Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58350
Automatic Translation
1,2, 3, 4, *4, *1
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.

Abstract

הטמפרטורה היא גורם סביבתי בכל מקום זה משפיע על איך מינים להפיץ ולהתנהג. מינים שונים של זבובי דרוזופילה פירות יש תגובות ספציפיות לשינוי הטמפרטורות בהתאם הסתגלות סובלנות הפיזיולוגית שלהם. זבובים דרוזופילה בעלי גם חום חישה מערכת הפך בסיסי להבנת הבסיס העצבי של טמפרטורת עיבוד ב- ectotherms. אנו מציגים כאן ארנה מבוקרי טמפרטורה המאפשרת שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה עם שליטה הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי כדי לחקור את התגובה של זבובים בודדים את שינוי הטמפרטורה. זבובים בודדים להציב בזירה, נחשפים אתגרים טמפרטורה מתוכנתים מראש, כגון הדרגתי אחיד מגביר טמפרטורה כדי לקבוע נורמות התגובה או טמפרטורות המפוזרים במרחב בו זמנית כדי לקבוע העדפות. אנשים מתבצע באופן אוטומטי, המאפשר כימות של העדפה מהירות או מיקום. בשיטה זו ניתן לכמת במהירות התגובה על מגוון רחב של טמפרטורות כדי לקבוע טמפרטורה ביצועים עקומות דרוזופילה או חרקים אחרים באותו סדר גודל. בנוסף, זה יכול לשמש עבור מחקרים גנטיים לכמת טמפרטורה העדפות ותגובות של מוטציות או פראי-סוג זבובים. שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את הבסיס של היווצרות המינים תרמי, הסתגלות, כמו גם המנגנונים העצביים העומדים מאחורי בטמפרטורה.

Introduction

טמפרטורה היא גורם סביבתי מתמיד זה משפיע על איך אורגניזמים לפעול ולהתנהג1. הבדלי גובה ורוחב להוביל הבדלים בסוג באקלים האורגניזם נחשפים, שתוצאתה בחירה אבולוציונית לתגובתם טמפרטורה2,3. האורגניזמים להגיב טמפרטורות שונות דרך עיבודים מורפולוגי, פיזיולוגיים והתנהגותיים זה למקסם ביצועים תחת שלהם מסוים סביבות4. לדוגמה, זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, אוכלוסיות מאזורים שונים יש העדפות טמפרטורה שונות, הגוף גדלים, פעמים התפתחותית, אריכות-חיים, פוריות וביצועים הליכה בטמפרטורות שונות2 ,5,6,7. המגוון שנצפה בין הזבובים ממוצא שונה מוסבר בחלקו על ידי וריאציה גנטית גן פלסטיק הביטוי8,9. באופן דומה, מינים דרוזופילה מאזורים שונים להפיץ באופן שונה בין מעברי צבע טמפרטורה ולהראות הבדלים ההתנגדות החום הקיצוני, בדיקות קר10,11,12.

דרוזופילה הפך גם לאחרונה מודל הבחירה כדי להבין את הבסיס הגנטי והעצבים של טמפרטורה תפיסה13,14,15,16,17. באופן כללי, הזבוב הבוגר תופסים טמפרטורה באמצעות חיישני טמפרטורה היקפיים קרים וחמים, מחושיהם ודרך חיישני טמפרטורה15,16 14,13,המוח , 17 , 18 , 19 , 20. קולטני הפריפריה לטמפרטורות חם אקספרס Gr28b.d16 או Pyrexia21, תוך הפריפריה מאופיינים קולטנים קר Brivido14. במוח, טמפרטורה מעובד על ידי נוירונים לבטא TrpA115. מחקרים התנהגותיים על מוטציות של המסלולים הללו משתפרים הבנתנו כיצד מעובד בטמפרטורה ולתת תובנות מנגנונים משתנים בין אוכלוסיות של דרוזופילה ממחוזות שונים.

כאן נתאר ארנה מבוקרי טמפרטורה שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה. חוקרים יכולים מראש תכנית שינויים אלה, אשר מאפשר מניפולציות טמפרטורה סטנדרטית ו הדיר ללא התערבות אנושית. זבובים הם הקליטו, במעקב עם תוכנות מיוחדות כדי לקבוע את המיקום שלהם ואת המהירות בכל השלבים השונים של ניסוי. המדד העיקרי הוצג פרוטוקול זה הוא מהירות הליכה בטמפרטורות שונות, כי הוא אינדקס רלוונטי מבחינה אקולוגית בביצועים פיזיולוגיים ניתן לזהות הסתגלות תרמיות בודדות5. יחד עם טמפרטורה קולטן מוטציות, טכניקה זו יכולה לסייע לחשוף את המנגנונים של עיבוד תרמי ברמה התאית וביוכימי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת אוכל לטוס בינוני

