Organismen funktionieren und1Verhalten. Unterschiede in Breite und Höhe führen zu Unterschieden in der Art des Organismus ausgesetzt sind, die Ergebnisse in evolutionäre Auswahl für ihre Reaktionen auf Temperatur2,3Klimazonen. Organismen reagieren auf unterschiedliche Temperaturen durch morphologischen, physiologischen und verhaltensbezogenen Anpassungen, die maximale Leistung unter ihre besondere Umgebungen-4. Zum Beispiel haben in der Taufliege Drosophila Melanogaster, Populationen aus verschiedenen Regionen unterschiedliche Temperatur-Einstellungen, Körpergrößen, Entwicklungsstörungen Times, Langlebigkeit, Fruchtbarkeit und walking Leistung bei unterschiedlichen Temperaturen2 ,5,6,7. Die Vielfalt zwischen fliegen unterschiedlicher Herkunft beobachtet wird teilweise durch genetische Variation und Kunststoff Gen Ausdruck8,9erklärt. In ähnlicher Weise Drosophila -Arten aus verschiedenen Bereichen Temperaturgradienten anders verteilen und zeigen Unterschiede im Widerstand zu extremer Hitze und Kälte Tests10,11,12.
Drosophila ist vor kurzem auch das Modell der Wahl zu verstehen, die genetischen und neuronalen Grundlagen der Temperatur Wahrnehmung13,14,15,16,17geworden. Im großen und ganzen wahrnehmen Erwachsene fliegen Temperatur, durch kalte und warme periphere Temperatur-Sensoren in die Antennen und Temperatursensoren im Gehirn13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. die Peripherie-Rezeptoren für heiße Temperaturen auszudrücken, Gr28b.d16 oder Pyrexie21, während die Peripherie Kälterezeptoren zeichnen sich durch Brivido14. Im Gehirn wird die Temperatur von Neuronen, die mit dem Ausdruck TrpA115verarbeitet. Verhaltensstudien an Mutanten dieser Wege sind besser zu verstehen wie Temperatur verarbeitet wird und geben Einblicke in die Mechanismen, die Populationen von Drosophila aus verschiedenen Regionen sehr unterschiedlich sind.
Hier beschreiben wir eine temperaturgeführte Arena, die schnelle und präzise Temperaturänderungen produziert. Die Ermittler können diese Änderungen vorprogrammieren ermöglicht die standardisierte und reproduzierbare Temperatur Manipulationen ohne menschliches Zutun. Fliegen sind erfasst und verfolgt mit Spezialsoftware ihre Position und Geschwindigkeit in verschiedenen Phasen eines Experiments bestimmen. Der Messbildschirm präsentiert in diesem Protokoll ist die Gehgeschwindigkeit bei verschiedenen Temperaturen, weil es ein ökologisch relevanter Index der physiologischen Leistungsfähigkeit, die einzelnen thermischen Anpassungsfähigkeit5identifizieren können. Zusammen mit Temperatur-Rezeptor Mutanten kann diese Technik helfen, die Mechanismen der thermischen Anpassung auf zelluläre und biochemische Ebene zeigen.
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Protocol
1. Vorbereitung des Mediums fliegen Essen
- Gießen Sie 1 L Leitungswasser in einem 2 L Becherglas und fügen Sie eine magnetische Stir Bar. Setzen Sie den Becher auf einer magnetischen Herdplatte bei 300 ° C, bis Siedetemperatur erreicht ist.
- Rühren Sie mit 500 Schuss/min und fügen Sie die folgenden: 10 g Agar, 30 g Glukose, 15 g Saccharose, 15 g Maismehl, 10 g Weizenkeime, 10 g Sojamehl, 30 g Melasse und 35 g aktive trockene Hefe.
- Wenn die Mischung kräftig schäumt, drehen Sie die Herdplatte Temperatur 120 ° c weiter rühren.
- Schalten Sie die Herdplatte Temperatur weiter auf bis zu 30 ° C nach 10 min und weiter rühren, bis die Mischung bis 48 ° C kühlt. Messen Sie die Temperatur, indem man einen Thermometer direkt in das Essen ohne Berührung der Wände des Bechers.
- Lösen Sie 2 g p-hydroxy-Benzoesäure Acid Methylester in 10 mL Ethanol 96 auf % und fügen Sie es auf die Mischung, zusammen mit 5 mL 1 M Propionsäure. Weiter rühren 3 Minuten lang.