  1. שופכים 1 ליטר של מי ברז לתוך גביע זכוכית 2 ל', להוסיף פס מגנטי מערבבים. לשים את הספל על פלטה מגנטית ב 300 ° C עד רותחים בטמפרטורה.
  2. מערבבים-כדורים לדקה 500 ולהוסיף את הפעולות הבאות: 10 גרם של אגר 30 גר' גלוקוז, 15 גר' סוכרוז, 15 גר' קמח תירס, 10 גרם של נבט חיטה, 10 גרם קמח סויה, 30 גר' מולסה, 35 גרם שמרים יבשים פעילים.
  3. כאשר מערבבים קצף נמרצות, להנמיך את הטמפרטורה פלטה עד 120 ° C תוך כדי ערבוב.
  4. להפעיל את הטמפרטורה פלטה נוספת עד 30 מעלות צלזיוס לאחר 10 דקות ולהמשיך לערבב עד המיקס מתקררת כדי 48 º C. למדוד את הטמפרטורה על-ידי הוספת מד חום ישירות לתוך האוכל בלי לגעת בקירות של הספל.
  5. לפזר 2 גר' p-הידרוקסי-בנזואית חומצה מתיל אסטר לתוך 10 מ"ל אתנול 96%, להוסיף את התערובת יחד עם 5 מ ל חומצה propionic 1 מ'. המשך ערבוב למשך 3 דקות.
  6. כבה את הכיריים ויוצקים 45 מ ל מזון לתוך בקבוקים rearing ו 6.5 מ ל מזון לתוך הבקבוקונים אוסף.

2. הכנת זבובים

  1. מקום 20 גברים ו- 20 נקבה זבובים לבקבוקים rearing המכיל 45 מ של אוכל לטוס בינוני. העברת הזבובים בקבוקים חדשים לאחר 3-4 ימים על-ידי הקשה אותם למטה ולאחר מכן הקשה על אותם לתוך הבקבוקים טריים. למחוק את הזבובים לאחר שלושה שינויים.
    1. מקם את הבקבוקים בתוך החממה תחת 12-h אור/12-h מחזורים כהה עם טמפרטורת חום קבועה של 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: דור חדש של זבובים יהיה eclose לאחר עשרה ימים.
  2. עזים ומתנגד לאחרונה eclosed זבובים על רפידות פחמן דו-חמצני לכל היותר 4 דקות ולאסוף אותם 2.5 x 9.5 ס מ לטוס לגידול צלוחיות עם 6.5 מ של מדיום מזון לעוף באמצעות מברשת.
    1. לאסוף זבובים בתולה רק ולהפריד ביניהם על ידי קבוצות של זבובים 20 לכל גידול המבחנה.
    2. מקם את הבקבוקונים בתוך אינקובטורים במשך 5-7 ימים, שינוי הזבובים בקבוקונים חדשים כל 2-3 ימים, בימים לפני הניסויים.

3. מסגרת של אורות

  1. ליצור מסגרת עץ של 10 ס מ אורך, רוחב 4 ס"מ, 4 ס מ גובה 0.5 ס מ עבה.
  2. על כל אחד הקצוות קצר, ליצור גבול של 4 ס מ אורך 4 ס מ גובה, רוחב 1.5 ס מ לכיוון הבתוך שטח של מסגרת העץ. השאר הפנים הפנימי של הגבול פתוח.
  3. תרגיל שני חורים של 0.5 ס מ קוטר בנקודת החיתוך של אחד הקצוות ארוך של מסגרת העץ ועל כל הגבולות בקצוות קצר.
  4. מקום 10 ס מ של רצועה LED לבנה חמה בתוך כל אחד הגבולות על הקצוות קצר. לקלף האחורי של רצועת LED להדביק אותו מיד במקום.
    הערה: עבור ניסויים ב שעליה תאורה צריכים להיות מסולקים, רצועת LED לבן חם הרבה מכדי LED אינפרא-אדום רצועות.
  5. להתחבר קצה אחד של רצועת LED באחד הגבולות את אספקת החשמל מיתוג, סופו אחרים לרצועת LED על הגבול ההפוך.
  6. הפעל את אספקת החשמל מיתוג כדי לוודא כי שתי רצועות LED להפעיל.
  7. לכסות את הצד הפתוח של כל גבול עם פיסת נייר לבן.
  8. דבק עוד פיסת נייר על כל אחד מהשלבים פנימי של קצוות ארוכים.

4. טמפרטורה מבוקרת ארנה

  1. הפעל את הזירה מבוקרי טמפרטורה (איור 1A וג 1). ודא המאוורר מתחיל לרוץ הטבעת אלומיניום מתחיל מתחמם.
  2. להשתמש בכבל USB להתחבר הזירה טמפרטורה מבוקרת מחשב בקרת להריץ את הסקריפט TemperaturePhases עם הרצפים טמפרטורה.
  3. פתח את התסריט TemperaturePhases שליטה במחשב וודא כי הרצף טמפרטורה מוגדרת כראוי (Video 1).
    1. בדוק כי משך הזמן של כל שלב נסיוני מוגדר כ- 60 s על-ידי אימות "הגומה. StimulusDur"שווה ל- 60 s.
    2. בדוק כי 1) המספר השווה רצוי מספר שלבים, 2) איטרטיבי ON/OFF ההקמה של מעיד על אדום דיודות מפיצות אור (נוריות), 3) 2 ° C בטמפרטורה לכל שלב, 4) 16 ° C כמו הטמפרטורה המוצא שכולכם צודקים תחת "התחל את ניסיוני מדור "אבן.
      הערה: לאפשר את הזבובים להסתגלות לזירה לטוס במשך 7 דקות ב 16 ° C כדי למנוע גידול מלאכותיים של מהירות במהלך שלבי הניסוי הראשון (איור 2).
    3. להריץ את הסקריפט TemperaturePhases . התוכנה לאתחל במשך 5 שניות כפי שנקבע "בזירה. המתן", אז תפסיק.
    4. הקש על מקש הרווח של לוח המקשים כדי להתחיל הפעלת את שלבי הניסוי פעם זבוב פוצץ אל תוך הזירה לעוף (שלב 5.3).
      הערה: TemperaturePhases הוא script הנוכחי שליטה התיבה; עם זאת, ניתן ליצור סקריפטים מותאמים אישית אחרים לשימוש בהתקן זה להתאים לדרישות של ניסויים שונים.
  4. חבר את המצלמה על הזירה הקלטה למחשב באמצעות כבל ה-USB של המצלמה.
  5. פתח את התוכנית הקלטת וידאו (ראה טבלה של חומרים) הקלטה במחשב על-ידי בחירה "קובץ | סרט ההקלטה החדשה". המסך מציג את התמונה מן המצלמה תיפתח.
    1. ודא כי תמונת המצלמה לוכדת כל הקצוות של הזירה, מעיד על נוריות אדומות.
    2. . תתחיל להקליט על ידי לחיצה על הכפתור האדום באמצע הקצה התחתון של המסך מציג את תמונת המצלמה ברגע המסגרת של אורות הוגדרה סביב הזירה (שלב 5.4)
      הערה: שינויים קטנים בתחום התאורה יכולים להשפיע הדיוק של המעקב. מומלץ לשמור את ההארה של הזירה מבוקרי טמפרטורה קבועה על ידי תיקון המיקום של המנגנון.

5. הטמפרטורה ניסויים התנהגותיים

  1. להכין את הזירה לעוף (איור 1C).
    1. במקום חוט לבן דבק מוליך על האריחים נחושת, הבטחת שכל הקצוות מכוסים.
    2. מניחים את הטבעת אלומיניום המחוממת סביב האריחים נחושת. הקצה של הטבעת מתאים באופן מושלם סביב האריחים נחושת אז מניחים אותה תמיד באותו מיקום.
    3. לנקות את מכסה זכוכית עם טישו נקייה ומניחים אותו על הטבעת אלומיניום, השארת רווח שדרכו זבוב יכול להיות מפוצץ ב.
      הערה: לפני הניסויים, מעיל מכסה זכוכית עם הסוכן siliconizing כדי ליצור משטח חלקלק. החל הסוכן siliconizing במשך 24 שעות ביממה, לשטוף אותו עם מים לפני השימוש.
  2. להריץ את הסקריפט TemperaturePhases (שלב 4.3.3) ופתח את התוכנית הקלטת וידאו (שלב 4.5).
  3. לפוצץ את הזבוב מ בקבוקון rearing (שלב 2.2.2) אל תוך הזירה לעוף (למשל., 1 זכר לטוס באיור3).
    1. לקחת בקבוקון של זבובים מן החממה, לחץ עליה פעמיים כדי לכפות עליהם ללכת למטה, השמנה של זבוב אחד עם העצמות הפה, לסגור את הצנצנת ואת סינרול החממה.
    2. מקם את הזבוב בזירה דרך הפרצה שננטש בין מכסה זכוכית טבעת אלומיניום (שלב 5.1.3).
    3. לסגור את הפער בין מכסה זכוכית אלומיניום טבעת על ידי דוחף את מכסה הזכוכית עד שהוא מגיע לקצה של הטבעת אלומיניום ברגע הזבוב הוא הציג לזירה לעוף.
  4. להציב את המסגרת של אורות סביב הזירה כדי להבטיח תאורה סימטרי.
    1. סמן את המיקום (למשל., שימוש בסמן קבוע) של המסגרת של אורות סביב לטוס הזירה (איור 1C) כדי להבטיח כי המסגרת ממוקמת תמיד באותו מיקום.
  5. להתחיל להקליט עם התוכנית הקלטת וידאו (שלב 4.5.2), הקש על מקש הרווח במקלדת של המחשב הבקרה כדי להתחיל הפעלת את שלבי הניסוי (שלב 4.3.4).
  6. ניסיוני אחרי כל השלבים נעשים, שמירת הוידאו בתבנית .mp4 או .avi ולהסיר הזבוב מן הזירה לטוס עם העצמות הפה.
    הערה: בסוף שלבי הניסוי יכול להיקבע על ידי שתי נוריות אדומות מעיד על להיות כבויים או ההפסקה script TemperaturePhases .
    1. לעצור את הקלטת על ידי לחיצה על הלחצן ' עצור ' באמצע הקצה התחתון של המסך בתוכנית הקלטת הוידאו. הקש "קובץ | "שמור בשם כדי לשמור את הווידאו.