- Die Kochplatte ausschalten und 45 mL von Lebensmitteln in die Aufzucht Flaschen und 6,5 mL Nahrung in die Sammlung Fläschchen füllen.
2. Vorbereitung der fliegen
- Platz 20 Männer und 20 Frauen fliegt in die Aufzucht Flaschen mit 45 mL fliegen Essen Medium. Übertragen Sie die fliegen zu neuen Flaschen nach 3 bis 4 Tagen durch Tippen sie nach unten und dann tippen sie in die frische Flaschen. Verwerfen Sie die fliegen nach drei Änderungen.
- Flaschen Sie die in die brutmaschine unter 12 h Licht/12-h dunkel Zyklen mit einer konstanten Temperatur von 25 ° C.
Hinweis: Eine neue Generation von fliegen wird Eclose nach zehn Tagen.
- Flaschen Sie die in die brutmaschine unter 12 h Licht/12-h dunkel Zyklen mit einer konstanten Temperatur von 25 ° C.
- Neu betäuben Sie geschlüpften fliegen auf Kohlendioxid-Pads für bis zu 4 min zu und sammeln sie in 2,5 x 9,5 cm fliegen Aufzucht Fläschchen mit 6,5 mL fliegen Essen Medium mit einem Pinsel.
- Sammeln Sie nur native fliegen zu und trennen Sie sie in Gruppen von 20 fliegen pro Fläschchen Aufzucht nach Geschlecht.
- Legen Sie die Fläschchen in Inkubatoren für 5-7 Tage, die fliegen zu ändern, um neue Fläschchen alle 2-3 Tage und an den Tagen zuvor Experimente.
3. Rahmen der Lichter
- Machen Sie einen Holzrahmen von 10 cm Länge, 4 cm breit und 4 cm Höhe 0,5 cm dick.
- Auf jeder der die kurzen Kanten, erstellen Sie einen Rand von 4 cm Länge, 4 cm Höhe und 1,5 cm breit nach innen Bereich des hölzernen Rahmens. Lassen Sie die Innenseite des Grenze geöffnet.
- Bohren Sie zwei Löcher von 0,5 cm Durchmesser an der Kreuzung eines langen Kanten des hölzernen Rahmens und an den Grenzen an den kurzen Kanten jeweils.
- Platz 10 cm einen warmen weißen LED Streifen innerhalb der einzelnen die Grenzen auf die kurzen Kanten. Schälen Sie die Rückseite des LED-Streifens, kleben sie sofort an Ort.
Hinweis: Streifen für Experimente in die Beleuchtung, die muss beseitigt werden, die warme weiße LED-Streifen für Infrarot-LED ersetzt werden kann. - Schließen Sie ein Ende des LED-Streifens in den Rand das Schaltnetzteil und seinem anderen Ende in den LED-Streifen auf der gegenüberliegenden Grenze.
- Schalten Sie das Schaltnetzteil um sicherzustellen, dass beide LED-Strips einschalten.
- Decken Sie die offene Seite des jeden Rand mit einem weißen Blatt Papier.
- Kleben Sie ein Stück Papier auf den internen Phasen von den langen Kanten.
4. temperaturgeführte Arena
- Schalten Sie die temperaturgeführte Arena (Abb. 1A und 1 C). Stellen Sie sicher, dass der Lüfter beginnt zu laufen und die Aluminium-Ring beginnt Aufwärmen.
- Verwenden Sie ein USB-Kabel, um die temperaturgeführte Arena an den Steuerrechner der TemperaturePhases Skriptausführung mit der Temperaturverläufe verbinden.
- Öffnen Sie das Skript TemperaturePhases in dem Steuerungsrechner und stellen Sie sicher, dass der Temperaturverlauf (Video 1) ordnungsgemäß eingerichtet ist.
- Prüfen, ob die Dauer der einzelnen Experimentierphase ist auf 60 s durch die Überprüfung dieser "Par. StimulusDur"entspricht 60 s.
- Überprüfen Sie, dass die Zahl 1) gleich gewünscht Anzahl der Phasen, 2) iterative ein-/Aufbau der indikativ rotes Licht emittierende Dioden (LEDs), (3) 2 ° C Temperaturerhöhung pro Phase, und (4) 16 ° C als der Starttemperatur sind alle richtig unter die "Start der experimentellen "Blockabschnitt.