6. וידאו מעקב וניתוח נתונים

  1. השתמש FlySteps (סרטון 2) תוכנת מעקב כדי לבצע מעקב אחר קטעי וידאו.
    1. פתח את "configuration_file.ini" בתוך התיקיה "FlyTracker".
    2. הגדר את המיקום של קטעי וידאו ב- "video_folder" ואת שמותיהם של קטעי וידאו ב- "video_files".
    3. לציין גבולות הזירה לטוס ב- "arena_settings" על בסיס (x, y) קואורדינטות של נקודות מרובות בקצה הזירה.
    4. ציין את המיקום של נוריות אדומות מעיד ב- "led_settings" על בסיס (x, y) קואורדינטות פיקסלים של המיקום של המרכז של הנוריות.
    5. בדוק את מיקומו של גבולות הזירה לעוף על-ידי הגדרת "באגים" 'נכונה' ב- "arena_settings", לחיצה על "שמור", להריץ את הסקריפט בתוך הטרמינל. לכידת מסך של הוידאו יופיע עם ריבוע כחול הנוצרת על-ידי הקואורדינטות שהוזנו ב- "arena_settings".
      הערה: כיכר זו מקיפה את האזור לבצע אחריהם מעקב.
    6. לשנות "באגים" ב- "arena_settings" ל- "false", לחץ על "שמור", ולהפעיל את המסך בטרמינל עוד פעם.
      הערה: אפשרות זו תפעיל את תהליך מעקב.
      הערה: זבובים יכולים ללכת אל מחוץ לאזור מעקב על גבי הטבעת אלומיניום מחוממת. זה קורה במהלך השניות הראשונות של ניסוי, אחרי אשר זבובים. תפסיק לגעת את הטבעת מחוממת ולהישאר בתוך האזור מעקב.
      הערה: ניתן לעקוב קטעי וידאו עם אחרים תוכנת מעקב לפי ההעדפות של הנסיין.
  2. שימוש (x, y) המיקום של כל זבוב שסופקו על-ידי תוכנת מעקב כדי לחשב את מידת הריבית עבור הביצועים בטמפרטורה. קבצי script מותאמים אישית (למשל., FlyStepsAnalysis ב Supplementary) יכול לשמש.
  3. להשוות את עקומות הביצועים בטמפרטורה של קבוצות שונות לעוף באמצעות מדידות חוזרות ונשנות (RM) השונות (ANOVA) ופוסט-הוק השוואות מרובות באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזירה מבוקרי טמפרטורה (איור 1 א') מורכב שלוש אבנים נחושת שהטמפרטורה שלהם יכול להיות נשלט בנפרד במעגל לתכנות. כל אריח נחושת בעל חיישן טמפרטורה שנותן משוב המעגל לתכנות. המעגל הפעלת ספק כוח כדי להגדיל את הטמפרטורה של כל אריח. אלמנטים פסיביים תרמואלקטרי לשמש החימום קבוע כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה, בעוד כיור חום מקורר על ידי אוהד מספק קירור מתמדת. ההשלכות של שינוי הטמפרטורה קובעת את מהירות התהליך באופן ליניארי. גידול של 2 ° C דורשת רק 0.1 s, וגידול של 18 ° C דורש 4 s. מסך מחובר המעגל לתכנות (איור 1C) מודיעה למשתמש של הטמפרטורה נמדדת על חיישני טמפרטורה בכל אחד האריחים. האריחים נחושת מוקפים טבעת אלומיניום כל הזמן מחומם עד 50 מעלות צלזיוס (איור 1B ו- 1 C) על ידי מוליכים למחצה ברחבי הפריפריה. טבעת זו צורות קצות לטוס ארנה (איור 1C), האזור שבו הם זבובים להציב. הזירה לטוס מכוסה על ידי זכוכית siliconized כיסוי (איור 1A וג 1), אשר מספק רווח גבוה 3 מ מ אשר מבטיח כי זבובים יכול ללכת אבל לא לעוף. ליד הזירה לטוס הן נוריות אדומות שני (איור 1C) שניתן לתכנת כדי לסמן לויזה ניסיוני. לדוגמה, לקבלת תוצאות שמוצג באיור 2A, כל LED מזוהה עם טמפרטורה שונות, בעוד דמות 2B, כל LED מציין 60 s. התוכנה FlySteps יכולים להירשם כאשר כל אחד של הנוריות מעיד הוא על החוקר ואז ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע באופן אוטומטי את שלבי ניסיוני המבוסס על טמפרטורה או זמן.