Hinweis: Lassen Sie die fliegen zu akklimatisieren, fliegen Arena für 7 min bei 16 ° C, eine künstliche Erhöhung der Geschwindigkeit während der ersten experimentellen Phasen (Abbildung 2) zu vermeiden. - Das TemperaturePhases -Skript ausführen. Die Software wird für 5 Sekunden wie im "Arena. initialisieren. Warten"und dann wieder gestoppt.
- Drücken Sie die Leertaste der Tastatur geschaltet, die experimentelle Phasen einmal eine Fliege in die Arena zu fliegen (Schritt 5.3) gesprengt hat.
Hinweis: Die TemperaturePhases ist das aktuelle Skript, das Feld zu kontrollieren; Es ist jedoch möglich, andere benutzerdefinierte Skripts für die Verwendung dieses Geräts zu erstellen, die Anpassung an die Anforderungen der verschiedenen Experimente.
- Schließen Sie die Kamera auf die Arena zum aufnehmenden Computer mit USB-Kabels der Kamera.
- Öffnen Sie das video-Aufnahme-Programm (siehe Tabelle of Materials) in den Aufnahme-Computer durch Auswahl von "Datei | Neue Filmaufnahme". Es öffnet sich ein Bildschirm zeigt das Bild von der Kamera.
- Stellen Sie sicher, dass das Kamerabild alle Kanten der Arena und die indikativen roten LEDs erfasst.
- Die Aufnahme durch Drücken des roten Knopfes in der Mitte des Bildschirms Unterkante das Kamerabild angezeigt, sobald der Rahmen der Lichter rund um die Arena (Schritt 5.4) festgelegt ist.
Hinweis: kleine Änderungen in der Beleuchtung beeinflussen die Genauigkeit der Nachführung. Es empfiehlt sich, die Beleuchtung der temperaturgeführten Arena konstant zu halten, durch die Festlegung der Lage des Apparates.
(5) Temperatur Verhaltensexperimente
- Bereiten Sie die Fliege Arena (Abbildung 1).
- Legen Sie einen Strang von weißen leitfähigen Bändern auf der Oberseite der Kupfer Fliesen, sicherzustellen, dass alle Kanten abgedeckt sind.
- Legen Sie den beheizten Aluminium Ring um das Kupfer Fliesen. Der Rand des Ringes passt perfekt um das Kupfer Fliesen, so dass es immer an der gleichen Stelle platziert wird.
- Reinigen Sie die Glasabdeckung mit einem sauberen Tuch und legen Sie es auf der Oberseite der Alu-Ring, so dass eine Lücke, durch die eine Fliege eingeblasen werden kann.
Hinweis: Vor den versuchen Mantel der Glasdeckel mit dem siliconizing Agent, eine glatte Oberfläche zu schaffen. Gelten Sie die siliconizing Agents für 24 h und spülen sie mit Wasser vor dem Gebrauch.
- Führen Sie das Skript TemperaturePhases (Schritt 4.3.3) und öffnen Sie das video-Aufnahme-Programm (Schritt 4.5).
- Schlag die Fliege von einem Aufzucht Fläschchen (Schritt 2.2.2) in der Arena fliegen (zB., 1 männliche fliegen in Abbildung 3).
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit fliegen aus dem Inkubator, tippen sie zweimal, um zwingen, gehen nach unten, fangen eine Fliege mit einer Mund-Sauger, und schließen Sie das Fläschchen und setzen Sie ihn wieder in den Brutkasten.
- Legen Sie die Fliege in der Arena durch den Spalt, der zwischen dem Glasdeckel und Alu-Ring (Schritt 5.1.3) gelassen hat.
- Schließen Sie die Lücke zwischen Glasabdeckung und Alu-Ring durch die Glasabdeckung zu drücken, bis es erreicht den Rand der Alu-Ring, wie die Fliege fliegen Arena eingeführt wird.
- Legen Sie den Rahmen der Lichter rund um die Arena zu symmetrischen Ausleuchtung zu gewährleisten.
- Markieren Sie die Stelle (zB., mit einem wasserfesten Filzstift) des Rahmens der Lichter rund um die fliegen Arena (Abbildung 1) um sicherzustellen, dass der Rahmen immer an der gleichen Stelle platziert wird.