הזירה טמפרטורה מבוקרת יכול לשמש כדי להשוות את התנהגותי בתגובה של הזבובים מרקע גנטי שונה שינויי טמפרטורה דינמי. לדוגמה, ניתן לחשוף זבובים ממינים שונים להגברת בהדרגה טמפרטורות (איור 3) להשוות הבדלים ביצועים תרמיים. המהירות של כל המינים גדלה כאשר הטמפרטורה עולה עד שהוא מגיע לנקודה של ביצועים מרביים, לאחר מכן הוא התפרק, נספו. עם זאת, לכל מין יש עקומת תגובה עם מהירות תגובה המרבי ספציפית ו טולרנסים תרמי. בדו"חות קודמים הראו דרוזופילה ממינים שונים שונים בין עיתוי התפתחותית, אריכות-חיים, פוריות, מידות גוף, תקשורת מינית, טמפרטורה סובלנות3,6,7 8, ,22. לפיכך, לתיאור של גפיים תלויי מין ב הדרגתי טמפרטורת מוסיף לגוף זה של עבודה.

הזירה טמפרטורה מבוקרת יכול לשמש גם כדי לחקור בתגובה מיזוג ניסויים בהתבסס על טמפרטורה. הצורה הפשוטה ביותר של גישה זו היא פרדיגמה אופרנטית שבו זבובים מאומנים להעדיף צד אחד של הזירה מעל השני, על ידי חימום בצד זה יהיה להימנע24,23,25. אנחנו חשופים זבובים בודדים עד 40 ° צלזיוס האמצע ואחד של האריחים הצד, תוך השארת הריבוע בצד האחר-נוח 22 ° C (איור 4). זבובים פראי-סוג במהירות הפסיק לזוז לאורך הזירה ונשארו במיקום נוח. לעומת זאת, החשבונאי הקלאסי זיכרון מופלג המשיך לחקור את הזירה ושהה פחות זמן מאשר פקדים במיקום נוח. ההבדלים בין הביצועים של הזבובים פראי-סוג מופלג מוטציות המנופח כאשר כל האריחים מוגדר על 22 ° C, נערכו השוואות בין קבוצות הטיפול. ולמרות זאת המוטציות הראה גם יותר הבדלים בין שלבי ההכשרה, הבדיקה בהשוואה הזבובים פראי-סוג (איור 4). תוצאות אלו מציעים השפעה של זיכרון על נותרת במיקום נוח.

שילובים של טמפרטורה ומיקום שימושיים גם להבין את תפקוד קולטנים טמפרטורה שונות במהלך שינויי טמפרטורה דינמי. אנחנו חשופים מוטציות melanogaster ד Gr28b.d ו TrpA1GAL4 בודדים להגדלת טמפרטורות (2 ° C להגדיל כל 60 s) תוך מתן מיקום נוח ב 22 ° C (איור 5). המיקום נוח מוזז משמאל לימין, ולהיפך, בכל איטראציה. התוצאות מראות כי המוטציות Gr28b.d הפריפריה קולטן טמפרטורה מתנהג כמו הפקד, הם מקדישים יותר זמן מיקום נוח כמו הטמפרטורה עולה. עם זאת, המוח טמפרטורה קולטן TrpA1GAL4 מוטציות אינן מושפעות על ידי הגדלת טמפרטורות, אינם משנים את מיקומם בזירה. בעליות של ירידה בעקומת של מוטציות TrpA1GAL4 מראים את האפקט זבובים היו כבר יושב במיקום נוח לפני שזה הפך נוח, נשארו שם בשלב הזה. מרקם של פסגות ועמקים של העקומה של TrpA1GAL4 מציע כי זבובים אלה נותר עדיין עבור רוב הניסוי; לפיכך, הם כל הזמן נספרו כאשר המיקום שלהם היה נחשב נוח. מסקנה זו אושרה על ידי בדיקה חזותית של קטעי וידאו מוקלט. תמיכה אלה תוצאות קודמות דוחות פיזיולוגיים רומז כי הפריפריה תפיסת שינויים גדולים ומהירה אינה תלויה Gr28b.d17 , זבובים בעלי מנגנון מרכזי הראשי לטמפרטורת הגיוני מבוסס על TrpA1 14,21.