- Starten Sie die Aufnahme mit dem video-Aufnahme-Programm (Schritt 4.5.2) und drücken Sie die Leertaste auf der Tastatur des Steuerrechners, die experimentelle Phasen (Schritt 4.3.4) geschaltet.
- Nachdem alle experimentelle Phasen fertig sind, speichern Sie das Video in MP4 oder AVI-Format und die Fliege aus der Arena fliegen mit der Mund-Sauger entfernen.
Hinweis: Am Ende der experimentellen Phasen kann bestimmt werden durch beide indikative rote LEDs ausgeschaltet oder durch das TemperaturePhases Skript anhalten.- Die Video-Aufnahme durch Drücken der Stop-Taste in der Mitte des Bildschirms Unterkante in die Aufnahme-Programm zu stoppen. Presse "Datei | Speichern unter"um das Video zu speichern.
6. Video Tracking und Analyse von Daten
- Verwenden Sie die FlySteps tracking-Software (Video 2) um die Videos zu verfolgen.
- Öffnen Sie die "configuration_file.ini" innerhalb des Ordners "FlyTracker".
- Legen Sie den Speicherort der Videos in "Video_folder" und die Namen der Videos in "Video_files".
- Geben Sie die Grenzen der fliegen Arena in "Arena_settings", basierend auf (X, y) Pixelkoordinaten von mehreren Punkten am Rand der Arena.
- Geben Sie den Speicherort der indikativ rote LEDs in "Led_settings", basierend auf (X, y) Pixelkoordinaten der Position des Centers der LEDs.
- Überprüfen Sie den Speicherort der Grenzen der Arena fliegen durch die Festlegung "debug" auf "True" in "Arena_settings", "Speichern" klicken, und das Skript im Terminal ausführen. Ein Screenshot des Videos erscheint mit einem blauen Quadrat gebildet von den Koordinaten im "Arena_settings" eingegeben.
Hinweis: Dieser Platz umgibt den Bereich verfolgt werden. - In "Arena_settings" auf "False" ändern Sie "debug", klicken Sie auf "Speichern", und führen Sie den Bildschirm einmal mehr im Terminal.
Hinweis: Dadurch wird den Tracking-Prozess gestartet.
Hinweis: Fliegen können aus dem Tracking-Bereich auf der beheizten Alu-Ring gehen. Dies geschieht während der ersten Sekunden eines Experiments, nach dem Fliegen nicht mehr berühren den beheizten Ring und bleiben in das Fährtengelände.
Hinweis: Videos können mit anderen Tracking-Software nach der Experimentator Vorlieben nachverfolgt werden.
- Verwendung der (X, y) Lage des jede Fliege von der Tracking-Software zu berechnen, das Maß an Interesse für die Temperatur-Leistung zur Verfügung gestellt. Benutzerdefinierte Skripts (zB., FlyStepsAnalysis in ergänzende) verwendet werden.
- Vergleichen Sie Leistung Temperaturkurven verschiedener fliegen Gruppen mit wiederholten Messungen (RM) Varianzanalyse (ANOVA) und Post-hoc- multiple Vergleiche mit Statistiksoftware (siehe Tabelle der Materialien).