Figure 1
איור 1: תרשים של טמפרטורה מבוקרת-ארנה. (א) תצוגה לרוחב של הזירה טמפרטורה מבוקרת. מעגל לתכנות מתחבר כוח חיישני טמפרטורה ואספקה ספירלות תחת אריחי נחושת כדי לשלוט הטמפרטורה שלהם. אריחים מצוננים כל הזמן דרך מפזר החום מחובר מעריץ. טבעת אלומיניום מחוממות שעליהם מונח כיסוי זכוכית המקיף את האריחים. (ב) תרמית הדמיה מציג את האריחים להגדיר 24 ° C (למעלה), אריחי צד ב 24 ° C עם אריח האמצעי ב- 30 מעלות צלזיוס (למטה). (ג) מבט מלמעלה על הזירה. המצלמה מתעדת את האריחים נחושת, אלומיניום טבעת ונוריות אדום ולאחר מכן קובע באופן אוטומטי את שלבי הניסוי. מסך בפינה של התיבה, לא הוקלט על ידי המצלמה, מציג את הטמפרטורה אריח הנוכחית. (ד) טבעת של אור: שני חמים LED אזיקונים בתוך תיבת עץ מכוסה נייר לבן להבטיח תאורה קבועה, סימטרי של הזירה כל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זבובים חייב להתאקלם לזירה לפני שמתחילים את פרוטוקול טמפרטורה. (א) יחיד זבובים זכרים היו הכיר את הזירה ולא לחקור ב- C ° 16 קבוע 1 דקות, אחרי אשר החלו הטמפרטורה הגדלת. (ב) יחיד זבובים חשופים 16 ° C, 20 ° C או 24 ° C (אין הבדלים קבוצה; ANOVA דו-כיווני F (2,570) = 4.156, p = 0.162) יש גפיים גבוה יותר בתחילת הניסוי יותר לאחר 5 דקות (RM דו-כיווני ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0.0001). הנתונים הם אומר שגיאת התקן של הממוצע (± SEM) של 20 בתול נקבות הזבוב בן 5 עד 7 ימים נבדק על פני ימים מרובים. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי בין קבוצות (* * * p < 0.0001; Tukey של מבחן השוואה מרובים, p = 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: גפיים של 5 מינים דרוזופילה נחשפים הולך וגדל בהדרגה טמפרטורות. זכר בודדים טסה ממוזג (כחול), טרופי (אדום), נחשפו מינים דרוזופילה (חום) הקוסמופוליטית שינוי טמפרטורה הגוברת (2 ° C כל 60 s) בין 16 ל- 46 מעלות C. 7 דקות הראשונות היו כל הזמן 22 ° C כדי לאפשר זבובים לחקור את הזירה. מינים היו שונים באופן משמעותי (דו-כיווני RM ANOVA F(4,70) = 28.46, p < 0.001). (א) ד melanogaster (חום; מלא עיגולים) היה מהר יותר כאשר הציג את הזירה. (b) ד yakuba (red; ריבועים ריקים) היה מהיר כמו טמפרטורה מוגברת. (ג) ד suzukii (חום מרובע מלא) היה איטי יותר מאשר שאר הזבובים הקוסמופוליטית בנקודה ביצועים מרביים. (ד) simulans ד (חום; עיגולים ריקים) הייתה דעיכה בנקודת המקסימום של melanogaster ד. כל נקודה מייצגת הממוצע (± SEM) של זבובים זכרים 15 5-7 ימים הישן נבדק במשך מספר ימים. משמעות שצוין על-ידי סמלים (♦ = ההבדל מכל, p < 0.0001; † = ההבדל מכל פרט ד melanogaster, p < 0.0001; • = הפרש מ ד melanogaster, p < 0.01; ¢ = הפרש מ ד melanogaster, p < 0.001; = ההפרש בין קבוצות בשם, p < 0.0001; Tukey של מבחן השוואה מרובים, p = 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הזירה טמפרטורה מבוקרת יכול לשמש אופרנטית. זן קנטון-S ד melanogaster (פראי-סוג; שחור הגבול) מוטציות1 (מופלג; בגבול אדום) לדמוקרטיםהיו מיומנים להעדיף אריח לרוחב ב 22 ° C לאחר התחממות כדור הארץ האמצע ומול אריחים לרוחב עד 40 ° צלזיוס למשך 4 דקות (אימונים, לא תבנית). זיכרון של האזורים מחוממת נבדק לאחר מכן על-ידי הגדרת כל האריחים 22 ° C (מבחן; דפוס רשת). זבובים היו ממוזגים להעדיף אריחים משמאל במחצית של הניסויים, ואז אריחים מימין לחצי השני. אחוז הזמן הכולל בתוך המשבצת ב 22 מעלות צלזיוס במהלך האימונים ובדיקות נמדדה להשוות הופעות. הקבוצות היו שונים באופן משמעותי (חד-כיווני אנובה F(3,76) = 23.23, p < 0.0001), עם ולמרות זאת ביצוע גרוע יותר פראי-סוג בסך הכל. הנתונים הם ממוצע (± SEM) של 20 בתול נקבות הזבוב 5-7 ימים הישן נבדק במשך מספר ימים. הכוכביות מציינות משמעות ההבדל בין קבוצות (* * * p > 0.0001; * * * p > 0.001; * * p > 0.01; Tukey של מבחן השוואה מרובים, p = 0.05) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תגובה של מוטציות הטמפרטורה ל טמפרטורה עולה כאשר במיקום נוח מסופק. טמפרטורה מוטציות Gr28b.d (green; ריבועים) להגיב כפי שולטת (w1118, שחור; עיגולים) על ידי הגדלת אחוז הזמן באזור נוח כמו הטמפרטורה עולה (RM דו-כיווני ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). מוטציות TrpA1GAL4 (צהוב; משולשים) הם שונים פקדים (w1118, שחור), כפי שהם לא להגדיל את הזמן באזור נוח כמו הטמפרטורה עולה (RM דו-כיווני ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0.019). הנתונים הם ממוצע (± SEM) של זבובים זכרים 20 5-7 ימים הישן נבדק במשך מספר ימים. TrpA1GAL4 שונה באופן מהותי Gr28b.d ואת הפקד (0.05 < p; Tukey של מבחן השוואה מרובים, p = 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן הובאו אוטומטיים מבוקרי טמפרטורה זירה (איור 1) שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת בזמן ובמרחב. שיטה זו מאפשרת חשיפה של הפרט דרוזופילה מחיישנים מגביר הדרגתית של הטמפרטורה (איור 2 , איור 3) אלא גם לאתגרים טמפרטורה דינמי שבו כל אריח של הזירה זבוב היה מחומם באופן עצמאי לטמפרטורה שונים (איור 4 , איור 5).