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Representative Results
Die temperaturgesteuerten Arena (Abbildung 1A) besteht aus drei Kupfer Fliesen, deren Temperatur durch eine programmierbare Schaltung individuell gesteuert werden kann. Jede Kachel Kupfer besitzt einen Temperatursensor, der Feedback an die programmierbare Schaltung gibt. Die Schaltung aktiviert eine Stromquelle, um die Temperatur jeder Fliese zu erhöhen. Passive thermoelektrische Elemente fungieren als Konstante Heizelemente, die gewünschte Temperatur beizubehalten, während ein Kühlkörper gekühlt von einem Fan Konstante Kühlung sorgt. Das Ausmaß der Temperaturänderung bestimmt die Geschwindigkeit des Prozesses in eine nicht-lineare Weise. Eine Erhöhung von 2 ° C erfordert nur 0,1 s und einer Steigerung von 18 ° C erfordert 4 s. Ein Bildschirm angeschlossen an die programmierbare Schaltung (Abbildung 1) informiert den Benutzer über die Temperatur gemessen, die Temperatur-Sensoren in jedem der Fliesen. Die Kupfer Fliesen sind umgeben von einer Alu-Ring ständig durch Halbleiter an der Peripherie auf 50 ° C (Abbildung 1 b und 1 C) erhitzt. Dieser Ring bildet die Kanten der fliegen Arena (Abbildung 1), das Gebiet, in dem Fliegen platziert werden. Der fliegen-Arena fällt unter eine silikonisierte Glasabdeckung (Abb. 1A und 1 C), die einen 3 mm hohen Raum die sicherstellt bietet, dass fliegen gehen können aber nicht fliegen. Neben der Arena fliegen sind zwei rote LEDs (Abbildung 1), die programmiert werden können, um verschiedenen experimentellen Phasen zu markieren. Zum Beispiel für die Ergebnisse in Abbildung 2A, jede LED ist verbunden mit einer anderen Temperatur, während in Abb. 2 b, jede LED zeigt 60 s. Die FlySteps -Software kann registrieren, wenn jede der indikativ LEDs eingeschaltet ist, und der Forscher dann anhand dieser Informationen kann die experimentellen Phasen anhand der Temperatur oder Zeit automatisch zu bestimmen.
Die temperaturgesteuerten Arena kann verwendet werden, die Verhaltensreaktion fliegen aus verschiedene genetische Hintergründe auf dynamische Temperaturänderungen zu vergleichen. Zum Beispiel können fliegen aus verschiedenen Arten ausgesetzt werden allmählich steigenden Temperaturen (Abbildung 3) thermische Leistung verglichen. Die Geschwindigkeit aller Arten mit zunehmender Temperatur steigt bis auf einen Punkt der Höchstleistung, woraufhin es zerfallen und umgekommen sind. Jede Art hat jedoch eine bestimmte Antwort-Kurve mit spezifische maximale Reaktion Geschwindigkeiten und thermischen Toleranzen. Frühere Berichte haben gezeigt, die Drosophila verschiedener Arten unterscheiden unter Entwicklungsstörungen Timing, Langlebigkeit, Fruchtbarkeit, Körpermaße, sexuelle Kommunikation und Temperatur Toleranz3,6,7 ,8,22. So, unsere Beschreibung der artspezifischen Fortbewegung in einem Temperaturgradienten verleiht dieser Werkgruppe.
Die temperaturgeführte Arena kann auch verwendet werden, um die Reaktion auf Konditionierung Experimente basierend auf Temperatur zu erkunden. Die einfachste Form dieses Ansatzes ist eine operanten Konditionierung Paradigma, in der fliegen ausgebildet sind zu bevorzugen, dass eine Seite der Arena über die andere, durch Erwärmen Sie die Seite, die23,24,25vermieden. Wir ausgesetzt einzelne fliegen auf 40 ° C in der Mitte und eine der Kacheln Seite, wobei die andere Seite Fliese bei angenehmen 22 ° C (Abbildung 4). Wildtyp fliegen schnell aufgehört sich zu bewegen entlang der Arena und blieb in der komfortablen Lage. Im Gegensatz dazu die klassischen Memory-Mutante Dunce gehalten die Arena erkunden und weniger Zeitaufwand als Kontrollen in der komfortablen Lage. Die Unterschiede zwischen der Leistung der Wildtyp fliegen und Dunce Mutanten wurde größer, wenn alle Spielsteine auf 22 ° C eingestellt wurden und zwischen den Behandlungsgruppen Vergleiche wurden. Dunce Mutanten zeigte auch größere Unterschiede zwischen Training und Testphasen im Vergleich zu Wildtyp fliegen (Abbildung 4). Diese Ergebnisse zeigen eine Wirkung des Speichers auf Verbleib in der komfortablen Lage.
Kombinationen von Temperatur und Standort sind auch nützlich, um die Funktion der unterschiedlichen Temperatur-Rezeptoren bei dynamischen Temperaturänderungen zu verstehen. Wir individuelle D. Melanogaster Gr28b.d und TrpA1GAL4 Mutanten auf steigende Temperaturen ausgesetzt (2 ° C erhöhen alle 60 s) und bietet eine komfortable Lage bei 22 ° C (Abbildung 5). Die komfortable Lage verschob sich von links nach rechts und umgekehrt, pro Iteration. Ergebnisse zeigen, dass die Peripherie Temperatur Rezeptor Gr28b.d Mutanten als das Steuerelement zu Verhalten, wie sie mehr Zeit in die komfortable Lage bei steigender Temperatur verbringen. Jedoch Gehirn Temperatur Rezeptor TrpA1GAL4 Mutanten sind nicht betroffen durch steigende Temperaturen und ändern Sie ihre Speicherorte in der Arena nicht. Die zu- und Abnahme in der Kurve der TrpA1GAL4 Mutanten zeigen den Effekt in fliegen, die bereits in der komfortablen Lage saßen, bevor es komfortabel und blieb es in dieser Phase wurde. Die Konsistenz der Gipfel und Täler der Kurve für TrpA1GAL4 legen nahe, dass diese fliegen nach wie vor für die meisten des Experiments blieb; Daher wurden sie ständig gezählt, wenn ihre Lage als komfortabel war. Diese Schlussfolgerung wurde durch Sichtprüfung der aufgezeichneten Videos bestätigt. Diese Ergebnisse unterstützen frühere physiologische Berichte, was darauf hindeutet, dass Peripherie Wahrnehmung von schnellen und großen Veränderungen hängt nicht am Gr28b.d17 und fliegt besitzen eine zentrale Hauptmechanismus Sinn Temperatur basierend auf TrpA1 14,21.
Abbildung 1: Darstellung der Temperatur gesteuert-Arena. (A) einen seitlichen Blick auf die temperaturgeführte Arena. Eine programmierbare Schaltung verbindet eine Power Supply und Temperatursensoren mit Heizelementen unter Kupfer Fliesen um die Temperatur zu kontrollieren. Fliesen werden ständig durch einen Kühlkörper verbunden mit einem Lüfter gekühlt. Ein beheizte Alu-Ring über dem ruht eine Glasabdeckung umgibt die Fliesen. (B) Wärmebildkamera zeigt die Fliesen auf 24 ° C (oben) und die Seite Fliesen bei 24 ° C mit einer mittleren Kachel bei 30 ° C (unten). (C) eine Draufsicht der Arena. Eine Kamera zeichnet die Kupfer Fliesen, Alu-Ring und roten LEDs dann experimentelle Phasen automatisch ermittelt. Ein Bildschirm in der Ecke des Feldes, nicht durch die Kamera notiert zeigt die aktuelle Temperatur der Fliese. (D) Ring aus Licht: zwei warme weiße LED-Streifen in einer Holzkiste in weißes Papier bedeckt gewährleisten konstant und symmetrischen Ausleuchtung der gesamten Arena. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: fliegen müssen vor Beginn der Temperatur-Protokoll zur Arena akklimatisieren. (A) einzelne männliche fliegen wurden eingeführt, um die Arena und erkunden konstant 16 ° c für 1 min, danach begann die Temperatur erhöhen durfte. (B) einzelne fliegen 16 ° C, 20 ° C und 24 ° C ausgesetzt (keine gruppenunterschiede, zwei-Wege-ANOVA F (2.570) = 4.156, p = 0.162) haben eine höhere Fortbewegung zu Beginn des Experiments als nach 5 min (zwei-Wege-RM ANOVA F (9.570) = 7.803, p < 0,0001). Daten sind Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (± SEM) 20 Jungfrau weibliche fliegen 5 bis 7 Tage alt über mehrere Tage getestet. Sternchen gibt signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (*** p < 0,0001; Tukey's multiple Vergleichstest, p = 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Fortbewegung 5 Drosophila -Arten, die allmählich steigende Temperaturen ausgesetzt. Einzelne Männchen fliegt von gemäßigten (blau), tropisch (rot) und kosmopolitische (braune) Drosophila -Arten waren eine zunehmende Temperaturgradienten ausgesetzt (2 ° C alle 60 s) zwischen 16 und 46 ° C. Die erste 7 min waren ständig bei 22 ° C zu fliegen um die Arena zu erkunden. Arten unterschieden sich signifikant (zwei-Wege-RM ANOVA F(4,70) = 28,46, p < 0,001). (a) D. Melanogaster (braun; gefüllte Kreise) war schneller als in der Arena eingeführt. (b) D. Yakuba (rot; leeren Quadrate) war schneller als Temperatur erhöht. (c) D. Suzukii (braun; gefüllten Quadrat) war langsamer als die anderen kosmopolitischen fliegen irgendwann seine maximale Leistung. (d) D. Simulans (braun, leeren Kreise) wurde in Schutt und Asche an der höchste Stelle des D. Melanogaster. Jeder Punkt entspricht den Mittelwert (± SEM) von 15 männlichen fliegen 5 bis 7 Tage alt über mehrere Tage getestet. Bedeutung durch Symbole angezeigt (♦ = Differenz aus allen p < 0,0001; † = Differenz von allen außer D. Melanogaster, p < 0,0001; • = Differenz aus D. Melanogaster, p < 0,01; ¢ = Differenz aus D. Melanogaster, p < 0.001; Unterschied zwischen benannten Gruppen, p < 0,0001 =; Tukey's multiple Vergleichstest, p = 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: die temperaturgeführte Arena eignet sich für operanten Konditionierung. D. Melanogaster Kanton-S-Stamm (Wildtyp; schwarze Grenze) und Dnc1 (Dunce; rot umrandet) Mutanten wurden ausgebildet, um eine seitliche Kachel bei 22 ° C bis 40 ° C für 4 min (Ausbildung, nicht nach Erwärmung der Mitte und gegenüber seitlichen Fliesen bevorzugen (Muster). Erinnerung an den beheizten Räumen wird dann getestet, indem alle Fliesen auf 22 ° C (Test, Raster). Fliegen waren darauf konditioniert, Fliesen auf der linken Seite in der Hälfte der Versuche, dann Fliesen auf der rechten Seite in die andere Hälfte zu bevorzugen. Der Prozentsatz der gesamten Zeit in der Kachel bei 22 ° C während des Trainings und Tests wurde gemessen, um Leistungen zu vergleichen. Gruppen unterschieden sich signifikant (One-Way ANOVA F(3,76) = 23.23, p < 0,0001), mit Dunce insgesamt schlechter als Wildtyp durchführen. Daten sind Fies (± SEM) 20 Jungfrau weibliche fliegen 5 bis 7 Tage alt über mehrere Tage getestet. Sternchen geben Bedeutung Unterschied zwischen den Gruppen (*** p > 0,0001; *** p > 0,001; ** p > 0,01; Tukey's multiple Vergleichstest, p = 0,05) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Reaktion der Temperatur Mutanten auf Temperatur erhöht, sofern eine komfortable Lage. Temperatur durch Mutation entstehende Variationen Gr28b.d (grün, Quadrate) reagieren als Steuerelemente (w1118, schwarz, Kreise) durch Erhöhung des Anteils der Zeit in der komfortablen Umgebung als Temperaturerhöhungen (zwei-Wege-RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 -Mutanten (gelb, Dreiecke) unterscheiden sich von Kontrollen (w1118, schwarz), da sie nicht die Zeit in der komfortablen Umgebung bei steigender Temperatur erhöhen (zwei-Wege-RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0,019). Daten sind Fies (± SEM) 20 männlichen fliegen 5 bis 7 Tage alt über mehrere Tage getestet. TrpA1GAL4 unterscheidet sich deutlich von der Gr28b.d und der Kontrolle (p < 0,05; Tukey's multiple Vergleichstest, p = 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier haben wir eine automatische Temperaturkontrolle Arena (Abbildung 1) präsentiert, die präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert. Diese Methode ermöglicht die Belichtung der einzelnen Drosophila nicht nur vorprogrammierte schrittweise Erhöhung der Temperatur (Abbildung 2 und Abbildung 3), sondern auch dynamische Temperatur Herausforderungen in dem jede Kachel der Fliege Arena erhitzt wurde unabhängig voneinander auf eine andere Temperatur (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Die temperaturgesteuerten Arena nutzt ein innovatives Konzept für den Aufheizvorgang. Statt Temperaturschwankungen in den Fliesen durch thermoelektrische Peltier Heizelemente in traditionellen Methoden verwendet, die temperaturgeführte Arena verwendet aktuelle zum Aufwärmen einer Kupfer Mass mit Kupfer Fliesen und fliegen sind an der Spitze platziert. Die Kupfer Masse wird ständig durch einen Kühlkörper Block verbunden mit einem Lüfter gekühlt. Peltier-Elemente werden verwendet, um die gewünschte Temperatur der Kupfer Masse zu erhalten, sobald es aufgewärmt. Da diese Elemente