הזירה מבוקרי טמפרטורה משתמשת בגישה חדשנית תהליך חימום. במקום הפקת שינויי טמפרטורה של האריחים באמצעות תרמואלקטרי החימום Peltier השתמשו בשיטות מסורתיות, הזירה מבוקרי טמפרטורה משתמש הנוכחי כדי לחמם את גוש הנחושת עם האריחים נחושת, זבובים ממוקמים בחלק העליון. המסה נחושת ללא הרף מקורר על ידי גוש מפזר החום מחובר מעריץ. רכיבים דמויי peltier משמשים כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה של מסה נחושת ברגע זה כבר מתחממת. כי רכיבים אלה אינם הגנרטורים טמפרטורה הראשי, הם סובלים פחות מתח, אשר מרחיב את תוחלת החיים שלהם, מתיר שינויי טמפרטורה מהירים יותר. מעגל לתכנות המקבלת היזון חוזר מן חיישני טמפרטורה תחת כל אחד האריח נחושת, אשר יכול גם להפעיל את אספקת חשמל מתח נמוך, מרכזת את מנגנון חימום. חוקרים באפשרותך לציין מתי ואיפה שינויי טמפרטורה להתרחש, לקבוע את העוצמה ואת הכיוון של שינויים כאלה. יתר על כן, צימוד השיטה עם מיוחדים מעקב תוכנה, כגון FlySteps, מאפשרת ניתוח של כל ההיבטים הקשורים לתנועה של דרוזופילה , כגון המהירות הכללית-טמפרטורות או הזמן בילה מסוימים (מיקומים מסוימים איור 2, איור 3, איור 4, איור 5). למרות זאת, כל התוצאות עליך לקחת בחשבון מאפיינים הגלום לטוס התנהגות העלולות להשפיע על גפיים שלהם. לדוגמה, אם זבובים אינם מותרים לחקור את הזירה ולהתיישב לפני שינוי הטמפרטורה, מדידות מהירות עלול להיות מלאכותי גבוה (איור 2). זבובים יכולים גם להשאיר odorants להשפיע על זבובים הבאים; לפיכך, יש לנקות את מכסה הזכוכית, הקלטת המכסים את האריחים יש לשנות בין נושאים. בהתחשב בכך ומכניקה מסרב כזבובים בגיל26, חשוב כי זבובים מתוקננים לגיל להימנע וריאציה בתוצאות. בזירה שלנו, זבובים הראו גם centrophobism, העדפת קצוות מעל האזור האמצעי. ניסויים חייב לשלוט על זה על-ידי שינוי המיקום של אזורים נוחים כדי למנוע העדפה האתר שאת מגזימה.