nicht die wichtigsten Temperatur-Generatoren sind, Leiden sie weniger Stress, das verlängert ihre Lebensdauer und ermöglicht schneller Temperaturwechsel. Eine programmierbare Schaltung, die Rückmeldungen von Temperatursensoren unter jedem der Kupfer Fliese, die auch die Niederspannungs-Stromversorgung aktivieren können erhält, koordiniert die Heizung Mechanismus. Forscher können angeben, wann und wo Temperaturschwankungen auftreten und die Intensität und Richtung über solche Änderungen bestimmen. Darüber hinaus erlaubt Kopplung der Methode mit speziellen tracking-Software, wie z. B. FlySteps, Analyse aller Aspekte im Zusammenhang mit Drosophila Bewegung, wie zum Beispiel die allgemeine Geschwindigkeit bei bestimmten Temperaturen und Zeitaufwand in bestimmten Orten ( Abbildung 2, Abbildung 3, Bild 4, Bild 5). Dennoch müssen alle Ergebnisse betrachte Eigenschaften inhärenten Verhalten zu fliegen, die ihre Fortbewegung auswirken könnten. Zum Beispiel, wenn fliegen nicht gestattet sind, entdecken die Arena und Regeln, bevor die Änderung der Temperatur, Geschwindigkeitsmessungen möglicherweise künstlich hoch (Abbildung 2). Fliegen lassen Geruchsstoffe, die spätere fliegen zu beeinflussen; daher die Glasabdeckung gereinigt werden, und Band für die Fliesen muss zwischen Subjekten geändert werden. Da die Fortbewegung sinkt, wenn alter26fliegt, ist es wichtig, dass fliegen für Alter, Unterschiede in den Ergebnissen zu vermeiden standardisiert sind. In unserer Arena haben fliegen auch Centrophobism, lieber Kanten über den mittleren Bereich gezeigt. Experimentatoren müssen dafür Steuern, durch Ändern des Speicherorts für behagliche Bereiche überschätzen Website Präferenz zu verhindern.
Die aktuellen Eigenschaften der Arena und Anforderungen des Tracking-Prozesses könnte einige experimentelle Verfahren einschränken. Z. B. beinhaltet der Nähe Umgebung der Arena keine Access-Points durch die Gerüche eingeführt werden könnte, die verhindert, dass Studien, in denen dieser Reiz wichtig ist. In ähnlicher Weise erfordert FlyStepts Tracker Videos mit einem einheitlichen Hintergrund, welche Grenzen die Möglichkeit, die Fliege Umgebung essen oder andere Elemente hinzufügen. Die Arena an eine Verbindung zu einem Gasventil gehören angepasst werden konnte, und Software-Entwicklungen gibt, die für mehrere Objekte vorhanden sein können. Zukünftige Projekte können diese Möglichkeiten, die temperaturgeführte Arena auf experimentelle Bedürfnisse anzupassen nutzen.
Zu guter Letzt haben wir in den Ergebnissen angezeigt, die verschiedene Arten von Drosophila anders durchführen, da mit Temperatur (Abbildung 3 steigender) und die Temperatur Mutanten reagieren nicht auf gleiche Weise wie Steuerelemente (Abbildung 5). Dies zeigt, dass diese neue Methode kann verwendet werden, um zu erkunden der Drosophila thermisches Verhalten und wie es durch natürliche Selektion und funktionellen Eigenschaften beeinflusst wird. Schließlich zeigt es, dass unsere Methode weiter, Verständnis für thermische Anpassung helfen kann und Speziation sowie die Interaktionen von Temperatur-Rezeptoren mit anderen Stimuli in Zukunft studiert.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Stipendium von der Behavioural and Cognitive Neuroscience-Programm von der Universität Groningen und Diplom als Stipendiat der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) aus Mexiko, gewährt, Andrea unterstützt Soto-Padilla, und einen Zuschuss von der John Templeton Foundation für das Studium der Zeit an Hedderik van Rijn und Jean-Christophe Billeter vergeben. Wir sind auch dankbar, Peter Gerrit Bosma für seine Beteiligung an der Entwicklung des FlySteps -Trackers.
Scripts, TemperaturePhases, FlySteps, und FlyStepAnalysis können als ergänzende Information und in den folgenden temporären und öffentlich zugänglichen Link gefunden:
https://Dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
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