מאפייני הזירה הנוכחית ואת הדרישות של תהליך מעקב יכול להגביל כמה הליכים ניסיוני. לדוגמה, הסביבה קרוב של הזירה אינו כולל נקודות גישה שדרכו יכול להיות מוצג ריחות, אשר מונע מחקרים שבהם חשוב זה גירוי. באופן דומה, הגשש FlyStepts מחייבת קטעי וידאו עם רקע אחיד, אשר מגביל את האפשרות של הוספת מזון או פריטים אחרים סביבה של הזבוב. הזירה יכול להיות מותאם כדי לכלול חיבור שסתום גז, תוכנה קיימים עשוי לאפשר יותר אובייקטים של להיות נוכח. פרוייקטים עתידיים עשויים לנצל את האפשרויות הללו כדי להתאים את הזירה מבוקרי טמפרטורה לצרכים הספציפיים ניסיוני.

בסופו של דבר, אנחנו הראו תוצאות מינים שונים של דרוזופילה לבצע בצורה שונה הטמפרטורה מגדילה (איור 3), טמפרטורה מוטציות מגיב באותה צורה כמו הפקדים (איור 5). זה מראה כי שיטה חדשה עשוי לשמש כדי לחקור התנהגות תרמי של דרוזופילה ואת ההשפעה עליו על ידי הברירה הטבעית ומאפיינים פונקציונלי. בסופו של דבר, זה ממחיש כי השיטה שלנו עשוי לסייע עוד יותר הבנה של עיבוד תרמי, היווצרות המינים, כמו גם את האינטראקציות של קולטני חום עם גירויים אחרים בעתיד מחקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מלגה Behavioural, תוכנית קוגניטיבי מדעי המוח של אוניברסיטת של חרונינגן, במלגה ללימודי תואר שני, y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT) במקסיקו, כמובן מאליו אנדריה סוטו-פאדילה, במענק מטעם קרן טמפלטון ג'ון לחקר הזמן הוענק Hedderik ואן ריין, ז'אן כריסטוף Billeter. אנחנו גם אסיר תודה פיטר חריט Bosma בשל השתתפותו בפיתוח הגשש FlySteps .

ניתן למצוא קבצי script TemperaturePhases, FlySteps, ו FlyStepAnalysis כמידע משלים, הקישור הבא זמני וזמין לציבור:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arduino Due Arduino A000062 Software RUG
Electronics Board Ruijsink Dynamic Engineering FF-Main-02-2014
Power supply Boost XP-Power 48. V 65 W ECS65US48 Set to 53 Volt
Power supply Tile Heating XP-Power 15. V 80 W VFT80US15
Power supply Cooling XP-Power 15. V 130 W ECS130U515
Peltier elements Marlow Industries RC12-4 2 Elements, controlled DC feed
Heat sink Fisher Technik LA 9/150-230V Decoupled for vibration
Temperature sensors Measurement Specialties MCD_10K3MCD1 Micro Thermistor Probe
Copper block/tiles Ruijsink Dynamic Engineering FF-CB-01-2014
Auminum ring Ruijsink Dynamic Engineering FF-RoF-02-2015
Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm RS Components 111-2300  White conductive tape
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Warm white LED strip Ledstripkoning HQ-3528-SMD 60 LEDs per meter
Switch Power Supply Generic T-36-12
Logitech c920 Logitech Europe S.A PN960-001055
QuickTime Player Apple Computer Recording program
Tracking analysis software R Packages: pacman
Tracking analysis software MATLAB
Thermal Imaging FLIR T400sc
Graphs and Statisticts Software Graph Pad Prism
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML Siliconising agent
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
  2. Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
  3. Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
  4. Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
  5. Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
  6. Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
  7. Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
  8. Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
  9. Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
  10. Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
  11. Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
  13. Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
  14. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  15. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  16. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  17. Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I. Thermosensory processing in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 353-357 (2015).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
  19. Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
  20. Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
  21. Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
  22. Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
  23. Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
  24. Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
  25. Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
  26. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).

Tags

התנהגות בעיה 140 ארנה מבוקרי טמפרטורה התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה הביצועים בטמפרטורה אוטומטי חימום מנגנון מעקב לפי מיקום
שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של <em>דרוזופילה</em> בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soto-Padilla, A., Ruijsink, R.,… More

Soto-Padilla, A., Ruijsink, R., Span, M., van Rijn, H., Billeter, J. C. An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time. J. Vis. Exp. (140), e58350, doi:10.3791/58350 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter